CENP-A 유비쿼터스는 세포 분열 사이의 분화를 통해 계승되고 세포 생존가능성에 필수적입니다. 여기서 우리는 EYFP 태그CENP-A (EYFP-CENP-A) 단백질의 유비쿼터션을 확인하기 위해 질량 분광분석 분석을 설명합니다.
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방법 논문
EYFP 태그CENP-A(EYFP-CENP-A)의 유비쿼터션을 식별하기 위한 질량 분광분석
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이 논문에서
요약
초록
운동장과 원로메머의 구조와 역학을 연구하는 것은 염색체 불안정성(CIN) 및 암 진행을 이해하는 데 중요합니다. 센트로메르의 염색체 위치와 기능(즉, 중심정체성)이 어떻게 결정되고 정확한 염색체 분리에 참여하는가하는 것은 근본적인 질문입니다. CENP-A는 원로메르 정체성의 비DNA 지표(후생유전학 마크)로 제안되며, CENP-A 유비쿼터틸화는 세포 분열 사이의 분화를 통해 계승되고 세포 생존가능성에 필수적이다.
여기서 우리는 CENP-A K124R 돌연변이 단백질에 EYFP 태그로 인해 다른 리신에서 유비쿼터틸화가 유도된다는 것을 건의하는 EYFP-CENP-A K124R 돌연변이의 유비쿼터티화를 식별하기 위해 질량 분광 분석을 설명합니다. EYFP-CENP-A K124R의 리신 306(K306) 유비쿼터티션이 성공적으로 확인되었으며, 이는 대량 분석 분석을 통해 CENP-A의 리신 56(K56)에 해당하는 것으로 확인되었다. 주의 사항은 단백질의 기능을 분석하는 도구로서 GFP/EYFP 또는 고분자량 단백질의 태깅을 사용하는 데 대해 논의된다. 현재 기술적 한계는 또한 보편성 대역의 검출, 사이트별 유비쿼터틸화(들)의 식별, 그리고 전체 세포 주기 동안 살아있는 세포 또는 특정 단일 세포에서 의 편형의 시각화를 위해 논의된다.
여기에 제시된 질량 분광분석 방법은 다른 태그 및 기타 센트로메레-키네토초레 단백질을 가진 인간 CENP-A 단백질에 적용될 수 있다. 여러 분석/분석으로 구성된 이러한 결합 방법은 유비쿼터틸레이션의 기능적 역할을 식별하는 데 관심이 있는 연구자에게 권장될 수 있습니다.
서론
대부분의 진핵생물에서 스핀들 마이크로투볼은 각 염색체의 단일 영역에 부착해야 하며, 이는 센트로메르라고 불릴 것이다. 운동장은 센트로메르에 있는 단백질의 복합체입니다. 센트로메트와 운동장 단백질의 움직임과 운동장 및 백혈구의 구조를 연구하는 것은 염색체 불안정성(CIN) 및 암 진행을 이해하는 데 중요합니다. 주요 질문은 센트로메어의 염색체 위치와 기능(즉, 센트로메어 정체성)이 어떻게 결정되고 정확한 염색체 분리에 어떻게 참여하는지입니다. 대부분의 종에서 CENP-A라고 불리는 특정 히스톤과 같은 단백질을 함유한 특수 뉴클레오종의 존재는 원로메르 정체성을 정의합니다. 따라서 CENP-A는 센트로메르 정체성의 비 DNA 지표(후생유전학 마크)가 될 것을 제안된다. CENP-A가 인간의 중심 정체성을 정의하는 방법의 메커니즘을 해명하는 것이 중요합니다.
홀리데이 접합 인식 단백질(HJURP)은 CENP-A-특이적 샤페론으로 향로골 뉴클레오좀1,,2,,3로CENP-A를 침전시한다. 우리는 이전에 CUL4A-RBX1-COPS8 E3 리개구세가 리신 124 (K124) 및 센트로메어 ....
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프로토콜
1. pBabe-EYFP-CENP-A 구문의 세포 배양 및 레트로바이러스 트랜스페션
참고: EYFP-CENP-A는 pBabe-EYFP-CENP-A로부터 내인성 CENP-A와 유사한 단백질 수준에서 발현된다. 총 세포 CENP-A 단백질은 RPE-1 CENP-A-/-세포6에서와같이 Cre 재조합에 의한CENP-A-/F 본선의 중단 후 이 EYFP-CENP-A로 대체된다.
- 293T 패키징 셀을 사용하여 레트로바이러스를 함유하는 상체제제의 제제.
- 일 0: 6웰 배양 판에 293T 포장 셀을 확산 (1.0 x 106 셀 / 잘). 10% FBS와 1% 페니실린 연쇄 절제술을 가진 고혈당 DMEM에 있는 배양 세포. 24h에 대해 5% CO2의 대기에서 37°C의 세포를 배양한다.
참고: 최적의 결과를 얻으려면 시딩에 사용할 세포 밀도를 경험적으로 결정합니다. - 1일차: 확산 후 23시간 전후의 경유 반응을 준비한다(24h 포인트는 0h 포인트). 각 pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161), 및 pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164....
- 일 0: 6웰 배양 판에 293T 포장 셀을 확산 (1.0 x 106 셀 / 잘). 10% FBS와 1% 페니실린 연쇄 절제술을 가진 고혈당 DMEM에 있는 배양 세포. 24h에 대해 5% CO2의 대기에서 37°C의 세포를 배양한다.
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결과
EYFP-CENP-A K124 돌연변이는 유비쿼터틸화, HJURP와의 상호 작용 및 백혈구 국소화의 결함 없음을 나타내며 세포 치사성도 없다. 여기서 파키네티 외(2017)6에 의해 보고된 시스템은 재구성되었다: 디플로이드 인간(RPE-1) 세포에서 하나의 중단및 하나의 ''플로시드'를 운반하는 CENP-A 대립구(CENP-A-/F), EYFP-CENP-A는 pBabe-EYFP 레트로바이러스 벡터로부터 발현되었다.CENP-A-/F 이 시스템에서는CENP-A-/F 제일로부터 내인성 CENP-A의발현이 Cre재조합6에의해 중단될 수 있다. 내인성 CENP-A의 손실을 구출하는 EYFP-CENP-A WT 또는 K124R돌연변이(도 1A)의유전자 구조는 레트로바이러스 통합이 수행되었.......
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토론
여기서 우리는 EYFP-CENP-A K124R 돌연변이의 유비쿼터티화를 식별하기 위한 질량 분광분석 방법을 설명하여 EYFP 태깅이 CENP-A K124R 돌연변이 단백질8에서다른 리신에서 유비쿼터티화를 유도한다는 것을 시사한다. 그 결과, EYFP-CENP-A K124R에서 리신 306(K306)에 대한 유비쿼터션을 성공적으로 확인했으며, 이는 대량 분석 분석을 통해 CENP-A의 리신 56(K56)에 해당합니다. 여기서 설명된 질량 분광분석은 CENP-A WT-Flag12의리신 124(K124) 유비쿼터티화 부위를 이전에 식별하는 모방 방법이다. 따라서, 이 방법은 다른 태그 및 그밖 centromere 운동장 단백질을 가진 인간 CENP-A 단백질에 적용될 수 있습니다. LC-MS/MS를 기반으로 하는 질량 분광분석은 일반적으로 광범위한 단백질의 잠재적인 번역 후 변형(PTM)을 식별하도록 허용됩니다. 여러 분석/분석(즉, 생체 유비쿼터스.......
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공개 사항
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
난징대학교 모델동물연구센터의 리차오준 에게 대량 분석해 주셔서 감사합니다. Yanmini Dalal, 후카가와 타츠오, 모델 동물 연구 센터, 난징 대학 및 Greehey 어린이 암 연구소의 현재 연구원들에게 유용한 토론, 실험 지도 및 시약에 감사드립니다. 돈 W. 클리블랜드, 다니엘레 파치네티, 얀미니 달, 민부이, 구스타보 더블유 리온, 존 톰슨, 로렌스 S. 커쉬너, 암루타 아슈테카르, 벤 E. 블랙, 글레니스 A. 로그스돈, 겐지 토고, 새벽 S. 챈들러에게 절경 선물을 주셔서 감사합니다. Y.N. 장쑤성 '이중일급' 건설기금, 장쑤성 자연과학기금(SBK2019021248), 장쑤성제16대 6대 인재봉우리펀드(TD-SWYY-001), 장쑤성 '외국인 전문가 백인재 프로그램' 기금(SBK2019000000000000000000000000000000), 309개 국립과학재단(306998년) 이 연구는 부분적으로 NCI 보조금 R21 CA205659에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Equpiments/Tools | |||
| 0.5 ml 단백질 저결합 튜브 | Eppendorf | 022431064 | 질량 분석 |
| 10cm 세포 배양 접시 | BIOFIL/JET, 중국 | 700224 | 10cm 조직 배양 접시 (Yohei lab, PN63) |
| 6웰 세포 배양 클러스터 | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-웰 배양 |
| CentriVap | LABCONCO | - | 질량 분석 분석을 위한 진공 건조 펩타이드용 탁상용 진공 농축기 |
| ChromXP C18CL, 120A, 15cm x 75 μ m | Eksigent Technologies | 805-00120 | 질량 분석 분석용 액체 크로마토그래피(RPLC) 컬럼 |
| HCX PL APO 100x 오일 이멀젼 렌즈 | 라이카 | LEICA HCX PL APO NA 1.40 오일 PHE | 100X 오일 이멀젼 렌즈 |
| HCX PL APO 63x 이멀젼 렌즈 | 라이카 | LEICA HCX PL APO NA 1.40 오일 PH 3 CS | 63X 이멀젼 렌즈 |
| Immobilon-FL PVDF 트랜스퍼 멤브레인 | EMD Millipore | IPVH00010 | 웨스턴 블롯 |
| Leica DM IRE2 전동 형광 현미경 | Leica | 전동 | 형광 현미경 |
| Leica EL6000 소형 광원 | Leica | 광 여기용 외부 광원 | |
| Micro Cover 유리(22mm x 22mm) | Surgipath | 105 | Cover 유리(22mm x 22mm) |
| 모델 V16-2 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 장치 | Apogee 전기영동/CORE 생명 과학 | 31071010 | 겔 전기영동 장치 I 더 큰 SDS-PAGE 겔 |
| nanoLC.2D | Eksigent Technologies | - | 질량 분석 분석을 위한 액체 크로마토그래피 시스템 |
| NuPAGE 4%-12% Bis-Tris 단백질 겔 | Thermo Fisher | NP0335BOX | 질량 분석 |
| 분석을 위한 상용 4%-12% Bis-Tris 단백질 겔Olympus FLUOVIEW FV3000 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 | Olympus | - | 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| ORCA-R2 디지털 CCD 카메라 | Hamamatsu | C10600-10B | CCD 카메라 |
| PAP 펜 | 바인딩 사이트 | AD100.1 | 면역형광 염색 조직의 발수 장벽용 |
| CULTURE DISHES 10CM | VWR | 25382-166 | 10cm 조직 배양 접시 |
| 젤 실행용 수직 전기영동(빅 사이즈) | Junyi, China | JY-SCZ6+ | 더 큰 SDS-PAGE 젤을 적용하는 젤 전기영동 장치 II(Yohei lab, PE23) |
| VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
| primary antibodies | |||
| Anti-CENP-A 항체 | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | 마우스 단클론 항체 |
| Anti-CENP-B 항체 | Novus Biologicals | H00001059-B01P | 마우스 단클론 항체 |
| Anti-GAPDH | ABCAM | ab37168 | Rabbit polyclonal 항체 |
| anti-GAPDH | Invitrogen | PA1987 | Rabbit polyclonal 항체 |
| 항-GFP 항체 | ANTI #76 (Homemade antibody) | Rabbit polyclonal antibody | |
| anti-HA (3F10) | Roche | 11815016001 | Rat monoclonal antibody |
| anti-HJURP | Proteintech Group | 15283– 1-AP | 토끼 다클론 항체 |
| 항 유비퀴틴 | 베틸 연구소 | A300-317A-1 | 토끼 다클론 항체 |
| Reagents | |||
| Bio-Rad 단백질 분석 | Bio-Rad | 500-0006 | 단백질 농도 측정을 위한 상용 단백질 분석 시약 I(0.1% SDS와 호환 가능) |
| Branson SONIFIER 450 | 초음파 발생기 | ||
| Branson Ultrasonics 초음파 발생기 Microtip 스텝, 솔리드, 나사산 9.5mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | 초음파 처리 용 디스럽터 혼 |
| Branson 초음파 초음파 발생기 Microtip 테이퍼 6.5mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | 초음파 처리 용 Microtip |
| 버퍼 A1 | - | 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 m NaCl; 0.5 % Nonidet P-40; 0.5 % 데 옥시 콜레이트; 0.5 % SDS; 1 mM EDTA; 완전한 EDTA 무료 프로테아제 억제제 시약 | |
| 완전한 EDTA 프리 프로테아제 억제제 칵테일 Roche | 11-873-580-001 | Sciences 용 완전한 EDTA 프리 프로테아제 억제제 시약 | |
| 질량 분석을위한 CAS 6104-59-2 | Coomassie 블루 솔루션 | ||
| 크리스탈 바이올렛 용액 (2.3 % 크리스탈 바이올, 0.1 % 암모늄 옥시 레이트, 20 % 에탄올) | SigmaI-Aldrich | HT90132-1L | 콜로니 염색 |
| 용 DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | 핵 염색 DMEM |
| : F12 매체 | ATCC | 30-2006 | DMEM : F12 매체 |
| 소 태아 혈청, 인증, 열 비활성화, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (소 태아 혈청) |
| 고포도당 DMEM (Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 매체) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM |
| Lipofectamin 3000 | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent I for chemical transfection |
| Lipofectamin 3000, P3000 solution | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent II for chemical transfection |
| Methanol | Fisher A412-4 | Fixation | reagant |
| 무지방 분유(카네이션 분유 대체품 승인) | Fisher Scientific | NC9255871(재주문 번호 190915; Lot# 90629) | 무지방 탈지유 |
| Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | 환원 혈청 매체 |
| p-페닐렌디아민 | SIGMA-SLDRICH | P6001 | 매체 장착용 |
| 페니실린, 스트렙토마이신; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | 페니실린-스트렙토마이신 |
| 폴리-L-라이신 솔루션 | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | 폴리-L-라이신, 0.1% w/v, 물 중 |
| 폴리에틸렌이민 [PEI]; 1.0 mg/ml | Polysciences | 23966– 2 | 화학적 트랜스펙션을 위한 트랜스펙션 시약 |
| III: 단백질 A 세파로스 CL-4B 비드, | GE Healthcare/Amersham | 17-0963-03 | pQCXIP-EYFP-CENP-A를 사용한 생체 내 유비퀴틸레이션 분석을 위한 단백질 A 세파로스 CL-4B 비드, |
| 웨스턴 블롯 스트리핑 버퍼 | Thermo Scientific | PI21059 | 웨스턴 블롯 스트리핑 버퍼, I |
| 염기서열분석 등급 트립신 | Promega | V5111 | 질량 분석 |
| SuperSignal West Femto 최대 감도 기판 | Thermo | 34095 | 초고감도 강화 화학발광(ECL) 기판 |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | 멸균 조직 배양 등급 |
| 물 웨스턴 블롯 스트리핑 버퍼 II((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)- | - | Western Blot Stripping Buffer II | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Softwares | |||
| Acquisition FV31S-SW software | Olympus-Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) | ||
| 분석 FV31S-DT software | Olympus | - | Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| cellSens Dimension 소프트웨어 Ver. 1. 18 | Olympus-Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/) | ||
| Image Studio 분석 소프트웨어 ver 4.0 | LI-COR Biosciences-Software | D | |
| Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | - | 면역 얼룩 감지를 위한 화학발광 이미저 |
| Odyssey CLx 적외선 이미징 시스템 | LI-COR Biosciences | - | 면역 블롯 감지를 위한 적외선 이미징 시스템 |
| OpenCFU 세이프트웨어 | - | - | 콜로니 카운팅용 (http://opencfu.sourceforge.net/) |
| Openlab 버전 5.5.2. 과학 이미징 소프트웨어 | Improvision/PerkinElmer-Software | A | |
| ProteinPilot 소프트웨어 버전 4.5 | AB SCIEX-Software | F 질량 분석 | |
| 용 수량 1 차원 분석 소프트웨어 | Bio-Rad-Software | E | |
| TripleTOF 5600+ System | AB SCIEX-Mass | Analysis Instrument | |
| Volocity 버전 6.3 3D 이미지 분석 소프트웨어(Volocity Acquisition) | PerkinElmer-Software | B1 | |
| Volocity 버전 6.3 3D 이미지 분석 소프트웨어(Volocity Quantification) | PerkinElmer-Software | B2 |
참고문헌
- Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
- Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell<....
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재인쇄 및 허가
