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방법 논문

카노르하비티스 예르간에서 노화와 관련된 신경 퇴행성 질환 모델링

5.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/61169

⸱

2020년 8월 15일

 , 
1Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology-Hellas, Greece, 2Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, Heraklion, 70013, Crete, Greece

이 논문에서

요약

여기에서, 우리는 노화와 관련된 신경 퇴행성 질환의 세포 및 분자 기초를 모니터링하고 해부하기 위해 과활성화 이온 채널 유도 괴사 및 단백질 골재 유도 신경 독성을 포함하여 일부 다목적 선충 모델을 활용하여 널리 접근 할 수있는 방법론을 소개하고 설명합니다.

초록

인간의 신경 퇴행성 병리학과 싸우고 그들의 만연한 사회 경제적 영향을 관리하는 것은 글로벌 우선 순위가되고있다. 인간의 삶의 질과 의료 시스템에 대한 해로운 영향에도 불구하고, 인간의 신경 퇴행성 질환의 대부분은 여전히 불치의 예방 할 수없는 남아있다. 따라서 이러한 질병에 대한 새로운 치료 개입의 개발은 시급한 시급성이되고 있습니다. 뉴런 회로와 기능의 노화와 관련된 악화는 낮은 벌레 Caenorhabditis elegans 및 인간과 같은 다양한 유기체에서 진화적으로 보존되어 기본 세포 및 분자 메커니즘의 유사성을 나타냅니다. C. elegans는 노화 중 신경 활동과 품질 관리를 평가하기 위해 잘 특징인 신경계, 신체 투명성 및 유전 및 이미징 기술의 다양한 레퍼토리를 제공하는 고가성 유전 모델입니다. 여기서, 우리는 과활성화 이온 채널 유도 괴사(예를 들어, deg-3(d) 및 mec-4(d)및 단백질 집계(예를 들어, α-syunclein 및 poly-글루타메이트)를 포함하여 일부 다목적 선충 모델을 활용하여 세포 및 세포 노화의 세포 분석과 세포 의 세포 적고를 모니터링 및 절제하는 방법을 소개하고 설명합니다. 이러한 동물 신경 변성 모델의 조합, 세포 죽음 변조기에 대 한 유전 및 약리학적 화면과 함께 신경 기능의 나이 관련 고장의 전례 없는 이해로 이어질 것입니다 및 인간의 건강 및 삶의 질에 광범위 한 관련성에 중요 한 통찰력을 제공할 것입니다.

서론

지난 2 년 동안, C. elegans 널리 괴사 세포 죽음의 분자 메커니즘을 조사 하는 모델 유기체로 사용 되었습니다. C. elegans는 매우 잘 특성화되고 매핑된 신경계, 투명한 신체 구조 및 노화 전반에 걸쳐 생체 외세포 기능 및 생존을 모니터링하는 유전 및 이미징 방법의 다양한 레퍼토리를 제공합니다. 따라서, 신경 변성의 몇몇 C. elegans 유전 모형은 이미 신경 생존성을 평가하기 위하여 개발되었습니다. 특히, 잘 설명되고 사용되는 선충 모델은 단백질,집계4, 5, 6, 7, 8, 9,10 및 열사병 11, 12, 그 외 에서 단백질,집계1,,4,5,,6,7,78,9,10 및 열사병11, 12,그 외에서 증가된 단백질 집계에 의해 유발되는 활동적인 이온 채널 유도 괴사1,2,3 및세포 사멸을 포함한다.2

사외 치명적인 온도에 단기 노출은 선충과 포유류 뉴런11모두에서 후속 열 스트레스에 의해 트리거 괴사 세포 죽음에 대한 저항을 부여했다. 흥미롭게도, 온화한 고온에서 선충의 매일 전제 조건은 이온 불균형 (예를 들어, mec-4 (u231) 및 /또는 deg-3 (u662)및 단백질 집계 (예를 들어, α-synuclein 및 polyQ41) 및 폴리11Q41등 다양한 자극에 의해 가해지는 신경 변성으로부터보호합니다.13

여기서는 C. elegans를 사용하여 발췌 독성 유발 세포 사망, 파킨슨병 및 헌팅턴 병과 같은 잘 확립 된 인간 질환 모델에서 연령 의존적 신경 변성을 모니터링하고 평가합니다. 또한, 우리는 신경 변성의 여러 모델에서 열 전조의 신경 보호 역할을 강조. 유전 및/또는 약리학적 스크린과 함께 이러한 기술의 조합은 잠재적인 치료 적 관심과 함께 새로운 세포 죽음 변조기의 식별 및 특성화를 초래할 것입니다.

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프로토콜

1. 음과 이온 채널에 의해 유도 된 괴사 세포 죽음

참고: 메크-4 및 deg-3을 포함한 degenerins유전자 패밀리의 기능성 돌연변이는 웜3에서메카노센션에 필요한 6개의 터치 수용체 뉴런의 괴사 세포 사멸을 유발하는 활동적인 이온 채널의 생성을 초래한다. 괴사는 degenerins의 비정상적인 자극에 의해 유도된 포유류에 있는 흥분 독성에 몇몇 기계론및 형태학적 유사성을 표시합니다. 에너지 대사와 칼슘 항상성의 유지는 괴사11동안 신경 생존에 중요한 역할을한다. 다음 균주는 활동적인 이온 채널, mec-4 (u231)X 및 deg-3 (u662)V에의해 유발되는 괴사 세포 죽음을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.

  1. 괴사 세포 죽음의 검사를 위한 돌연변이 벌레의 유지, 동기화 및 준비
    1. 1일차: 메크-4(u231) 또는 deg-3(u662) 돌연변이 선충을 선충선에 선택(NGM; 표 1) 해부 스테레오현미경을 사용하여 에체리치아 대장균(OP50)으로 시드된 플레이트.
    2. 시드 NGM 플레이트 당 10 L4 선충을 놓고 20 °C의 표준 온도에서 성장하십시오.
    3. 5일차: M9 완충(표1)의1mL로 판을 씻고 1.5mL 튜브로 동물을 채운다.
    4. 30s용 10,000 x g의 원심분리기와 상부체제거.
    5. 표백 용액 0.5mL(H2O7mL, 5N NaOH 1mL, 표백제 2mL)를 추가합니다.
      참고: 표백 용액은 점차 효율성을 잃게 됩니다. 따라서 매일 준비해야합니다.
    6. 소용돌이와 벌레가 용해 될 때까지 주기적으로 모니터링합니다.
      참고: 배아의 생존능력이 영향을 받을 수 있기 때문에 5분 이상 표백을 피하십시오.
    7. 30s용 10,000 x g의 원심분리기와 상부체제거.
    8. M9 버퍼 1mL로 펠릿(계란)을 두 번 씻으십시오.
    9. 세척 후, M9 버퍼의 200 μL에서 계란을 다시 중단하고 수조에서 34 °C에서 25 분 동안 배양하십시오.
    10. 20°C에서 별도의 대조군 시료(eggs)를 유지한다.
    11. 파이펫 100 μL의 제어 또는 열 충격 처리 계란을 시드 NGM 플레이트에 놓습니다. 각 접시에는 적어도 100-200 개의 계란이 포함되어 있습니다.
    12. 부화 때까지 20°C에서 계란을 배양했습니다.
  2. 차동 간섭 대비를 이용한 검사를 위한 L1 애벌레 장착(DIC; 노마르스키) 현미경 검사법
    1. 아가로즈 패드 2%를 준비합니다.
    2. M9 버퍼 1mL을 사용하여 판을 세척하고 1.5mL 튜브에서 L1 유충 선충을 수집합니다.
    3. 30 s용 10,000 x g의 원심분리기.
    4. 상체를 제거하고 펠릿 (선충)을 유지합니다.
    5. 선충을 마취하기 위해 20mM M9/레바미솔 버퍼의 100 μL을 추가합니다.
      참고: 마취제로서 아지드 나트륨을 피하십시오. 나트륨 아지드는 미토콘드리아 손상과 산화 스트레스를 유발하여 결국 세포 사망 유도로 이어진다.
    6. 파이펫 10 μL M9/레바미솔 버퍼는 L1 웜을 함유하고 2% 아가로즈패드(표 1)에장착한다.
    7. 샘플 상단에 커버슬립을 부드럽게 놓습니다.
      참고: 이미징 프로세스 전반에 걸쳐 습도를 유지하기 위해 매니큐어로 커버슬립을 밀봉합니다.
    8. 차동 간섭 대비(DIC; 노마르스키) 현미경 검사.
    9. 선충당 특유의 진공 처리된 외관을 가진 세포를 계산하여 6개의 터치 수용체 뉴런의 신경변성을 채점한다.

2. 단백질 골재 유도 신경 변성

참고: 다음 균주는 단백질 골재 유도 신경 독성을 조사하는 데 사용할 수 있습니다:(A)도파민성 뉴런에서 인간의 α-synuclein의 과발현, UA44: [baIn1; p Isdat-1α-syn, pdat-1GFP] 및(B)인간 폴리글루타민 단백질(PolyQ) 범뉴알, AM101: rmsIs10[prgef-1Q40:YFP]6,,10.

  1. 신경 변성 분석기의 유지 보수, 동기화 및 형질 전환 선충제의 준비
    1. 해부 스테레오현미경을 사용하여 C. elegans 개발 및 성장을 모니터링합니다.
    2. 1일차: 새로 OP50 시드 NGM 플레이트에 각 변형의 15-20 L4 애벌레를 선택하고 이송하여 형질 전환선충의 인구를 동기화합니다.
      참고: 조건당 각 변형의 플레이트를 3플레이트 이상 사용하십시오.
    3. 선충이 20°C의 표준 온도에서 자라도록 한다.
    4. 2일차: 34°C로 설정된 인큐베이터에서 플레이트를 전송하여 30분 동안 매일 사전 컨디셔닝을 수행합니다. 그런 다음, 20°C의 표준 온도에서 미리 조건된 선충을 되돌려 보라고 한다.
      참고: 다른 유전 적 배경은 장시간 노출을 위해 고온에 민감할 수 있습니다.
    5. (A)도파민성 뉴런에서 인간의 α-synuclein의 과발현을 조사하는 경우, UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]: 9일째에 도파민세포 세포 사멸을 위한 7일 된 형질성 선충을 모니터링한다.
    6. (B)인간 폴리글루타민 단백질(PolyQ) 팬뉴런, AM101: rmsIs10[prgef-1Q40:YFP]: 5일째에 Q40:YFP를 표현하는 4일간의 형질전환 동물의 머리 부위에 있는 뉴런 폴리Q 골재를 측정한다.
  2. 현미경 검사를 위한 견본 설치
    1. 2% 아가로즈패드(표 1)를준비합니다.
    2. 아가로즈 패드의 중앙에 20mM M9/레바미솔 버퍼 드롭의 10 μL을 추가합니다.
    3. 각각의 형질 전환선충을 선택하고 M9/레바미솔 드롭으로 옮기.
      참고: 드롭당 20-30선충을 놓습니다.
    4. 샘플 상단에 커버슬립을 부드럽게 놓습니다.
      참고: 이미징 프로세스 전반에 걸쳐 습도를 유지하기 위해 매니큐어로 커버슬립을 밀봉합니다.
    5. 각각의 샘플의 현미경 검사를 진행합니다.
  3. 도파민성 뉴런에서 α-synuclein 및 세포경 GFP를 공동 발현하는 트랜스제닉 선충제의 획득 과정 및 데이터 분석
    1. 카메라와 결합된 피형성 현미경을 사용하십시오(예: EVOS FL 자동 2).
    2. 20배 배율로 헤드 영역의 z 스택 이미지를 감지하고 캡처합니다.
    3. 최대 강도 투영 이미지를 저장하고 수집합니다.
    4. 획득한 이미지의 분석을 진행합니다.
    5. 다음과 같은 세포 특성을 득점하여 신경 변성에 대한 형질 전환 웜을 검사, (i) dat-1의발기인하에서 GFP를 표현하는 뉴런에서 형광의 손실, (ii) 소마 및 /또는 축축출혈, 아웃스승 또는 수지상 손실을 보여주는 뉴런.
    6. 소프트웨어 패키지(예: Excel)를 사용하여 데이터를 가져오고 분석합니다.

3. YFP와 융합된 팬뉴런 폴리Q40을 발현하는 형질전환 선충의 수집 과정 및 데이터 분석

  1. 카메라와 결합된 피형성 현미경을 사용하십시오(예: EVOS FL 자동 2).
  2. 20배 배율로 헤드 영역의 z 스택 이미지를 감지하고 캡처합니다.
  3. 최대 강도 투영 이미지를 저장하고 수집합니다.
  4. 피지 소프트웨어를 사용하여 획득 된 이미지의 분석을 진행합니다.
  5. 피지 프로그램14와이미지를 엽니 다.
  6. 이미지 및 색상 드롭다운 메뉴를 통해 분할 채널 명령을 선택합니다.
    참고: 녹색 채널 이미지를 유지합니다.
  7. 프리핸드 선택 도구를 사용하여 형광 영역(ROI; 예: 헤드)을 수동으로 설정합니다.
  8. 분석 및 도구 드롭다운 메뉴를 통해 ROI 관리자에 각각의 ROI를 추가합니다.
  9. 프로세스를 선택하고 배경을 빼서 배경을 50%로 뺍니다.
  10. 메뉴 명령 이미지를 통해 임계값 을 설정하고 적용 | 조정 | 임계값. 전체 실험의 이미지 분석을 통해 동일한 임계값을 유지하고 설정합니다.
  11. ROI 관리자에서 각 ROI를선택합니다.
  12. 메뉴 명령을 사용하여 입자를 분석하고 분석하여단백질 골재 수를 분석합니다.
  13. 획득한 각 이미지에 대해 3.5-3.12단계를 반복합니다.
  14. 별도의 결과 창에서 표시 값을 복사합니다.
  15. 소프트웨어 패키지를 사용하여 결과를 붙여넣기/가져오기/가져오기합니다.

4. 통계 분석 보고서

  1. 각 실험 조건에 대해 적어도 30개의 선충을 사용하십시오. 세 가지 생물학적 복제를 수행합니다.
  2. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 학생 t-test(두그룹 간의 비교) 또는 ANOVA(여러 그룹 간의 비교)를 수행하여 p< 0.05를 가진 통계 분석을 유의하게 수행합니다.

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결과

음과 이온 채널에 의해 유도 된 괴사 세포 죽음
여기에 제시된 절차를 이용하여, mec-4(u231) 및 deg-3u662) 돌연변이 배아는 34°C에서 25분 동안 배양되거나 20°C의 표준 온도에서 보관하였다. 부화 시, 신경 세포 시체의 수는 두 그룹의 L1 애벌레 단계에서 결정되었다. 괴사 세포 죽음은 열 충격 전제 조건 계란(그림 1A-1B)에서부화 선충에서 감소된다.

단백질 골재 유도 신경 변성
트랜스제닉 선충과 발현(A) 인간 α-시뉴클레인 및 세포질 GFP는 도파민성 뉴런과 (B) 인간 폴리글루타민 단백질(PolyQ)이 YFP 팬뉴런과 융합되어, 34°C에서 30분 동안 매일 노출되었다. 열충격 전재는 7일 성인 헤르마프로디테(그림2A)에서

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토론

여기에서, 우리는 노화에 의존하는 신경 변성을 조사하는 몇몇 다재다능한 C. elegans 모형의 성장, 동기화 및 현미경 검사를 위한 넓게 접근하는 방법론을 소개하고 기술합니다. 특히, 하이퍼활성화이온 채널 유도 괴사,및 단백질 골재 유발 신경독성1,2,23,3,4,,5,,7,9,,10,11을이용하여 연령관련 뉴런 고장의 세포 및 분자 기초를 평가하고 해부한다.,

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공개 사항

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

감사의 글

비디오 녹화 및 편집에 대한 차니오타키스 M. 및 쿠나키스 K. 감사드립니다. K.P.는 그리스 연구 혁신 재단(HFRI)과 연구 기술 총무사(GSRT)의 보조금으로 지원받고 있습니다. N.T.는 유럽 연구 위원회 (ERC – GA695190 – MANNA), 유럽 위원회 프레임 워크 프로그램 및 그리스 교육부의 보조금으로 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
한천 시그마-알드리치5040
아가로스바이오짐8,40,004
AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
염화칼슘 탈수물(CaCl2?2H2O)시그마-알드리치C5080
콜레스테롤SERVA 전기영동17101.01
deg-3(u662)V 또는 deg-3(d)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)20 °에서 동물 유지; C
DIC 현미경 (Nomarsky)ZeissAxio Vert A1
해부 실체현미경Nikon CorporationSMZ645
Epifluorescence microscopeThermo Fisher ScientificEVOS Cell Imaging Systems
Escherichia coli OP50 strainCaenorhabditis Genetics Center (CGC)
Greiner Petri 접시 (60 mm x 15 mm)Sigma-AldrichP5237
이미지 분석 소프트웨어피지https://fiji.sc
KH2PO4EMD Millipore1,37,010
K2HPO4EMD Millipore1,04,873
황산마그네슘 (MgSO4)Sigma-AldrichM7506
mec-4(u231)X 또는 mec-4(d)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)동물을 20세 이상으로 유지; C
현미경 슬라이드 (75 mm x 25 mm x 1 mm)Marienfeld, Lauda-Koenigshofen10 006 12
현미경 커버 유리 (18 mm x 18 mm)Marienfeld, Lauda-Koenigshofen01 010 30
Microsoft Office 2011 Excel 소프트웨어 패키지Microsoft Corporation, Redmond, USA
Na2HPO4EMD Millipore1,06,586
선충 성장 배지(NGM) 한천 플레이트
니스타틴 원액시그마-알드리치N3503
펩톤BD, 박토211677
인산염 완충액
염화나트륨(NaCl)EMD 밀리포어1,06,40,41,000
한천 플레이트( 오토클레이브, 페트리 접시 등)
웜 유지 관리를 위한 표준 장비(백금 와이어 픽, 인큐베이터 등)
통계 분석 소프트웨어GraphPad Software Inc., 미국GraphPad Prism 소프트웨어 패키지
스트렙토마이신Sigma-AldrichS6501
테트라미솔 염산염Sigma-AldrichL9756
UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]요청 시: G. Caldwell (앨라배마 대학교, 터스컬루사 앨라배마)
샌디에이고,

참고문헌

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  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  16. Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).

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