쥐에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포의 CCL5 유도된 이동의 실시간 화상 진찰

요약

이 프로토콜은 살아있는 동물 내 생물체 검사를 사용하여 실시간으로 CCL5 매개 periosteal skeletal 줄기 세포 이동의 검출을 설명합니다.

초록

Periosteal 골격 줄기 세포 (P-SSC)는 평생 뼈 유지 보수 및 수리에 필수적이며 골절 치유를 향상시키기 위한 치료법 개발에 이상적인 초점입니다.  Periosteal 세포는 골절 치유를 위한 새로운 연골 세포 및 골세포를 공급하기 위하여 상해로 급속하게 이동합니다. 전통적으로, 세포 이동을 유도 하는 사이토카인의 효능은 트랜스웰 또는 스크래치 분석 능력을 수행 하 여 체외에서 만 실시 되었습니다. 다광원 여기를 이용한 인트라바이탈 현미경법의 발전과 함께, 최근 1) P-SSC가 CCL5로 알려진 CCR5 리간드를 이용한 철새 유전자 CCR5 및 2) 치료를 발현하는 것으로 밝혀졌으며, CCL5에 대응하여 골절 치유및 P-SSC의 이동을 향상시킨다. 이러한 결과는 실시간으로 캡처되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 CCL5로 치료 후 부상으로 칼변이 봉합사 골격 줄기 세포(SSC) 틈새 에서 P-SSC 마이그레이션을 시각화하는 프로토콜이다. 이 프로토콜은 마우스 구속 및 이미징 마운트의 구성, 마우스 칼바리아의 수술 준비, 칼바리아 결함 유도 및 시간 경과 이미징의 수집에 대해 자세히 설명합니다.

서론

골절 수리는 배아 골격 발달 및 리모델링과 구별되는 동적 다세포 과정입니다. 이 과정에서 손상된 조직으로부터의 부상 신호 유도는 골격 줄기/전구 세포의 신속한 모집, 증식 및 후속 분화로 이어지며, 이는 골절의 전반적인 안정성 과 고정에 모두 중요합니다¹. 특히, 골절 치유의 초기 단계는 주로 periosteal 상주 세포2에 기인하는 부드러운 callus 형성을 필요로^한다2. 뼈가 다치면, periosteal 세포의 부분 집합은 급속하게 반응하고 periosteum 내의 명백한 골격 줄기/선조 세포 집단의 존재를 연루하는 ^callus3 내의 새로 분화한 연골 중간체 및 골에 기여합니다. 따라서, periosteum-거주자 골격 줄기 세포(SSC)의 식별 및 기능적 특성화는 퇴행성 뼈 질환 및 뼈 결함에 대한 유망한 치료 접근법을 구성한다⁴.

SSC는 골수를 포함하여 다중 조직 위치에 상주하는 것으로 생각됩니다. 골수와 유사하게, 골성/연골성 SSC도 골수^4,5,6

프로토콜

모든 마우스는 병원체가 없는 조건에서 유지되었고, 모든 절차는 베일러 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 마우스 준비

1. 크로스 Mx1-Cre17 및 Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (톰)¹⁸ 마우스 (잭슨 연구소에서 구입) αSMA-GFP 마우스 (박사에 의해 여기에 제공) 이보 칼라지치와 헨리 크로넨버그)는 Mx1-Cre⁺Rosa26-tomato⁺α SMA-GFP⁺(Mx1/토마토/αSMA-GFP) 기자 마우스(그림 2A)를 생성한다.
2. Mx1-Cre 유도의 경우, 10 일 동안 격일로 25 mg / kg pIpC로 마우스를 주입하십시오.
3. 야생형 C57BL/6 마우스(WT-BMT)¹⁹에서 1 x ¹⁰⁶개의 전체 골수 단핵 세포의 정맥 이....

결과

골격 선조는 철새 또는 순환 잠재력을 가지고 제안되었습니다²⁰. 최근, Mx1-Cre⁺Rosa26-Tomato⁺α SMA-GFP⁺(Mx1/토마토/αSMA-GFP) 기자 마우스가 생성되었으며, P-SSC는 Mx1⁺α SMA⁺ 듀얼 라벨링(그림 2A,B)으로 표시되어 있습니다. Mx1⁺α SMA⁺ P-SSC의 실질적인 마이그레이션은 상해 후 24-48h ¹¹ 내에서 봉합사 메센치메에서 발생했습니다.  또한 칼바리아 결함 후 실시간으로 24시간 동안 생체 내 P-SSC 마이그레이션을 검출할.......

토론

뼈 치유 하는 동안, periosteal 세포는 새로 분화 된 연골 세포와 부상 ^callus3 내에서 골세포의 주요 소스입니다. 골수와 유사하게, 골성/연골성 SSC도 골수^4,5,6에서 확인되었다. 내인성 P-SSC 기능적 특성을 평가하는 것은 기술적으로 어려운 일입니다. 종종 SSC의 철새 역학은 시험관 내에서 평가되므로 생체 시스템의 해당 해석이 어려워지는 경우가 많습니다. 살아있는 동물 내 현미경 검사법과 추가 리포터 마우스 (Mx1/토마토/αSMA-GFP)의 생성에 최근 발전으로 인해 개별 세포의 생체 내 추적이 가능해졌습니다. 따라서, 이 방법은 실시간으로 CCL5 유도 된 P-SSC 마이그레이션의 생체 내 기록을 허용한다.

이미징 일관성에 영향을 미칠 수 있는 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
½ ” 광학 포스트	ThorLabs	TR2	이미징 마운트용
1 mL 주사기	BD	309659
27G 바늘	BD PercisionGlide	305111
29G 인슐린 주사기	McKesson	102-SN05C905P
50 mL 코니콜 튜브	Falcon	352098	마우스 구속용
조정 가능한 각도 플레이트	Renishaw	R-PCA-5023-50-20	이미징 마운트
알코올 물티슈	Coviden	6818
betadine 외과 스크럽	Henry Schen	67618-151-16
부프레노르핀 SR-LAB	ZooPharm		1mg/mL 서방형
콤보 III	직원 수의사로부터 획득	N/A	37.6 mg/mL 케타민; 1.9 mg/mL 자일라진; 0.37 mg/mL 아세프로나진
커버슬립	피셔	12-545-87	24 x 40 프리미엄 슈퍼슬립
파인 팁 셉트	FST	11254-20
케타민	KetaVed	50989-161-06	100 mg/mL
라이카 TCS SP8MP with	DM6000CFS Leica Microsystems	N/A
Matrigel	R & D Systems	344500101
의료용 테이프	McKesson	100199	3" x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m)
Methocellulose	Electron Microscopy Sciences	19560
Microdissection scissors	FST	1456-12
전동 스테이지	Anaheim 자동화	N/A
바늘 홀더	FST	12500-12
비흡수성 봉합	McKesson	S913BX	모노필라멘트 나일론 5-0 부착형 비흡수성 봉합사 C-1 역절단 바늘
안과 연고	럭비	0536-1086-91
RANTES	Biolegend	594202	10 µ g/50 &마이크로;
L ½용 직각 클램프; ” 포스트, 3/16" Hex	ThorLabs	RA90	이미징 마운트용
스프링 장착 3/16" 육각 잠금 ¼ ” 나비 나사	ThorLabs	TS25H	이미징 마운트용
멸균 면봉	Henry Schen	100-9249
멸균 DPBS (1x)	Corning	21-030-CV
멸균 드레이프	McKessen	25-517
수술용 장갑	McKessen	3158VA
삼중 항생제 연고	Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc.	51672-2120-2
Vacutainer 혈액 수집 세트	BD	REF 367298	25G 버터플라이 바늘 주입 세트(12인치 튜브

사 포함)