골격근 섬유아세포(Skeletal Muscle Fibroblast)에서 엑소좀의 분리 및 특성 분석(Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts)

Diantha van de Vlekkert; Xiaohui Qiu; Ida Annunziata; Alessandra d'Azzo

doi:10.3791/61127

방법 논문

골격근 섬유아세포(Skeletal Muscle Fibroblast)에서 엑소좀의 분리 및 특성 분석(Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts)

DOI:

10.3791/61127

⸱

2020년 5월 16일

Diantha van de Vlekkert¹ , Xiaohui Qiu¹ , Ida Annunziata¹ , Alessandra d'Azzo¹

¹Department of Genetics, St. Jude Children's Research Hospital

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 1) 성체 마우스 비복근에서 일차 섬유아세포를 분리하고 배양하는 방법과 2) 자당 밀도 구배와 웨스턴 블롯 분석을 결합한 차등 초원심분리 방법을 사용하여 엑소좀을 정제하고 특성화하는 방법을 보여줍니다.

초록

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엑소좀은 거의 모든 세포에서 방출되고 모든 생체액에서 분비되는 작은 세포외 소포체입니다. 이러한 소포를 분리하기 위해 초원심분리, 한외여과 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함한 많은 방법이 개발되었습니다. 그러나 모든 엑소좀이 대규모 엑소좀 정제 및 특성화에 적합한 것은 아닙니다. 여기에는 성체 쥐 골격근에서 분리한 일차 섬유아세포의 배양을 확립한 후 이들 세포의 배양 배지에서 엑소좀을 정제하고 특성 분석하기 위한 프로토콜이 요약되어 있습니다. 이 방법은 순차적 원심분리 단계 후 자당 밀도 구배를 사용하는 것을 기반으로 합니다. 그런 다음 엑소좀 제제의 순도는 표준 마커(예: Alix, CD9 및 CD81)를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 통해 검증됩니다. 이 프로토콜은 전자 현미경, 질량 분석법 및 기능 연구를 위한 흡수 실험을 위해 생체 활성 엑소좀을 분리하고 농축하는 방법을 설명합니다. 쉽게 확장 또는 축소할 수 있으며 다양한 세포 유형, 조직 및 생물학적 체액에서 엑소좀 분리에 적용할 수 있습니다.

서론

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엑소좀은 크기가 30–150nm인 이질적인 세포외 소포체입니다. 그들은 생리학 및 병리학적 과정에서 확립된 핵심 플레이어이며, 조직과 장기에 유비쿼터스 분포를 가지고 있습니다 ^1,2. 엑소좀은 단백질, 지질, DNA 유형 및 RNA 유형의 복잡한 화물을 운반하며, 이는 파생된 세포의 유형에 따라 다릅니다 ^1,2,3. 엑소좀은 서로 다른 기능을 하는 단백질(즉, CD9 및 CD63을 포함한 테트라스파닌)이 풍부하여 융합 현상을 담당합니다. 예를 들어, 열 충격 단백질 HSP70 및 HSP90은 항원 결합 및 제시에 관여합니다. 또한 Alix, Tsg101 및 flotillin은 엑소좀 생물 발생 및 방출에 관여하며 이러한 나노 소포 ^2,3,4의 마커로 널리 사용됩니다.

엑소좀은 또한 수용 세포로 전달될 수 있는....

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프로토콜

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마우스에서의 모든 시술은 세인트 주드 아동 연구 병원(St. Jude Children's Research Hospital), 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee) 및 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 가이드라인에 의해 승인된 동물 프로토콜에 따라 수행되었다.

1. 용액 및 매체 준비

PBS 15.4mL를 20mg/mL 콜라겐분해효소 P 2.5mL(최종 농도 5mg/mL), 11U/mL dispase II 2mL(최종 농도 1.2U/mL 최종 농도) 및 100μL의 1.0M_CaCl2 (최종 농도 5mM)와 혼합하여 분해 용액을 준비합니다.
DMEM 440mL와 FBS 50mL(10%), 펜/연쇄상구균 5.0mL(각각 100U/mL 및 100μg/mL) 및 글루타민 보충제 5.0mL(2mM)를 혼합하여 1차 섬유아세포 배지 500mL(DMEM 완료)를 준비합니다. 0.22μm 기공 크기의 진공 필터로 배지를 필터 멸균합니다.
4°C, 100,000 x g 에서 38.5mL 폴리프로필렌 튜브에 FBS를 하룻밤 동안 초원심분리하여 엑소좀이 없는 혈청을....

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결과

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이 프로토콜은 비용 효율적인 방식으로 대량의 조절된 배지에서 엑소좀을 정제하는 데 적합합니다. 이 절차는 재현성이 높고 일관성이 있습니다. 그림 1 은 생쥐 일차 섬유아세포의 배양액에서 정제된 엑소좀의 투과전자현미경(TEM) 이미지를 보여줍니다. 그림 2 는 표준 엑소좀 마커의 단백질 발현 패턴과 세포질(LDH) 및 ER(칼넥신) 단백질 오염 물질의 부재를 보여줍니다. 그림 3 은 슈크로스 밀도 구배 후 표준 엑소좀 마커(Alix, CD9 및 CD81)의 분포를 보여줍니다.

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그림 1: 마우스 일차 .......

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토론

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이 프로토콜에 설명된 바와 같이 배양 배지에서 엑소좀을 성공적으로 분리하기 위한 중요한 단계는 성체 골격근에서 1차 마우스 섬유아세포 배양을 적절하게 확립하고 유지하는 것입니다. 이러한 배양은 생리학적으로 유사한 조건(골격근의 O₂ 수준은 ~2.5%)을 보장하기 위해 낮은 산소 수준으로 유지되어야 합니다¹⁵. 원발성 섬유아세포는 배양에 너무 많이 통과되면 형질이 바뀝니다. 따라서 이상적인 엑소좀 수율을 위해서는 낮은 통로 수가 필수적입니다. 정제된 엑소좀은 실험 목적으로 즉시 사용하거나 필요할 때까지 -80°C의 부분 표본에서 냉동 보관해야 합니다. 프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 매번 신선하게 준비된 자당 용액을 사용하는 것입니다. 이 방법의 한계는 시간이 많이 걸린다는 것인데, 1차 섬유아세포는 일반적으로 다른 분비 세포와 달리 많은 양의 엑소좀을 분비하지 않기 때문입니다. 따라서 대규모 배양을 사용해야 하며, 이로 인해 많은 양의 조건화된 배지를 처리해야 합니.......

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공개 사항

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저자 중 누구도 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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알레산드라 다조(Alessandra d'Azzo)는 유전학 및 유전자 치료 분야의 JFC(Jewelers for Children) 기부 의장을 맡고 있습니다. 이 작업은 NIH 보조금 R01GM104981, RO1DK095169, CA021764, 멤피스의 아시시 재단, 미국 레바논 시리아 연합 자선 단체의 일부 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10cm 접시	Midwest Scientific, TPP	TP93100
15cm 접시	Midwest Scientific	TP93150
BCA 단백질 분석 키트	Thermo Fisher Scientific, Pierce	23225
소 혈청 알부민 분획 V	Roche	10735094001
CaCl2	시그마	C1016-100G
로터가 있는 원심분리기 5430R FA-35-6-30/ FA-45-48-11	Eppendorf	022620659/5427754008
Chemidoc MP 이미징 시스템	BioRad	12003154
Collagenase P	Sigma, Roche	11 213 857 001	100 mg
cOmplete 프로테아제 억제제 칵테일	Millipore/Sigma, Roche	11697498001
Criterion Blotter 플레이트 전극	포함 BioRad
Criterion TGX stain-free protein gel	BioRad	5678034	10% 18-well, midi-gel
Criterion vertical electrophoresis cell (midi)	BioRad	NC0165100
Dispase II	Sigma, Roche	04 942 078 001	중성 프로테아제, grade II
Dithiothreitol	Sigma/Millipore, Roche	10708984001
둘베코' s 모디프레이션 이글스 미디엄	코닝	15-013-CV
둘베코' s 인산염 완충 식염수	Corning	21-031-CV
에탄올 200 증거	Pharmco by Greenfield Global	111000200
Falcon 50 mL 원추형 원심 분리기 튜브	Corning	352070
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437-028
Fluostar Omega 다중 모드 마이크로 플레이트 리더	BMG Labtech
GlutaMAX 보충제	Thermo Fisher Scientific, Gibco	35050-061
염산	Fisher Scientific	A144S-500
Immobilon-P 전사막	Millipore	IPVH00010
Laemmli 샘플 버퍼 (4x)	BioRad	1610747
마그네슘 아세테이트 용액	Sigma	63052-100ml
무지방 분유	LabScientific	M-0842
O₂/CO₂ 인큐베이터	Sanyo	MC0-18M
페니실린-스트렙토마이신	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15140-122	10,000 U/ml
프리미엄 마이크로 원심분리기 튜브	Fisher Scientific, Midwest Scientific	AVSC1510	1.7 mL
보호 일회용 메스	Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker	372610
러닝 버퍼	BioRad	1610732
염화나트륨	Fisher Scientific, Fisher Chemical	S271-3
Stericup 퀵 릴리스-GP 멸균 진공 여과 시스템	Millipore	S2GPU05RE	500 mL
멸균 세포 여과기(70 mm)	Fisher Scientific, Fisher 브랜드	22-363-548
자당	Fisher Scientific, Fisher Chemical	S5-500
SuperSignal west Femto	Thermo Fisher Scientific	34096
박막 폴리프로필렌 튜브	Beckman Coulter	326823
Transfer buffer	BioRad	16110734
Trichloroacetic Acid	Sigma	91228-100G
Tris base	BioRad	1610719
Triton-X100 솔루션	Sigma	93443-100mL
TrypLE Express Enzyme	Thermo Fisher Scientific, Gibco	12604-013	페놀 레드
없음 Tween-20	BioRad	#1610781
Ultra-centrifuge Optima XPM	Beckman Coulter	A99842
Ultra-clear tube (14x89 mm)	Beckman Coulter	344059
Ultra-clear tubes (25x89 mm)	Beckman Coulter	344058
수조 Isotemp 220	Fisher Scientific	FS220

1704070

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H.

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골격근 섬유아세포(Skeletal Muscle Fibroblast)에서 엑소좀의 분리 및 특성 분석(Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts)

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서론

프로토콜

결과

토론

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참고문헌

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