방법 논문

크롬 마틴 면역 침전 -엑소뉴클레아제 (ChIP-Exo)를 사용하여 마우스 줄기 세포 유래 뉴런에서 단백질 DNA 상호 작용의 고해상도 매핑

DOI:

10.3791/61124

⸱

2020년 8월 14일

 , 
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, 2Department of Biology, University of Toronto

이 논문에서

요약

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게놈 전반에 걸친 단백질 결합 위치의 정확한 결정은 유전자 조절을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 외핵증 소화(ChIP-exo)를 사용한 크로마틴-면역침전DNA를 치료하는 게놈 매핑 방법을 설명하고 있으며, 이어서 고처리량 시퀀싱을 한다. 이 방법은 포유류 뉴런에서 근거리 쌍 매핑 해상도 및 높은 신호 대 잡음 비와 단백질 DNA 상호 작용을 검출합니다.

초록

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게놈에 특정 단백질-DNA 상호 작용의 식별은 유전자 조절을 이해하는 데 중요합니다. 높은 처리량 시퀀싱 (ChIP-seq)과 결합된 크로마틴 면역 침전은 DNA 결합 단백질의 게놈 전체 결합 위치를 식별하는 데 널리 사용됩니다. 그러나 ChIP-seq 방법은 초음파 처리된 DNA 단편 및 비특이적 배경 DNA의 길이에 있는 이질성에 의해 제한되어 DNA 결합 부위의 낮은 매핑 해상도 및 불확실성을 초래합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 ChIP와 엑소뉴클레아제 소화(ChIP-exo)의 조합은 5'에서 3' 엑소뉴클레아제 소화를 활용하여 단백질-DNA 교차 링크 부위에 이질적으로 크기의 면역 침전DNA를 다듬는다. 엑소뉴클레아제 치료는 또한 비특이적 배경 DNA를 제거한다. 라이브러리가 준비된 외핵증 소화 DNA는 고처리량 시퀀싱을 위해 전송될 수 있다. ChIP 엑소 방법을 사용하면 감지 감도가 높아지고 배경 신호가 감소하는 근거리 쌍 매핑 해상도가 가능합니다. 포유류 세포 및 차세대 시퀀싱을 위한 최적화된 ChIP 엑소 프로토콜은 아래에 설명되어 있다.

서론

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단백질 DNA 상호 작용의 위치는 유전자 조절의 기계장치에 통찰력을 제공합니다. 높은 처리량 시퀀싱(ChIP-seq)과 결합된 크로마틴 면역 침전은 살아있는 세포1,2에서게놈-DNA 상호 작용을 검사하기 위해 10년 동안 사용되어 왔다. 그러나 ChIP-seq 방법은 낮은 매핑 해상도, 거짓 긍정, 부재중 전화 및 비특이적 배경 신호로 이어지는 DNA 단편화 및 불바운드 DNA 오염의 이질성에 의해 제한됩니다. ChIP와 엑소뉴클레아제 소화(ChIP-exo)의 조합은 ChIP-seq 방법을 단백질-DNA 교차 링크 점으로 트리밍하여, 근거리 쌍 분해능 및 낮은 배경 신호3,4,5를제공한다. ChIP 엑소에서 제공하는 매핑 해상도와 낮은 배경은 게놈 전반에 걸쳐 정확하고 포괄적인 단백질 DNA 결합 위치를 결정할 수 있게 합니다. ChIP-exo는 기능적으로 뚜렷한 DNA 결합 모티프, 전사 인자(TF) 및 다중 단백질-DNA 교차 링크 부위를 특정 게놈 결합 위치에서드러낼 수 있으....

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프로토콜

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참고: 오토클레이브 증류및 탈이온수(ddH2O)는 버퍼 및 반응 마스터 믹스를 만드는 데 권장됩니다. 섹션 1-4세포 용해 및 초음파 처리를 설명하고, 섹션 5-7은 크로마티닌 면역 침전 (ChIP),섹션 8-11구슬에 대한 효소 반응을 설명하고, 섹션 12 및 13은 ChIP 용출 및 DNA 정화를 설명하고, 섹션 14-19는 도서관 준비를 설명합니다.

1. 셀 을 수확하고 교차 연결

  1. 마우스 ES 세포를 미상 후 뉴런으로 분화한 후 수확된 세포에 11%의 포름알데히드를 1%(v/v)의 최종 농도로 추가합니다. 실온(RT, 25°C)에서 15분 동안 흔들 플랫폼(로커, 셰이커 또는 회전기)의 암석 셀.
    참고: 교차 연결될 대상 단백질에 따라 포름알데히드 교차 연결이 적습니다(예: 최종 농도0.5%) 또는 disuccinimidyl 글루타산염 (DSG)와 이중 교차 연결을 사용할 수 있습니다.
  2. 교차 연결 반응을 중지하려면 150mMM의 최종 농도에 2.5 M 글리신을 추가합니다. RT의 흔들리는 플랫폼에 바위 세포, 5 분 동안.
  3. 원심 분리기는 1,350 x g에서 6 분 동안 RT에서 15 mL 원색 튜브에서 교차 된 세포를 분....

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결과

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도 2A는 마우스 ES 세포로부터 분화된 모터 뉴런 세포의 다양한 사이클을 통해 세포 리시스 및 초음파 처리 후 초음파 처리 결과를 도시한다. 초음파 처리 주기의 최적 수 (예를 들어, 도 2A에서12 사이클) 100-400 bp DNA 단편에서 강한 DNA 강도를 생성. 고품질 ChIP 엑소 라이브러리는 단편화된 크로마틴 DNA의 크기와 양을 기반으로 합니다. 따라서, ChIP 엑소를 시작하기 전에 각 세포 유형 및 세포의 배치에 대해 초음파 처리의 최적화가 권장된다.

도 2B는 18-21 PCR 사이클에 의해 증폭된 ChIP 엑소 DNA 샘플의 계각 매개 PCR(LM-PCR) 제품을 나타낸다. LM-PCR은 차세대 시퀀싱을 위해 DNA 어댑터로 계게 되는 ChIP 엑소 DNA 단편을 증폭시합니다. PCR 프라이머는 D.......

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토론

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이 프로토콜에서, 외핵증 소화뒤에 는 초고매핑 해상도에서 포유류 세포에서 단백질-DNA 상호 작용의 식별을 위한 DNA 라이브러리를 얻기 위하여 이용되는 외핵증 소화에 선행된 ChIP. 많은 변수가 ChIP 엑소 실험의 품질에 기여합니다. 중요한 실험 파라미터는 항체의 질, 초음파 처리의 최적화 및 LM-PCR 주기의 수를 포함합니다. 이러한 중요한 실험 파라미터는 ChIP 엑소 실험을 제한할 수 있으며 아래에서 논의될 것입니다.

모든 ChIP 프로토콜에서 항체 품질은 가장 중요한 고려 사항 중 하나입니다. ChIP 등급 항체의 사용은 ChIP-exo에 권장됩니다. 항체 품질은 ChIP 엑소 프로토콜을 수행하기 전에 확인할 수 있다. ChIP-seq 또는 ChIP-qPCR은 관심 있는 단백질의 특정 DNA 결합 위치를 확인하여 ChIP 급 항체를 검증하는 데 사용될 수 있다. 이어서, 비드에 첨가된 항체의 농도를 최적화하는 것은 단백질-DNA 복합체가 면역침전처리되어

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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게시된 데이터와 귀중한 토론을 공유해 주신 Rhee 연구소의 회원에게 감사드립니다. 이 작품은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC) RGPIN-2018-06404 (H.R.)에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아가로스, UltraPureInvitrogen16500검사 초음파 처리 (섹션 4.3.6) 및 LM-PCR 증폭 DNA의 겔 정제 (섹션 19.1)
알부민, 소 혈청 (BSA), 프로테아제 프리, 열 충격 격리, 최소. 98%BioShopALB003차단 솔루션
Isl1DSHB39.3F7비즈 항체 주입 (섹션 5.6)
Bioruptor Pico& 주의;DiagenodeB01060010초음파 처리 염색질(섹션 3.3)
소 혈청 알부민(BSA), 분자 생물학 등급New England BioLabsB9000S비드 필인 반응(섹션 10.2) 및 변성, 프라이머 어닐링 및 프라이머 확장(섹션 14.2)
원심분리기 5424 REppendorf5404000138초음파 처리 염색질(섹션 3.5), 초음파 처리 확인(섹션 4.3.1, 4.3.3 및 4.3.4)
Centrifuge 5804 REppendorf22623508Harvest, 세포 가교 및 동결(섹션 1.3), 세포 용해(섹션 2.2 및 2.3), 초음파 처리 크로마틴(섹션 3.1)
cOmplete, Mini, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일로슈4693159001Proteinase K 완충액 및 ChIP 용리 완충액 dATP 용액을 제외한 모든 완충액에 첨가
New England BioLabsN0440SdA-테일링 반응(섹션 15.1)
Deoxycholic Acid Sodium Saltfisher scientificBP349Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer 및 LiCl Wash Buffer
dNTP Mix, 분자생물학 등급Thermo ScientificR0192비드 (Section 10.2) 및 변성, Primer Annealing 및 Primer Extension (Section 14.2)에 대한 필-인 반응 (
DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x Thermo ScientificK1081결찰 매개 PCR(섹션 18.1)
EDTA, 0.5M, 멸균 용액, pH 8.0BioShopEDT111용해 버퍼 1-3, 초음파 처리(섹션 4.1) 확인, 고염 세척 버퍼, LiCl 세척 버퍼 및 ChIP 용출 버퍼
에틸 알코올 무수, 100%상업용 알코올P006EAAN초음파 처리(섹션 4.3.3)
포름알데히드, 36.5-38%, 10-15% 함유 메탄올SigmaF8775수확, 가교 및 동결 세포(섹션 1.1)
글리세롤, 시약 등급, 최소 99.5%BioShopGLY002Lysis Buffer 1
글리신, 생명공학 등급, 최소 99%BioShopGLN001수확, 가교 및 동결 세포(섹션 1.2)
글리코겐, RNA 등급Thermo ScientificR0551초음파 처리(섹션 4.3.3)
HEPES, 1 M 멸균 여과 용액, pH 7.3 BioShopHEP003용해 버퍼 1, 고염 세척 버퍼
Klenow Fragment (3->5 exo-)New England BioLabsM0212SdA-테일링 반응(섹션 15.1)
Lambda 엑소뉴클레아제New England BioLabsM0262S비드의 Lambda 엑소뉴클레아제 분해(섹션 11.2)
리가제 인핸서New England BioLabsE7645SNEBNext Ultra II DNA 라이브러리 키트. 비드의 인덱스 어댑터 연결(섹션 9.1) 및 범용 어댑터 연결(섹션 16.1)
리가제 마스터 믹스New England BioLabsE7645SNEBNext Ultra II DNA 라이브러리 키트. 비드의 인덱스 어댑터 결찰(섹션 9.1) 및 범용 어댑터 결찰(섹션 16.1)
염화리튬(LiCl), 시약 등급BioshopLIT704LiCl 세척 버퍼
ChIP용 마그네틱 비드(Dynabeads Protein G)Dynabeads Protein G(ChIP용 마그네틱 비드)Dynabeads Protein G(ChIP용 마그네틱 비드)비드를 사용한 항체 인큐베이션(섹션 5)
DNA 정제용 마그네틱 비드(AMPure XP 비드)Beckman CoulterA63880DNA 추출 (섹션 13.3) 및 DNA 클린업 (섹션 17.1)
자기 랙 (DynaMag-2 자석)Invitrogen12321D섹션에서 많은 단계에서 사용됩니다: 5 - 11, 13
MinElute Gel 추출 키트Qiagen 28604PCR 증폭 DNA의 겔 정제 (섹션 19.2)
N-Lauroylsarcosine 나트륨 염 용액, 30 % 수용액, ≥ 97.0 % (HPLC)Sigma61747용해 버퍼 3
옥틸 페놀 에톡실 레이트 (IGEPAL CA630)BioShopNON999용해 버퍼 1 및 LiCl 세척 버퍼
페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올, 생명 공학 학년 (25 : 24 : 1)BioShopPHE512초음파 처리 검사 (섹션 4.3.1)
phi29 DNA 중합 효소뉴 잉글랜드 BioLabsM0269L비드 (섹션 10.2) 및 변성, 프라이머 어닐링 및 프라이머 확장 (섹션 14.3 및 14.4)
인산염 완충 식염수 (PBS)에 대한 필인 반응, 1x Corning21040CV수확, 가교 결합 및 동결 세포(섹션 1.3) 및 초음파 염색질(섹션 3.1), 비드를 사용한 항체 주입(섹션 5.1)
PowerPac 기본 전원 공급 장치BioRad1645050초음파 처리(섹션 4.3.6) 및 LM-PCR 증폭 DNA의 겔 정제(섹션 19.1)
ProFlex PCR 시스템바이오시스템ProFlex PCR 시스템섹션에서 사용: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 및 18.2
단백질 LoBind 튜브, 2.0 mL Eppendorf22431102Beads (Section 5.2) 및 Chromatin Immunoprecite(Section 6.3)
ProteinAse K Solution, RNA gradeInvitrogen25530049Checking Sonication (Section 4.2) 및 Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3)
Qubit 4.0 FluorometerInvitrogenQ33226Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3)
Quibit dsDNA BR assay 키트InvitrogenQ32853PCR 증폭 DNA의 겔 정제 (섹션 19.3)
Rnase A, Dnase 및 프로테아제가 없는Thermo ScientificEN0531초음파 처리 (섹션 4.3.2) 및 DNA 추출 (섹션 13.2)
염화나트륨 (NaCl), BioReagent SigmaS5886용해 버퍼 1-3, 고염 세척 버퍼
소듐 도데실 설페이트 (SDS), 전기영동 등급BioShopSDS001확인 초음파 처리 (섹션 4.1), 고염 세척 버퍼 및 ChIP 용출 버퍼
초음파 처리 비드 및 15 mL Bioruptor 튜브DiagenodeC01020031초음파 처리 크로마틴 (섹션 3.1 및 3.2)
ThermoMixer F1.5 Eppendorf5384000020섹션 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 및 16.2
Trizma hydrochloride 용액(Tris-HCl), BioPerformance 인증, 1 M, pH 7.4SigmaT219410 mM Tris-HCl Buffer
Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0SigmaT2694용해 버퍼 2, 용해 버퍼 3, 초음파 처리 확인(섹션 4.1), LiCl 세척 버퍼 및 ChIP 용리 버퍼
Ultra II 말단 수리/dA-테일링 모듈(24 rxn -> 120 rxn)New England BioLabsE7546S말단 분취 반응 혼합물 및 말단 분취 효소 혼합물. 비드에 대한 말단 수리 및 dA-테일링 반응 (섹션 8.2)
VWR 미니 튜브 로커, 가변 속도VWR10159-752섹션의 여러 단계로 사용 : 1, 2, 5, 6 및 7
2- [4- (2,4,4- 트리메틸 펜탄 -2- 일) 페녹시] 에탄올, 트리톤 X-100, 시약 등급BioShopTRX506용해 버퍼 1, 초음파 처리 크로마틴 (섹션 3.4) 및 고 염 세척 버퍼
- 확인 응용

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
  2. Patten, D. K., Corleone, G., Magnani, L. Epigenome Editing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. A, J. eltsch, Rots, M. G. 1767, 271-288 (2018).
  3. S....

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