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방법 논문

카노르하비티스 예르간에서 노화와 관련된 신경 퇴행성 질환 모델링

5.2K 조회수

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DOI:

10.3791/61169

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2020년 8월 15일

이 논문에서

요약

여기에서, 우리는 노화와 관련된 신경 퇴행성 질환의 세포 및 분자 기초를 모니터링하고 해부하기 위해 과활성화 이온 채널 유도 괴사 및 단백질 골재 유도 신경 독성을 포함하여 일부 다목적 선충 모델을 활용하여 널리 접근 할 수있는 방법론을 소개하고 설명합니다.

초록

인간의 신경 퇴행성 병리학과 싸우고 그들의 만연한 사회 경제적 영향을 관리하는 것은 글로벌 우선 순위가되고있다. 인간의 삶의 질과 의료 시스템에 대한 해로운 영향에도 불구하고, 인간의 신경 퇴행성 질환의 대부분은 여전히 불치의 예방 할 수없는 남아있다. 따라서 이러한 질병에 대한 새로운 치료 개입의 개발은 시급한 시급성이되고 있습니다. 뉴런 회로와 기능의 노화와 관련된 악화는 낮은 벌레 Caenorhabditis elegans 및 인간과 같은 다양한 유기체에서 진화적으로 보존되어 기본 세포 및 분자 메커니즘의 유사성을 나타냅니다. C. elegans는 노화 중 신경 활동과 품질 관리를 평가하기 위해 잘 특징인 신경계, 신체 투명성 및 유전 및 이미징 기술의 다양한 레퍼토리를 제공하는 고가성 유전 모델입니다. 여기서, 우리는 과활성화 이온 채널 유도 괴사(예를 들어, deg-3(d) 및 mec-4(d)및 단백질 집계(예를 들어, α-syunclein 및 poly-글루타메이트)를 포함하여 일부 다목적 선충 모델을 활용하여 세포 및 세포 노화의 세포 분석과 세포 의 세포 적고를 모니터링 및 절제하는 방법을 소개하고 설명합니다. 이러한 동물 신경 변성 모델의 조합, 세포 죽음 변조기에 대 한 유전 및 약리학적 화면과 함께 신경 기능의 나이 관련 고장의 전례 없는 이해로 이어질 것입니다 및 인간의 건강 및 삶의 질에 광범위 한 관련성에 중요 한 통찰력을 제공할 것입니다.

서론

지난 2 년 동안, C. elegans 널리 괴사 세포 죽음의 분자 메커니즘을 조사 하는 모델 유기체로 사용 되었습니다. C. elegans는 매우 잘 특성화되고 매핑된 신경계, 투명한 신체 구조 및 노화 전반에 걸쳐 생체 외세포 기능 및 생존을 모니터링하는 유전 및 이미징 방법의 다양한 레퍼토리를 제공합니다. 따라서, 신경 변성의 몇몇 C. elegans 유전 모형은 이미 신경 생존성을 평가하기 위하여 개발되었습니다. 특히, 잘 설명되고 사용되는 선충 모델은 단백질,집계4, 5, 6, 7, 8, 9,10 및 열사병 11, 12, 그 외 에서 단백질,집계1,,4,5,,6,7,78,9,10 및 열사병11, 12,그 외에서 증가된 단....

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프로토콜

1. 음과 이온 채널에 의해 유도 된 괴사 세포 죽음

참고: 메크-4 및 deg-3을 포함한 degenerins유전자 패밀리의 기능성 돌연변이는 웜3에서메카노센션에 필요한 6개의 터치 수용체 뉴런의 괴사 세포 사멸을 유발하는 활동적인 이온 채널의 생성을 초래한다. 괴사는 degenerins의 비정상적인 자극에 의해 유도된 포유류에 있는 흥분 독성에 몇몇 기계론및 형태학적 유사성을 표시합니다. 에너지 대사와 칼슘 항상성의 유지는 괴사11동안 신경 생존에 중요한 역할을한다. 다음 균주는 활동적인 이온 채널, mec-4 (u231)X 및 deg-3 (u662)V에의해 유발되는 괴사 세포 죽음을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.

  1. 괴사 세포 죽음의 검사를 위한 돌연변이 벌레의 유지, 동기화 및 준비
    1. 1일차: 메크-4(u231) 또는 deg-3(u662) 돌연변이 선충을 선충선에 선택(NGM; 표 1) 해부 스테레오현미경을 사용하여 에체리치아 대장균(OP50)으로 시드된 플레이트.
    2. ....

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결과

음과 이온 채널에 의해 유도 된 괴사 세포 죽음
여기에 제시된 절차를 이용하여, mec-4(u231) 및 deg-3u662) 돌연변이 배아는 34°C에서 25분 동안 배양되거나 20°C의 표준 온도에서 보관하였다. 부화 시, 신경 세포 시체의 수는 두 그룹의 L1 애벌레 단계에서 결정되었다. 괴사 세포 죽음은 열 충격 전제 조건 계란(그림 1A-1B)에서부화 선충에서 감소된다.

단백질 골재 유도 신경 변성
트랜스제닉 선충과 발현(A) 인간 α-시뉴클레인 및 세포질 GFP는 도파민성 뉴런과 (B) 인간 폴리글루타민 단백질(PolyQ)이 YFP 팬뉴런과 융합되어, 34°C에서 30분 동안 매일 노출되었다. 열충격 전재는 7일 성인 헤르마프로디테(그림2A)에서

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토론

여기에서, 우리는 노화에 의존하는 신경 변성을 조사하는 몇몇 다재다능한 C. elegans 모형의 성장, 동기화 및 현미경 검사를 위한 넓게 접근하는 방법론을 소개하고 기술합니다. 특히, 하이퍼활성화이온 채널 유도 괴사,및 단백질 골재 유발 신경독성1,2,23,3,4,,5,,7,9,,10,11을이용하여 연령관련 뉴런 고장의 세포 및 분자 기초를 평가하고 해부한다.,

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공개 사항

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

감사의 글

비디오 녹화 및 편집에 대한 차니오타키스 M. 및 쿠나키스 K. 감사드립니다. K.P.는 그리스 연구 혁신 재단(HFRI)과 연구 기술 총무사(GSRT)의 보조금으로 지원받고 있습니다. N.T.는 유럽 연구 위원회 (ERC – GA695190 – MANNA), 유럽 위원회 프레임 워크 프로그램 및 그리스 교육부의 보조금으로 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
한천 시그마-알드리치5040
아가로스바이오짐8,40,004
AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
염화칼슘 탈수물(CaCl2?2H2O)시그마-알드리치C5080
콜레스테롤SERVA 전기영동17101.01
deg-3(u662)V 또는 deg-3(d)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)20 °에서 동물 유지; C
DIC 현미경 (Nomarsky)ZeissAxio Vert A1
해부 실체현미경Nikon CorporationSMZ645
Epifluorescence microscopeThermo Fisher ScientificEVOS Cell Imaging Systems
Escherichia coli OP50 strainCaenorhabditis Genetics Center (CGC)
Greiner Petri 접시 (60 mm x 15 mm)Sigma-AldrichP5237
이미지 분석 소프트웨어피지https://fiji.sc
KH2PO4EMD Millipore1,37,010
K2HPO4EMD Millipore1,04,873
황산마그네슘 (MgSO4)Sigma-AldrichM7506
mec-4(u231)X 또는 mec-4(d)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)동물을 20세 이상으로 유지; C
현미경 슬라이드 (75 mm x 25 mm x 1 mm)Marienfeld, Lauda-Koenigshofen10 006 12
현미경 커버 유리 (18 mm x 18 mm)Marienfeld, Lauda-Koenigshofen01 010 30
Microsoft Office 2011 Excel 소프트웨어 패키지Microsoft Corporation, Redmond, USA
Na2HPO4EMD Millipore1,06,586
선충 성장 배지(NGM) 한천 플레이트
니스타틴 원액시그마-알드리치N3503
펩톤BD, 박토211677
인산염 완충액
염화나트륨(NaCl)EMD 밀리포어1,06,40,41,000
한천 플레이트( 오토클레이브, 페트리 접시 등)
웜 유지 관리를 위한 표준 장비(백금 와이어 픽, 인큐베이터 등)
통계 분석 소프트웨어GraphPad Software Inc., 미국GraphPad Prism 소프트웨어 패키지
스트렙토마이신Sigma-AldrichS6501
테트라미솔 염산염Sigma-AldrichL9756
UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]요청 시: G. Caldwell (앨라배마 대학교, 터스컬루사 앨라배마)
샌디에이고,

참고문헌

  1. Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
  2. Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003....

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재인쇄 및 허가

태그

C. elegans 신경퇴행이온 통로 괴사단백질 응집체 신경독성유전적 스크리닝약리학적 스크리닝형광 현미경DIC 현미경열충격 전처치알파-시누클레인 응집체도파민성 뉴런 사멸