크롬 마틴 면역 침전 -엑소뉴클레아제 (ChIP-Exo)를 사용하여 마우스 줄기 세포 유래 뉴런에서 단백질 DNA 상호 작용의 고해상도 매핑

요약

게놈 전반에 걸친 단백질 결합 위치의 정확한 결정은 유전자 조절을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 외핵증 소화(ChIP-exo)를 사용한 크로마틴-면역침전DNA를 치료하는 게놈 매핑 방법을 설명하고 있으며, 이어서 고처리량 시퀀싱을 한다. 이 방법은 포유류 뉴런에서 근거리 쌍 매핑 해상도 및 높은 신호 대 잡음 비와 단백질 DNA 상호 작용을 검출합니다.

초록

게놈에 특정 단백질-DNA 상호 작용의 식별은 유전자 조절을 이해하는 데 중요합니다. 높은 처리량 시퀀싱 (ChIP-seq)과 결합된 크로마틴 면역 침전은 DNA 결합 단백질의 게놈 전체 결합 위치를 식별하는 데 널리 사용됩니다. 그러나 ChIP-seq 방법은 초음파 처리된 DNA 단편 및 비특이적 배경 DNA의 길이에 있는 이질성에 의해 제한되어 DNA 결합 부위의 낮은 매핑 해상도 및 불확실성을 초래합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 ChIP와 엑소뉴클레아제 소화(ChIP-exo)의 조합은 5'에서 3' 엑소뉴클레아제 소화를 활용하여 단백질-DNA 교차 링크 부위에 이질적으로 크기의 면역 침전DNA를 다듬는다. 엑소뉴클레아제 치료는 또한 비특이적 배경 DNA를 제거한다. 라이브러리가 준비된 외핵증 소화 DNA는 고처리량 시퀀싱을 위해 전송될 수 있다. ChIP 엑소 방법을 사용하면 감지 감도가 높아지고 배경 신호가 감소하는 근거리 쌍 매핑 해상도가 가능합니다. 포유류 세포 및 차세대 시퀀싱을 위한 최적화된 ChIP 엑소 프로토콜은 아래에 설명되어 있다.

서론

단백질 DNA 상호 작용의 위치는 유전자 조절의 기계장치에 통찰력을 제공합니다. 높은 처리량 시퀀싱(ChIP-seq)과 결합된 크로마틴 면역 침전은 살아있는 세포^1,2에서게놈-DNA 상호 작용을 검사하기 위해 10년 동안 사용되어 왔다. 그러나 ChIP-seq 방법은 낮은 매핑 해상도, 거짓 긍정, 부재중 전화 및 비특이적 배경 신호로 이어지는 DNA 단편화 및 불바운드 DNA 오염의 이질성에 의해 제한됩니다. ChIP와 엑소뉴클레아제 소화(ChIP-exo)의 조합은 ChIP-seq 방법을 단백질-DNA 교차 링크 점으로 트리밍하여, 근거리 쌍 분해능 및 낮은 배경 신호^3,4,5를제공한다. ChIP 엑소에서 제공하는 매핑 해상도와 낮은 배경은 게놈 전반에 걸쳐 정확하고 포괄적인 단백질 DNA 결합 위치를 결정할 수 있게 합니다. ChIP-exo는 기능적으로 뚜렷한 DNA 결합 모티프, 전사 인자(TF) 및 다중 단백질-DNA 교차 링크 부위를 특정 게놈 결합 위치에서드러낼 수 있으며, 다른 게놈 매핑 방법에 의해 검출할 수 없는^3,4,6,7.

ChIP-exo는 처음에 신진 효모에서 TFs의 서열 특이적 DNA 결합을 검사하고, 게놈^4,8,9를통해 개별 히스톤의 전사 사전 개시 복합체 및 서브 뉴클레오소말 구조의 정확한 조직을 연구하기 위해 사용되었다. 2011년^4년도입 이후, ChIP-exo는 박테리아, 마우스, 인간 세포^{7,10,11,12,13,14,15,16,17등}많은 다른 유기체에서 성공적으로 활용되고^있다. 2016년, Rhee 외^14는 다른 프로그래밍 TF Isl1을 이용한 이성구복합체를 형성하는 프로그래밍 TF Lhx3의 다운규제 이후 뉴런 유전자 발현이 어떻게 유지되었는지 이해하기 위해 포유류 뉴런에 ChIP-exo를 처음으로 사용했다. 이 연구는 Lhx3의 부재에서, Isl1는 뉴런 이펙터 유전자 유전자의 유전자 발현을 유지하기 위하여 Onecut1 TF에 의해 결합된 새로운 신경 강화에 모집된다는 것을 보여주었습니다. 이 연구에서 ChIP-exo는 여러 TF가 거의 뉴클레오티드 매핑 해상도에서 복합방식으로 세포 유형 및 세포 단계별 DNA 조절 요소를 동적으로 인식하는 방법을 밝혔습니다. 그밖 연구 결과는 또한 그밖 포유류 세포주에서 단백질과 DNA 사이 상호 작용을 이해하기 위하여 ChIP 엑소 방법을 이용했습니다. ^한일(7)은 ChIP-exo를 사용하여 ChIP-exo를 사용하여 마우스 에리스로이드 세포에서 GATA1 및 TAL1 TFs의 게놈 전체 조직을 검사하였다. 이 연구는 TAL1이 적혈구 분화를 통해 GATA1과의 단백질 단백질 상호 작용을 간접적으로 통해 간접적으로 DNA에 직접 모집된다는 것을 발견했습니다. 최근 연구는 또한 CTCF, RNA 폴리머라제 II, 및 히스톤 마크의 게놈 전체 결합 위치를 프로파일라기 위해 ChIP-exo를 사용하여 인간 세포주^18,19에서최신유전체 및 전사 메커니즘을 연구하였다.

사용할 수있는 ChIP 엑소 프로토콜의 여러 버전이 있습니다^3,5,20. 그러나 이러한 ChIP 엑소 프로토콜은 차세대 시퀀싱 라이브러리 준비에 익숙하지 않은 연구를 위해 따르기 어렵다. ChIP 엑소 프로토콜의 우수한 버전은 따라하기 쉬운 지침과 비디오^21로게시되었지만 완료하는 데 상당한 시간이 필요한 많은 효소 단계가 포함되어 있습니다. 여기서 는 감소된 효소 단계와 인큐베이션 시간을 포함하는 ChIP 엑소 프로토콜의 새 버전과 각 효소^{단계(21)에}대한 설명을 보고합니다. 최종 수리 및 dA 꼬리 반응은 엔드 준비 효소를 사용하여 단일 단계로 결합됩니다. 인덱스 및 범용 어댑터 리칭 단계의 인큐베이션 시간은 리그레이션 인핸서를 사용하여 2시간에서 15분으로 단축됩니다. 이전 ChIP 엑소 프로토콜에 기재된 인덱스 어댑터 리그션 단계 후의 키나제 반응이 제거된다. 대신, 인산염 군은 오리고 DNA 합성 중에 인덱스 어댑터(표1)의5'끝 중 하나에 첨가되며, 이는 람다 엑소뉴클레아제 소화 단계에 사용될 것이다. 이전 ChIP 엑소 프로토콜은 RecJ_f exonuclease 소화를 사용하여 단일 좌초 DNA 오염 물질을 제거하는 동안, 이 소화 단계는 ChIP 엑소 라이브러리의 품질에 중요하지 않기 때문에 여기에서 제거됩니다. 또한, ChIP 용출 후 역방향 DNA를 정화하기 위해, 자성 비드 정제 방법은 페놀:클로로폼:이소아밀 알코올(PCIA) 추출 방법 대신에 사용된다. 이것은 DNA 추출의 잠복기 시간을 감소시킵니다. 중요한 것은 인덱스 어댑터 리그레이션 중에 형성된 대부분의 어댑터 디머를 제거하여 계각 매개 PCR의 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다.

여기에 제시된 ChIP 엑소 프로토콜은 마우스 배아 줄기(ES) 세포와 분화된 포유류 뉴런에서 정밀한 단백질-DNA 상호작용의 검출에 최적화되어 있다. 간단히, 수확 및 교차 연결된 신경 세포는 크롬틴이 초음파 처리에 노출될 수 있도록, 다음 적절한 크기의 DNA 단편이 얻어지도록 초음파처리(도 1)를용해한다. 항체 코팅 구슬은 그 때 관심있는 단백질에 단편화된, 수용성 크로마틴을 선택적으로 면역침전염하는 데 사용됩니다. 면역 침전 DNA는 여전히 구슬에 있는 동안, 최종 수리, 시퀀싱 어댑터의 결찰, 채우기 반응 및 5' 3' 람다 exonuclease 소화 단계수행된다. 엑소뉴클레아제 소화 단계는 ChIP 엑소에게 초고해상도와 높은 신호 대 잡음 비율을 제공하는 것입니다. 람다 엑소뉴클레아제는 교차 연결 부위로부터 면역 침전 된 DNA를 몇 가지 염기 쌍 (bp)을 트림하여 오염 DNA가 저하됩니다. 엑소뉴클레아제 처리된 ChIP DNA는 항체 코팅 구슬로부터 용출되고, 단백질-DNA 크로스링크는 반전되고, 단백질은 저하된다. DNA는 단일 좌초 된 ChIP DNA에 추출되고 변성되고, 이중 좌초 DNA (dsDNA)를 만들기 위해 프라이머 어닐링 및 확장이 뒤따릅니다. 다음으로, 외핵체 처리 단부에 대한 범용 어댑터의 결찰이 수행된다. 생성된 DNA는 정제되고, PCR이 증폭되고, 겔정제되고, 차세대 시퀀싱을 실시한다.

ChIP 엑소 프로토콜은 ChIP-seq 프로토콜보다 길지만 기술적으로 는 그리 어렵지 않습니다. 모든 성공적으로 면역 침전된 ChIP DNA는 몇 가지 추가 효소 단계로 ChIP 엑소를 실시할 수 있습니다. 초고매핑 해상도, 배경 신호 감소, 게놈 결합 부위에 대한 거짓 긍정 및 네거티브 감소 등 ChIP-exo의 주목할 만한 장점은 시간 비용을 능가합니다.

프로토콜

참고: 오토클레이브 증류및 탈이온수(ddH₂O)는 버퍼 및 반응 마스터 믹스를 만드는 데 권장됩니다. 섹션 1-4세포 용해 및 초음파 처리를 설명하고, 섹션 5-7은 크로마티닌 면역 침전 (ChIP),섹션 8-11구슬에 대한 효소 반응을 설명하고, 섹션 12 및 13은 ChIP 용출 및 DNA 정화를 설명하고, 섹션 14-19는 도서관 준비를 설명합니다.

1. 셀 을 수확하고 교차 연결

1. 마우스 ES 세포를 미상 후 뉴런으로 분화한 후 수확된 세포에 11%의 포름알데히드를 1%(v/v)의 최종 농도로 추가합니다. 실온(RT, 25°C)에서 15분 동안 흔들 플랫폼(로커, 셰이커 또는 회전기)의 암석 셀.
   참고: 교차 연결될 대상 단백질에 따라 포름알데히드 교차 연결이 적습니다(예: 최종 농도0.5%) 또는 disuccinimidyl 글루타산염 (DSG)와 이중 교차 연결을 사용할 수 있습니다.
2. 교차 연결 반응을 중지하려면 150mMM의 최종 농도에 2.5 M 글리신을 추가합니다. RT의 흔들리는 플랫폼에 바위 세포, 5 분 동안.
3. 원심 분리기는 1,350 x g에서 6 분 동안 RT에서 15 mL 원색 튜브에서 교차 된 세포를 분리합니다. 용액을 흡인한 다음, 1x 인산염 완충식식염수(PBS)의 5mL에서 세포를 재흡입한다.
   참고: 교차 연결된 세포 펠릿은 액체 질소로 동결 된 후 -80 °C로 저장할 수 있습니다.

2. 셀 리시스

참고: 이 프로토콜의 다음 단계는 마우스 ES 세포와 분화된 약 2 x 10⁷ 뉴런 세포를 위한 것입니다. 개방 된 세포를 분해하기 위해 다양한 세제를 포함하는 용해 버퍼가 사용됩니다. 사용하기 직전에 1000x 완전 프로테아제 억제제(CPI) 스톡 50μL을 50mL의 버퍼50mL에 추가합니다.

1. 표 2에설명된 대로 리시스 버퍼 1-3을 준비한다.
2. 얼음에 교차 된 세포 펠릿을 해동한 다음 15 mL 원문 튜브에서 3 mL의 세포 펠릿을 철저히 재중단합니다. 흔들 플랫폼에서 15 분 동안 4 °C에서 바위. 원심분리기는 4°C에서 5분 동안 1,350 x g의 원심분리기와 흡인 슈퍼나탄.
3. 리시스 버퍼 2의 3mL에서 펠릿 세포를 철저히 재중단합니다. 흔들 플랫폼에서 10 분 동안 4 °C에서 바위. 원심분리기는 4°C에서 5분 동안 1,350 x g의 원심분리기와 흡인 슈퍼나탄.
4. 각 펠릿에 1mL의 리시스 버퍼 3을 추가한 다음 얼음을 유지합니다. 즉시 초음파 처리로 진행합니다.

3. 염색체 를 초음파 처리

참고: 이 초음파 처리 절차 동안 얼음 또는 4°C에 샘플을 유지하여 교차 링크 반전을 줄입니다.

1. 멸균 주걱을 사용하여 15mL 폴리스티렌 튜브에 0.2 mL 졸업 마크까지 초음파 처리 구슬(재료 테이블)을추가하십시오. 건조한 반점이 보이지 않을 때까지 1x PBS의 600 μL에서 소용돌이를 통해 초음파 처리 구슬을 씻으십시오. 30 x g에서 5 s에 대한 튜브원심분리및 흡인 1x PBS.
   참고 : 폴리스티렌 튜브의 초음파 처리는 폴리 프로필렌 튜브의 초음파 처리보다 더 효율적입니다. 적은 수의 셀(예: <10⁶ 셀)이 초음파 처리되면 초음파 처리를 추가하지 않고 1.5mL 폴리스티렌 튜브를 사용하십시오.
2. 용해 버퍼 3 (단계 2.4에서) 1 mL에서 핵 용해를 철저히 재연 한 다음 초음파 처리 구슬이 들어있는 15 mL 폴리스티렌 튜브로 옮김합니다. 폴리스티렌 튜브를 잠시 소용돌이시다.
3. 교차 연결된 크로마틴 DNA를 조각화하기 위해 4°C에서 핵 용해를 초음파 처리하여 최적화된 사이클 수에 대해 30W의 전력 진폭과 초음파 처리 주기가 30s on/30으로 설정됩니다.
   참고: 각 셀 유형 및 배치에 대한 초음파 처리의 최적화는 최고의 ChIP 엑소 수율을 초래할 것입니다. 2 x 10⁷ 마우스 뉴런 셀의 경우, 언급 된 설정에서 20-30 초음파 처리 주기는 100-500 bp의 범위에서 크로마틴을 단편화합니다.
4. 초음파 처리가 완료되면 각 샘플에서 1.5 mL 튜브로 모든 상체 (초음파 처리 된 lysates)를 전송합니다. 1%의 최종 농도에서 각 샘플에 10% 2-[4-4-트리메틸펜탄-2-yl)에탄올)을 추가합니다. 파이펫팅으로 섞으세요.
5. 펠릿 셀 이물질을 위해 원심분리기 샘플은 4°C에서 10분 동안 13,500 x g로 샘플을 채취한다. 각 샘플에서 새로운 1.5mL 튜브로 모든 초음파 처리된 리스(supernatant)를 전송합니다.
6. 각 샘플에서 30 μL의 초음파 처리 된 lysate (초음파 lysate의 ~3 %)를 가지고 초음파 처리를 확인하기 위해 새로운 1.5 mL 튜브에 추가하십시오. 항체 코팅 구슬로 잠복할 준비가 될 때까지 4°C에 남은 초음파 용액을 보관하십시오.

4. 초음파 처리 확인

1. 0.5M Tris-HCl(pH 8.0), 0.5M EDTA 2mL, 10% 나트륨 도데킬 황산염(SDS) 및 6mL의 오토클레이브 dDH_2O의2mL를 추가하여 2배 단백질라제 K 버퍼20mL을 만듭니다. 이 버퍼에 CPI를 추가하지 마십시오. RT에서 50mL 튜브에 보관하십시오.
2. 단백질-DNA 크로스링크를 되돌리려면 단백질을 제거함으로써 각 샘플(3.6단계에서)에서 초음파 염색체의 30 μL을 복용하여 오토클레이브 ddH_2O의166 μL, 2배 단백질라제 K 버퍼 200μL, 20mg/mL 단백질Ae K의 4μL을 추가한 다음 6°C에서 6°C에서 1°C에서 1°c에서 1°c에서 비큐스테테를 사용한다.
3. 참고: 초음파 처리된 lysates는 하룻밤 사이에 65°C에서 교차 연결될 수 있습니다.
4. PCIA를 사용하여 DNA를 추출 (25:24:1) 및 에탄올 강수 방법은 다음과 같이.
   주의: PCIA는 독성이 있습니다. 표준 개인 보호 장비 (PPE)와 연기 후드에서 사용하십시오.
   1. 1.5mL 튜브의 각 샘플에 400 μL의 PCIA를 추가하고, 20s에 대한 최대 속도와 소용돌이 샘플로 소용돌이를 설정합니다. RT에서 6 분 동안 18,400 x g의 원심 분리기. 두 단계가 관찰됩니다. 각 시료의 상부 수성층(클리어 페이즈)을 새로운 1.5mL 튜브로 조심스럽게 이송합니다.
   2. 37°C에서 10 mg/mL RNase A. 인큐베이션 샘플 1μL을 30분 동안 추가합니다.
   3. 각 샘플에 20 mg/mL 글리코겐의 1 μL을 추가한 다음 1mL의 얼음-차가운 100% 에탄올(-20°C 냉동고에 저장)으로 침전시합니다. 간단히 섞은 다음 샘플을 -80°C 냉동고에서 30분내지 1시간 동안 배양합니다. 원심분리기 샘플은 4°C에서 10분 동안 18,400 x g의 샘플을 원심분리기로 조심스럽게 부어 100% 에탄올을 부었다.
   4. 500 μL의 얼음 차가운 70 % 에탄올 (-20 ° C 냉동고에 저장)로 펠릿을 세척하십시오. 원심분리기는 4°C에서 5분 동안 18,400 x g에서 원심분리기. 70% 에탄올을 조심스럽게 붓습니다.
   5. 남은 에탄올이 증발될 때까지 50°C에서 1.5mL 튜브의 샘플을 배양한다. 자동 ddH₂O 또는 뉴클레아제 프리 ddH₂O의 15 μL에서 DNA 펠릿을 재중단합니다.
   6. 추출된 DNA 샘플을 DNA 사다리와 함께 120-180 V의 아가로즈 젤 1.5%로 실행하고 초음파 처리된 DNA의 크기를 확인합니다.

5. 구슬을 가진 항체 잠복기

참고: 이 프로토콜의 다음 단계는 마우스 ES 세포와 분화된 약 2 x 10⁷ 뉴런 세포를 위한 것입니다. 구슬이 시료의 오염을 유발하거나 항체의 성능이 손상될 수 있기 때문에 ChIP-exo 프로토콜 동안 어느 시점에서든 자기 구슬을 동결 및 해동하지 마십시오.

1. 세포 용해 및 초음파 처리 후, ChIP에 대한 단백질 G 자기 구슬(재료의 표)을준비하고, 균질화 될 때까지 자기 구슬을 혼합 한 다음 2mL 단백질 저결합 튜브에 자기 구슬 25 μL을 추가합니다.
   참고: 사용되는 자기 구슬의 종류는 항체의 종에 따라 달라집니다.
2. 블로킹 용액 1mL(표2)로구슬을 씻은 다음, 잘 섞은 다음 자기 랙에 1분 동안 놓습니다. 마그네틱 랙에 있는 동안, 그것이 분명하면 상체를 제거하십시오.
3. 마그네틱 비드에 블로킹 용액 1mL를 추가합니다. 흔들 플랫폼에서 4 °C에서 10 분 동안 바위 튜브. 잠시 회전한 다음 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 상복부를 제거합니다.
4. 5.3 단계를 두 번 더 반복합니다.
5. 자기 비드에 블로킹 용액 500 μL을 추가합니다. Isl1(0.04 μg/μL, 재료 표)에대한 항체를 간략하게 회전한 다음, 차단 용액에서 자기 구슬을 함유하는 해당 2mL 단백질 저바인드 튜브에 4 μg의 항체를 추가합니다.
6. 항체 없이 5.5단계를 반복한다(즉, ChIP에 대한 항체 제어 없음).
   참고: 첨가할 항체의 양은 항체의 품질과 ChIP에 사용되는 세포의 수를 고려하여 경험적으로 결정될 수 있다.
7. 흔들 플랫폼에서 6-24 h에 대한 4 ° C에서 바위 샘플.

6. 크로마틴 면역 침전 (ChIP)

1. 블로킹 용액 1mL로 5.8 단계에서 항체 코팅 구슬을 세척하십시오. 5 분 동안 4 ° C에서 흔들 플랫폼에 샘플을 배치합니다.
2. 6.1 단계를 두 번 더 반복합니다.
3. 블로킹 용액의 50 μL에서 항체 코팅 구슬을 다시 일시 중단한 다음 새로운 2mL 단백질 저결합 튜브로 이송합니다. 각 ChIP 샘플에 대해 초음파 처리된 용액(3.6단계에서~1.0mL)을 항체 코팅 구슬에 2mL 단백질 저결합 튜브에 추가합니다.
4. 4 °C에서 하룻밤 동안 흔들 플랫폼에 각 샘플을 배양.

7. ChIP 세차스

참고: ChIP 세차장 동안 단백질 DNA 교차 연결을 유지하기 위해 얼음 또는 4°C에 샘플을 보관하십시오.

1. 표 3에설명된 바와 같이 높은 소금 세척 버퍼, LiCl 세척 버퍼 및 10m Tris-HCl 버퍼(pH 7.4)를 만듭니다. 4 °C에서 50 mL 튜브에 보관하십시오. 사용하기 직전에 모든 버퍼에 1000x CPI 스톡의 50 μL을 추가합니다.
2. 2mL 단백질 저결합 튜브에서 샘플을 짧게 회전하여 캡에서 액체를 채취한 다음 자기 랙에 1분 동안 놓고 파이펫으로 조심스럽게 초대형 튜브를 제거합니다.
3. ChIP 세차스의 경우 각 튜브에 1mL의 용해 버퍼 3(4°C)를 추가합니다. 흔들 기 플랫폼에 5 분 동안 4 °C에 혼합. 샘플을 잠시 회전한 다음 마그네틱 랙에 1분 동안 놓고 파이펫으로 상퍼를 제거합니다.
4. 각 튜브에 차가운 고염 세척 버퍼 1mL를 추가합니다. 흔들 기 플랫폼에 5 분 동안 4 °C에 혼합. 샘플을 잠시 회전한 다음 마그네틱 랙에 1분 동안 놓고 파이펫으로 상퍼를 제거합니다.
5. 각 튜브에 차가운 LiCl 세척 버퍼 1mL을 추가합니다. 흔들 기 플랫폼에 5 분 동안 4 °C에 혼합. 샘플을 잠시 회전한 다음 마그네틱 랙에 1분 동안 놓고 파이펫으로 상퍼를 제거합니다.
6. 각 튜브에 1mL의 콜드 10m Tris-HCl 버퍼(pH 7.4)를 추가합니다. 흔들 기 플랫폼에 5 분 동안 4 °C에 혼합. 샘플을 잠시 회전한 다음 마그네틱 랙에 1분 동안 놓고 파이펫으로 상퍼를 제거합니다.
   참고: Tris-EDTA 버퍼(pH 8.0)는 Tris-HCl 버퍼(pH 7.4) 대신 사용할 수 있습니다.
7. 단계를 반복 7.4-7.6 세 번.
8. 트리스-HCl 버퍼(pH 7.4)의 500 μL을 새로 1.5mL 튜브로 시료 구슬을 전송합니다. 샘플을 잠시 회전한 다음 마그네틱 랙에 1분 동안 놓고 파이펫으로 상퍼를 제거합니다.

8. 구슬에 대한 수리 및 dA 꼬리 반응 종료

참고 : 초음파 처리는 종종 비 무딘 종료 dsDNA를 생성합니다. 최종 수리 반응은 인덱스 어댑터 리칭 단계에 이어 dA 꼬리 반응 전에 무딘 말단 DNA를 만들기 위해 필요합니다. 인덱스 어댑터 DNA를 가진 끈적끈적한 끝 DNA 결찰을 위해, dATP는 dA 꼬리 반응에 의하여 무딘, dsDNA 단편의 3'끝에 추가됩니다. 최종 준비 반응 믹스는 dATP를 포함합니다.

1. ChIP 세척 후, 최종 수리 및 dA 꼬리 반응을위해 1.5mL 튜브에 샘플 구슬에 38 μL을 추가합니다.
2. 최종 준비 반응 믹스의 5.6 μL과 각 샘플 (총 반응 부피 : 46 μL)에 최종 준비 효소 혼합(재료 표)의2.4 μL을 추가합니다. 30 분 동안 20 °C에서 샘플을 배양합니다.
3. 이전 ChIP 세척 단계 7.4-7.6에 설명 된 바와 같이 구슬을 씻는다.

9. 구슬의 인덱스 어댑터 리세션

참고: 인덱스 어댑터는 하이 처리량 시퀀싱에서 여러 샘플을 멀티플렉스화하는 데 사용되는 지정된 샘플과 관련된 바코드 인덱스 서열의 6-10 베이스를 가지고 있습니다. 인덱스 어댑터 DNA 서열은 표 1에기재된다.

1. 인덱스 어댑터 리딩의 경우, 샘플 구슬에 냉간 10m Tris-HCl 버퍼(pH 7.4)의 27 μL을 추가합니다. 15 μM 인덱스 어댑터의 2 μL, 결찰 강화제의 0.5 μL, 각 샘플(총 반응 량: 44.5 μL)에 리게아제 마스터믹스(재료 표)의15 μL을 추가합니다.
2. 15 분 동안 20 °C에서 샘플을 배양합니다. 7.4-7.6 단계에 설명된 대로 구슬을 씻는다.

10. 구슬에 대한 반응 채우기

참고: 어댑터 결찰 후 어댑터의 5'끝과 ChIP DNA의 3'끝 사이에 인포디스터 결합이 없습니다. 닉은 채우기 반응에 의해 복구 할 수 있습니다.

1. 샘플 구슬에 차가운 10m Tris-HCl 버퍼(pH 7.4)의 47 μL을 추가합니다.
2. 얼음에 채우기 반응 믹스(표 4 및 재료의 테이블)를확인합니다.
3. 각 샘플에 11.1 μL의 채우기 믹스를 추가합니다(총 반응 량: 58.1 μL). 20 분 동안 30 °C에서 샘플을 배양합니다. 7.4-7.6 단계에 설명된 대로 구슬을 씻는다.

11. 구슬에 람다 외핵증 소화

1. 구슬에 대한 채우기 반응 후, 샘플 구슬에 차가운 오토클레이브 ddH₂O의 50 μL을 추가합니다.
2. ChIP DNA를 5' ~ 3' 방향으로 소화하려면 람다 엑소뉴클레아제 버퍼 10x 6μL과 U/μL 람다 엑소뉴클레아제 5μL2μL(재료표,총 반응 부피: 58 μL)을 추가합니다. 37°C에서 30분 동안 시료를 배양합니다. 7.4-7.6 단계에 설명된 대로 구슬을 씻는다.

12. 용출 및 역 교차 연결

1. 표 5에설명된 대로 ChIP 용출 버퍼를 만듭니다.
   참고: ChIP 용출 버퍼에 CPI를 추가하지 마십시오.
2. 구슬에서 ChIP 샘플을 elute하려면 ChIP 용출 버퍼75 μL에서 샘플을 재일시 중단하고 65 °C에서 130 x g에서15 분 동안 배양하십시오.
3. 20 mg/mL 단백질제K(재료 표)의2.5 μL을 샘플에 추가합니다. 잠시 소용돌이를 한 다음 65°C에서 하룻밤 사이에 샘플을 배양합니다.

13. DNA 추출

1. 샘플이 65°C에서 하룻밤 동안 배양한 후, 샘플을 잠시 회전하고, 자기 랙에 1분 간 배치한 다음, 각 샘플에서 1.5mL 튜브로 초퍼나탄을 옮기습니다.
2. 샘플에 10 mg/mL RNase A의 1 μL을 추가합니다. 잠시 소용돌이를 한 다음 37°C에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. ~25 μL의 오토클레이브 ddH₂O를 최대 100 μL의 부피로 추가합니다.
3. 자기 구슬(재료의 표)를사용하여 DNA를 정화합니다. 16μL의 오토클레이브 ddH₂O 또는 뉴클레아스 프리 ddH₂O의 엘루트 DNA.

14. 데니링, 프라이머 어닐링 및 프라이머 확장

1. ChIP 용출 및 역교차 연결 후 추출된 DNA 샘플의 16μL을 13.3단계에서 PCR 튜브로 이송합니다.
2. 얼음에 데스팅과 프라이머 어닐링믹스(표 6 및 재료 테이블)를만듭니다. 각 샘플에 1.2 μL의 데니어링 및 프라이머 어닐링 믹스를 추가합니다(총 반응 량: 17.2 μL). 표 6에 설명된 프로그램을 사용하여 샘플을 실행하여 템플릿 DNA에 대한 변성 및 막막 프라이머를 해독합니다.
3. 얼음에 프라이머 확장 믹스(표 7 및 재료의 테이블)를확인합니다.
4. 변성 및 절전 제품 프라이머에 대한 프로그램이 완료되면 샘플에 프라이머 확장 믹스 3 μL을 추가합니다(총 반응 량: 20.2 μL). 표 7에설명된 프라이머 확장을 위해 프로그램을 사용하여 샘플을 실행합니다.
5. 즉시 dA 꼬리 반응을 진행합니다.

15. dA 꼬리 반응

참고: 범용 어댑터 DNA를 가진 끈적끈적한 끝 DNA 결찰을 위해, dATP는 dA 꼬리 반응에 의해 무딘, dsDNA의 3'끝에 추가됩니다.

1. 얼음 에 dA 꼬리 믹스(표 8 및 재료의 테이블)를확인합니다.
2. 각 샘플에 dA 꼬리 믹스 4.1 μL을 추가합니다(총 반응 부피: 24.3 μL). dA 꼬리(표 8)에대한 프로그램을 사용하여 샘플을 실행합니다.
3. 즉시 범용 어댑터 계각으로 진행합니다.

16. 유니버설 어댑터 리베이션

참고: 범용 어댑터는 시퀀싱 화학에 대한 DNA 샘플 인식을 위한 고처리량 시퀀싱 특이적 서열을 포함한다. 범용 어댑터 DNA 서열은 표 1에설명되어 있다.

1. dA-tailing 반응 후 범용 어댑터 리칭믹스(표 9 및 재료 표)를범용 어댑터 리칭용으로 만듭니다.
2. 각 샘플(총 반응 부피: 45.8 μL)에 21.5 μL을 추가하고 20°C에서 15분 동안 시료를 배양합니다.

17. DNA 정화

1. 자기 구슬(재료의 표)를사용하여 DNA를 정화합니다. 21 μL의 오토클레이브 ddH₂O 또는 뉴클레아스 프리 ddH₂O를 가진 엘루트 DNA.
2. 리칭 매개 PCR(LM-PCR) 및 PCR 정제를 수행할 때까지 샘플을 -20°C로 저장합니다.

18. 리케이션 매개 PCR

참고: LM-PCR 프라이머 시퀀스는 표 1에설명되어 있습니다.

1. DNA 정화 후, 얼음에 LM-PCR 믹스(표 10 및 재료의 테이블)를확인합니다.
2. LM-PCR 믹스 29μL을 각 샘플(총 반응 부피: 50 μL)에 추가하고 LM-PCR(표10)에대한 프로그램을 사용하여 샘플을 실행합니다.
3. 즉시 PCR 증폭 DNA의 겔 정화를 진행하고, 높은 처리량 시퀀싱을 위한 DNA 정화가 뒤따릅니다.

19.LM-PCR 증폭 DNA의 DNA p 소변

1. LM-PCR 증폭 DNA 샘플을 DNA 사다리와 함께 120-180 V에서 1.5% 아가로즈 젤로 실행하고 200-400 bp 대역을 소비합니다.
2. 젤 추출키트(재료표)를사용하여 절제된 젤에서 DNA를 정화합니다.
3. DNA 정화 후 각 ChIP 엑소 라이브러리샘플의 농도(재료 표)를확인하십시오. 단일 읽기 시퀀싱을 위해 처리량이 높은 시퀀싱을 위한 샘플을 제출합니다.
   참고: 단일 읽기 시퀀싱을 위한 바람직한 판독 길이는 적어도 35bp이며, 이는 마우스 또는 인간 세포에서 참조 게놈에 대한 시퀀싱 판독을 고유하게 정렬하기에 충분하다. 마우스 또는 인간 세포에 있는 대부분의 전사 인자에 대 한, ChIP-exo 샘플 당 10-20 백만 읽기 그들의 게놈 결합 위치를 식별 하기에 충분 하다. 포유류 세포에서 히스톤 마크에 농축된 게놈 영역을 매핑하려면 시료당 최소 3천만 개의 판독이 필요합니다.

결과

도 2A는 마우스 ES 세포로부터 분화된 모터 뉴런 세포의 다양한 사이클을 통해 세포 리시스 및 초음파 처리 후 초음파 처리 결과를 도시한다. 초음파 처리 주기의 최적 수 (예를 들어, 도 2A에서12 사이클) 100-400 bp DNA 단편에서 강한 DNA 강도를 생성. 고품질 ChIP 엑소 라이브러리는 단편화된 크로마틴 DNA의 크기와 양을 기반으로 합니다. 따라서, ChIP 엑소를 시작하기 전에 각 세포 유형 및 세포의 배치에 대해 초음파 처리의 최적화가 권장된다.

도 2B는 18-21 PCR 사이클에 의해 증폭된 ChIP 엑소 DNA 샘플의 계각 매개 PCR(LM-PCR) 제품을 나타낸다. LM-PCR은 차세대 시퀀싱을 위해 DNA 어댑터로 계게 되는 ChIP 엑소 DNA 단편을 증폭시합니다. PCR 프라이머는 D...

토론

이 프로토콜에서, 외핵증 소화뒤에 는 초고매핑 해상도에서 포유류 세포에서 단백질-DNA 상호 작용의 식별을 위한 DNA 라이브러리를 얻기 위하여 이용되는 외핵증 소화에 선행된 ChIP. 많은 변수가 ChIP 엑소 실험의 품질에 기여합니다. 중요한 실험 파라미터는 항체의 질, 초음파 처리의 최적화 및 LM-PCR 주기의 수를 포함합니다. 이러한 중요한 실험 파라미터는 ChIP 엑소 실험을 제한할 수 있으며 아래에서 논의될 것입니다.

모든 ChIP 프로토콜에서 항체 품질은 가장 중요한 고려 사항 중 하나입니다. ChIP 등급 항체의 사용은 ChIP-exo에 권장됩니다. 항체 품질은 ChIP 엑소 프로토콜을 수행하기 전에 확인할 수 있다. ChIP-seq 또는 ChIP-qPCR은 관심 있는 단백질의 특정 DNA 결합 위치를 확인하여 ChIP 급 항체를 검증하는 데 사용될 수 있다. 이어서, 비드에 첨가된 항체의 농도를 최적화하는 것은 단백질-DNA 복합체가 면역침전처리되어

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로스, UltraPure	Invitrogen	16500	검사 초음파 처리 (섹션 4.3.6) 및 LM-PCR 증폭 DNA의 겔 정제 (섹션 19.1)
알부민, 소 혈청 (BSA), 프로테아제 프리, 열 충격 격리, 최소. 98%	BioShop	ALB003	차단 솔루션
Isl1	DSHB	39.3F7	비즈 항체 주입 (섹션 5.6)
Bioruptor Pico& 주의;	Diagenode	B01060010	초음파 처리 염색질(섹션 3.3)
소 혈청 알부민(BSA), 분자 생물학 등급	New England BioLabs	B9000S	비드 필인 반응(섹션 10.2) 및 변성, 프라이머 어닐링 및 프라이머 확장(섹션 14.2)
원심분리기 5424 R	Eppendorf	5404000138	초음파 처리 염색질(섹션 3.5), 초음파 처리 확인(섹션 4.3.1, 4.3.3 및 4.3.4)
Centrifuge 5804 R	Eppendorf	22623508	Harvest, 세포 가교 및 동결(섹션 1.3), 세포 용해(섹션 2.2 및 2.3), 초음파 처리 크로마틴(섹션 3.1)
cOmplete, Mini, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일	로슈	4693159001	Proteinase K 완충액 및 ChIP 용리 완충액 dATP 용액을 제외한 모든 완충액에 첨가
	New England BioLabs	N0440S	dA-테일링 반응(섹션 15.1)
Deoxycholic Acid Sodium Salt	fisher scientific	BP349	Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer 및 LiCl Wash Buffer
dNTP Mix, 분자생물학 등급	Thermo Scientific	R0192	비드 (Section 10.2) 및 변성, Primer Annealing 및 Primer Extension (Section 14.2)에 대한 필-인 반응 (
DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x	Thermo Scientific	K1081	결찰 매개 PCR(섹션 18.1)
EDTA, 0.5M, 멸균 용액, pH 8.0	BioShop	EDT111	용해 버퍼 1-3, 초음파 처리(섹션 4.1) 확인, 고염 세척 버퍼, LiCl 세척 버퍼 및 ChIP 용출 버퍼
에틸 알코올 무수, 100%	상업용 알코올	P006EAAN	초음파 처리(섹션 4.3.3)
포름알데히드, 36.5-38%, 10-15% 함유 메탄올	Sigma	F8775	수확, 가교 및 동결 세포(섹션 1.1)
글리세롤, 시약 등급, 최소 99.5%	BioShop	GLY002	Lysis Buffer 1
글리신, 생명공학 등급, 최소 99%	BioShop	GLN001	수확, 가교 및 동결 세포(섹션 1.2)
글리코겐, RNA 등급	Thermo Scientific	R0551	초음파 처리(섹션 4.3.3)
HEPES, 1 M 멸균 여과 용액, pH 7.3	BioShop	HEP003	용해 버퍼 1, 고염 세척 버퍼
Klenow Fragment (3->5 exo-)	New England BioLabs	M0212S	dA-테일링 반응(섹션 15.1)
Lambda 엑소뉴클레아제	New England BioLabs	M0262S	비드의 Lambda 엑소뉴클레아제 분해(섹션 11.2)
리가제 인핸서	New England BioLabs	E7645S	NEBNext Ultra II DNA 라이브러리 키트. 비드의 인덱스 어댑터 연결(섹션 9.1) 및 범용 어댑터 연결(섹션 16.1)
리가제 마스터 믹스	New England BioLabs	E7645S	NEBNext Ultra II DNA 라이브러리 키트. 비드의 인덱스 어댑터 결찰(섹션 9.1) 및 범용 어댑터 결찰(섹션 16.1)
염화리튬(LiCl), 시약 등급	Bioshop	LIT704	LiCl 세척 버퍼
ChIP용 마그네틱 비드(Dynabeads Protein G)	Dynabeads Protein G(ChIP용 마그네틱 비드)	Dynabeads Protein G(ChIP용 마그네틱 비드)	비드를 사용한 항체 인큐베이션(섹션 5)
DNA 정제용 마그네틱 비드(AMPure XP 비드)	Beckman Coulter	A63880	DNA 추출 (섹션 13.3) 및 DNA 클린업 (섹션 17.1)
자기 랙 (DynaMag-2 자석)	Invitrogen	12321D	섹션에서 많은 단계에서 사용됩니다: 5 - 11, 13
MinElute Gel 추출 키트	Qiagen	28604	PCR 증폭 DNA의 겔 정제 (섹션 19.2)
N-Lauroylsarcosine 나트륨 염 용액, 30 % 수용액, ≥ 97.0 % (HPLC)	Sigma	61747	용해 버퍼 3
옥틸 페놀 에톡실 레이트 (IGEPAL CA630)	BioShop	NON999	용해 버퍼 1 및 LiCl 세척 버퍼
페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올, 생명 공학 학년 (25 : 24 : 1)BioShop		PHE512	초음파 처리 검사 (섹션 4.3.1)
phi29 DNA 중합 효소	뉴 잉글랜드 BioLabs	M0269L	비드 (섹션 10.2) 및 변성, 프라이머 어닐링 및 프라이머 확장 (섹션 14.3 및 14.4)
인산염 완충 식염수 (PBS)에 대한 필인 반응, 1x	Corning	21040CV	수확, 가교 결합 및 동결 세포(섹션 1.3) 및 초음파 염색질(섹션 3.1), 비드를 사용한 항체 주입(섹션 5.1)
PowerPac 기본 전원 공급 장치	BioRad	1645050	초음파 처리(섹션 4.3.6) 및 LM-PCR 증폭 DNA의 겔 정제(섹션 19.1)
ProFlex PCR 시스템	바이오시스템	ProFlex PCR 시스템	섹션에서 사용: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 및 18.2
단백질 LoBind 튜브, 2.0 mL	Eppendorf	22431102	Beads (Section 5.2) 및 Chromatin Immunoprecite(Section 6.3)
ProteinAse K Solution, RNA grade	Invitrogen	25530049	Checking Sonication (Section 4.2) 및 Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3)
Qubit 4.0 Fluorometer	Invitrogen	Q33226	Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3)
Quibit dsDNA BR assay 키트	Invitrogen	Q32853	PCR 증폭 DNA의 겔 정제 (섹션 19.3)
Rnase A, Dnase 및 프로테아제가 없는	Thermo Scientific	EN0531	초음파 처리 (섹션 4.3.2) 및 DNA 추출 (섹션 13.2)
염화나트륨 (NaCl), BioReagent	Sigma	S5886	용해 버퍼 1-3, 고염 세척 버퍼
소듐 도데실 설페이트 (SDS), 전기영동 등급	BioShop	SDS001	확인 초음파 처리 (섹션 4.1), 고염 세척 버퍼 및 ChIP 용출 버퍼
초음파 처리 비드 및 15 mL Bioruptor 튜브	Diagenode	C01020031	초음파 처리 크로마틴 (섹션 3.1 및 3.2)
ThermoMixer F1.5	Eppendorf	5384000020	섹션 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 및 16.2
Trizma hydrochloride 용액(Tris-HCl), BioPerformance 인증, 1 M, pH 7.4	Sigma	T2194	10 mM Tris-HCl Buffer
Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0	Sigma	T2694	용해 버퍼 2, 용해 버퍼 3, 초음파 처리 확인(섹션 4.1), LiCl 세척 버퍼 및 ChIP 용리 버퍼
Ultra II 말단 수리/dA-테일링 모듈(24 rxn -> 120 rxn)	New England BioLabs	E7546S	말단 분취 반응 혼합물 및 말단 분취 효소 혼합물. 비드에 대한 말단 수리 및 dA-테일링 반응 (섹션 8.2)
VWR 미니 튜브 로커, 가변 속도	VWR	10159-752	섹션의 여러 단계로 사용 : 1, 2, 5, 6 및 7
2- [4- (2,4,4- 트리메틸 펜탄 -2- 일) 페녹시] 에탄올, 트리톤 X-100, 시약 등급	BioShop	TRX506	용해 버퍼 1, 초음파 처리 크로마틴 (섹션 3.4) 및 고 염 세척 버퍼