여기에 설명된 담배 연기 추출물이 폐 상피 세포의 세균 성 식민지화에 어떻게 영향을 미치는지 연구하는 프로토콜이 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
담배 흡연은 폐 기종및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)의 주요 병인원인입니다. 담배 흡연은 또한 호흡기내 세균 감염에 대한 감수성을 촉진합니다. 그러나, 인간의 폐 상피 세포에 있는 세균성 감염에 담배 연기가 나는 의 효력은 아직 철저히 공부되지 않았습니다. 여기에 설명된 담배 흡연 추출물(CSE), CSE를 함유한 인간 폐 상피 세포의 치료, 세균 감염 및 감염 결정의 준비를 위한 상세한 프로토콜이 기재되어 있다. CSE는 종래의 방법으로 제조하였다. 폐 상피 세포는 CSE 처리된 세포가 3h. CSE 처리된 세포에 대해 4% CSE로 처리된 다음, 10의 감염(MOI)의 복합성에서 슈도모나스로 감염되었다. 세포의 세균적 하중은 세 가지 다른 방법에 의해 결정되었다. 결과는 CSE가 폐 상피 세포에 있는 슈도모나스 부하를 증가했다는 것을 보여주었습니다. 따라서 이 프로토콜은 폐 상피 세포의 세균 감염에 대한 담배 연기의 영향을 연구하기 위한 간단하고 재현 가능한 접근법을 제공합니다.
서론
담배 흡연은 전 세계 수백만 명의 공중 보건에 영향을 미칩니다. 폐암및 만성폐쇄성 폐질환(COPD)을 포함한 많은 해로운 질환은 담배 흡연1,2와2관련이 있는 것으로 보고된다. 담배 흡연은 호흡기33, 4,4,5에서급성 미생물 감염에 대한 감수성을 증가시킨다. 더욱이, 장착 증거는 담배 흡연이 많은 만성 질환의 발병을 향상시킨다는 것을 증명6,,7,,8. 예를 들어, 담배 흡연은 COPD 악화를 일으키는 바이러스성 또는 세균성 감염을 증가시킬 수 있습니다9. 에인디컬쳐가 COPD의 급성 악화에 에 기여하는 세균성 병원체 들 중, 기회성 그람 음성 혈관 병원균, 슈도모나스 아루기노사,가난한 예후 및 더 높은 사망과 상관 관계가 있는 감염을 일으킨다10,
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프로토콜
1. 100% CSE 준비
- 60 mL 주사기로 혈청 없는 세포 배양 매체(BEAS-2B 세포를 위한 DMEM/F12; HSAEC 세포를 위한 기도 상피 세포 기저 배지)를 10mL로 그립니다.
- 적절하게 다듬어진 1mL 파이펫 팁을 주사기노즐에 전자담배(3R4F)를 고정시키는 어댑터로 부착합니다.
- 담배의 필터를 제거합니다. 팁 어댑터에 담배를 부착하고 담배를 연소.
- 40mL의 연기가 함유된 공기를 10mL의 혈청 프리 미디어에 그립니다. 격렬하게 흔들어 서 중간과 연기를 혼합 (30 무승부 당).
- 담배가 완전히 소진 될 때까지 ~ 7 분 에서 약 11x에 대해 1.4 단계를 반복하십시오.
- 0.22 μm 필터로 훈제 매체의 10mL를 필터링하여 미생물및 용해성 입자를 제외합니다. 폐쇄된 멸균 튜브로 옮김합니다. 후속 분석 전에 30분 이상 100% CSE를 준비합니다.
2. 슈도모나스 문화
- 37°C에서 야간 배양을 위한 트립틱 콩 육수(TSB) 한농어판으로 냉동 P. aeruginosa(균주 PAO143) 또는 P. 형광미굴라(균주 PAO143)를 접종하였다.
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결과
다이어그램은 그림 1에서프로토콜을 설명하는 데 사용됩니다. 폐 상피 BEAS-2B 세포는 CSE로 처리되고 슈도모나스로도전하였다. 배양 배지에서 슈도모나스는 첨가된 젠타마이신에 의해 살해되었고 세포는 낙하판 분석, RT-qPCR 검출을 거쳐 슈도모나스 리보섬 16S RNA, 및 유동 세포측정을 하였다. 대조군과 비교하여 CSE 치료는 낙하판방법(도 2)에서세균 감염이 크게 증가하였다. 이에 상응하여, CSE는 HSAEC에서 세균 부하에 영향을미쳤다(그림 3). 세포 생존력은 4% CSE 처리의 3 시간 후에, 슈도모나스 감염의 1 h에서, 또는 젠타마이신 처리의 1 h에서(도 4 그림 5 도
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토론
폐 상피 세포로 세균성 침입은 세균 감염의 병인에 있는 결정적인 단계입니다. 세포내 세균 성 침입 과정은 다음 세 단계로 나눌 수 있습니다 : 첫째, 박테리아접촉및 그들의 기색 세포를 사용하여 상피 세포의 표면에 부착. 둘째, 박테리아는 내산화를 거치거나 세포막을 관통한다. 마지막으로, 박테리아는 세포 방어 메커니즘25,,26을성공적으로 탈출하면 세포를 복제하고 식민지화한다. 폐 미세 파기에서 세균 감염의 관찰을 위한 접근은 오래 개발되었지만 폐 상피 세포에 대한 제한된 지식으로27,,28. 이 연구는 세 가지 접근법을 통해 폐 상피 세포에 있는 세균부하를 결정했습니다: 낙하 판 분석, 슈도모나스 리보솜 16S RNA를 위한 RT-qPCR, 및 유동 세포측정법. 세 가지 접근 방식은 모두 비슷한 민감도와 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 건강 R01의 국가 학회에 의해 부분적으로 지원되었다 HL125435 및 HL142997 (CZ에).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 50mL 주사기 | BD Biosciences | ||
| 기도 상피 세포 기저 매체 | ATCC | PCS-300-030 | |
| 박테리아 쉐이커 | ThermoFisher Scientific | ||
| 기관지 상피 세포 성장 키트 | ATCC | PCS-300-040 | |
| 세포 계수기 | Bio-Rad | ||
| CFX96 Real-Time PCR 시스템 | Bio-Rad | ||
| 고용량 RNA-to-DNA 키트 | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
| HITES 매체 | ATCC | ATCC 30-2004 | |
| 인간 BEAS-2B 세포 | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
| 인간 1차 소기도 상피 세포 | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
| LSRII 유세포 | BD Biosciences | ||
| 닛콘 컨포칼 현미경 | Nikkon | ||
| OD reader | USA Scientific | ||
| PCR 프라이머 | ITD | ||
| 녹농 | ATCC ATCC | 47085 | PAO1-LAC |
| 슈도모나스 플루오레센스 미굴라 | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
| 연구용 담배(3R4F) | 켄터키 대학교 | TP-7-VA | |
| RNeasy 미니 키트 | Qiagen | 74106 | |
| Transprent PET Transwell 인서트 | Corning Costar | ||
| Tryptic Soy Broth | BD Biosciences |
참고문헌
- Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
- Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P.
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