여기에 제시된 자궁 전기화에서 사용하는 배아 페렛 뇌에서 유전자 조작을 수행하는 프로토콜이 있다. 이 방법은 생체 내의 신피질에서 신경 전구 세포를 표적으로 하는 것을 허용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
배아 발달 중 생체 내에서 유전자 발현의 조작은 포유류 발달 중 개별 유전자의 역할을 분석할 때 선택하는 방법입니다. 자궁에서 전기화는 생체 내에서 배아 포유류 뇌에서 유전자 발현의 조작을 위한 핵심 기술이다. 페렛의 배아 신피질의 자궁 전포화, 작은 육식 생물에 대한 프로토콜이 여기에 제시된다. 페렛은 신피질 발달을 위한 모델로 점점 더 이용되고 있습니다, 그것의 신피질은 인간과 비인간적인 영장류에 또한 존재하는 해부학, 조직학, 세포 및 분자 특징의 시리즈를 전시하기 때문에, 마우스 또는 쥐와 같은 설치류 모형에 없습니다. 자궁에서 전기기는 배아일(E) 33, 페렛의 중증 신경 발생 단계에서 수행되었다. 자궁 전기기는 뇌의 측면 심실을 안감 신경 전구 세포를 대상으로합니다. 신경 발생 하는 동안, 이러한 전조 세포 다른 모든 신경 세포 유형을 발생. 본 작품은 E37, 산후일(P) 1 및 P16에서 의대표적인 결과 및 분석을 나타내며, 자궁 전기기화에서 각각 4, 9, 24일에 대응하는 것을 나타낸다. 초기 단계에서, 표적으로 한 세포의 자손은 각종 신경 선조 아형의 주로 이루어져 있는 반면, 나중에 대부분의 표지된 세포는 포스트 미토틱 뉴런입니다. 따라서, 자궁 에서 전기화는 다양한 유형의 신경 세포의 세포 및 분자 특징에 대한 유전 조작의 효과에 대한 연구를 가능하게한다. 다양한 세포 집단에 미치는 영향을 통해 자궁 전기 기화에서도 페렛 신피질의 조직학적 및 해부학적 특징을 조작하는 데 사용할 수 있습니다. 중요 한 것은, 이러한 모든 효과 급성 및 사용자에 의해 결정 된 지 각 측성 특이성으로 수행.
서론
신피질은 포유류 뇌의 외부 시트와 더 높은 인지 기능1,,2,,3,,4,,5의시트이다. 배아 발달 중 생체 내에서 포유류 신피질에서 급성 유전적 조작을 달성하기 위해 바이러스 감염6 및 자궁전기기전7의두 가지 방법이 탐구되었다. 두 방법 모두 신구 세포의 효율적인 타겟팅을 허용하지만 몇 가지 제한으로 고통받습니다. 바이러스 감염에 비해 자궁 전기 포기의 주요 장점은 전기장의 방향을 조절하여 달성되는 신피질 내의 공간 특이성을 달성 할 수있는 능력입니다.
전기기는 시험관내 8에서세포로 DNA의 입력을 용이하게 하기 위해 처음 표시되었기 때문에, 생체 내에서 다양한 척추동물로 DNA를 전달하기 위해 적용되었다. 발달 신경과학에서, 마우스 신피질의 자궁 전기포기에서 2001년9,,<....
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프로토콜
모든 실험 절차는 Landesdirektion Sachsen (라이센스 TVV 2/2015 및 TVV 21/2017)의 승인 후 독일 동물 복지 법규와 합의하여 수행되었습니다.
1. 자궁 전기 기화 준비
- DNA 혼합물을 준비합니다. 이 프로토콜에서 pGFP의 1 μg/μL의 최종 농도가 사용된다. PBS에 DNA를 용해하고 시각화를 용이하게하기 위해 0.1 % 빠른 녹색으로 보충하십시오. 일단 준비되면, 위아래로 여러 번 피펫또는 손가락 두드리는하여 DNA 혼합물을 혼합. 사용 전까지 실온에 보관하십시오.
참고: coelectroporations의 경우, DNA 혼합물은 PBS에서 희석된 pGFP의 0.5 μg/μL과 함께 관심 유전자를 코딩하는 플라스미드의 1 μg/μL의 최종 농도를 포함하도록 제조된다. - 필요한 모든 도구와 악기로 수술 테이블을 준비하십시오.
- 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세 혈관을 당깁니다. 모세관팁의 직경을 조절하여 이전에 설명된41과같이 집게를 사용하여 모세관의 탈부를 차단한다.
2. 수술을 위한 페렛 준비
- 구토의 리스크를 감소시키기....
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결과
E33에서 페렛의 자궁 전기포공에서 배아 네오피질의 심실 표면을 일렬로 세우는 신경 전구 세포의 표적화(도1). 이 세포는 apical 선조에게 불리고 발달 도중 그밖 모든 세포 모형을 초래하는 높게 증식합니다. 비대칭 분열시, apical 전구는 또 다른 정포 선조와 더 분화된 세포, 일반적으로 심실 표면에서 분리된 기저 선조(BP)를 생성했습니다. BP는 보조 발아 영역인 SVZ로 마이그레이션되었습니다. E33에서 전기포이션이 수행되었을 때 많은 신생아 BP가 SVZ의 기저 부로 이동하여 OSVZ22를형성했습니다.
4일 후 E37에서 전기기질의 효과를 조사했을 때, 표적 세포와 자손의 대부분은 발아 영역(VZ, ISVZ 및 OSVZ, 그림 2A참조)에 남아 있었고 세포는 피질 판(CP)에서 더 유저로 더 많이 존재하지 않았다. .......
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토론
페렛의 자궁 전기포화는 다른 방법에 대하여 장점과 단점을 갖는 중요한 기술이다. 이 방법에는 중요한 단계와 제한사항뿐만 아니라 잠재적 수정 및 향후 응용 프로그램을 염두에 두어야 합니다.
전기기또는,바이러스주사(35,42, 43)를통해 산후 페렛 신생아의 유전자 조작에 대한 빅터 보렐과 동료들의 선구적인 작업 이후, 페렛은 유전적으로 접근할 수 있는 모델 유기체가 되었다.,43 자궁 전분19을통해 배아 발달 중 유전자 조작을확립하고,20은 초기 발달 단계에서 신경 전구 세포를 표적으로 함으로써 새로운 연구 가능성을 열어주었습니다. 산후 조작에 비해, 자궁 전기포기에서 신피질의 더 큰 영역과 신피질의 다른 모든 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 페렛과 J. Peychl및 빛 현미경 시설의 그의 팀을 위해 생물 의학 서비스 (BMS)의 전체 팀을 제공하는 뛰어난 지원을 위한 분자 세포 생물학 및 유전학의 막스 플랑크 연구소의 서비스 및 시설에 감사드립니다. 우리는 특히 뛰어난 수의학 지원에 대한 BMS에서 카트린 Reppe와 안나 Pfeffer와 페렛 수술을 지원하기위한 헛너 그룹에서 레이 Xing에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1ml 주사기 | BD | 309628 | Electroporation |
| 4-0 Vicryl 봉합 | Ethicon | V392ZG | |
| 수술 알루미늄 스프레이 | cp-pharma | 98017 | 수술 |
| Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | 수술 |
| Cappilary 홀더 | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
| 덱스판테놀 연고 용액 | 바이엘 | 6029009.00.00 | 수술 |
| 드레이프 시트 45x75cm | Hartmann | 2513052 | 수술 |
| 전극 핀셋, 백금 도금 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
| Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
| Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
| 흰 족제비 Mustela putorius furo | Marshall | NA | 실험 생물 |
| 광섬유 광원 | 올림푸스 | KL1500LCD | Electroporation |
| 집게 | Allgaier instrumente | 08-033-130 | 수술 |
| 겸자 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | 수술 |
| 겸자 55 | Dumostar | 11295-51 | 수술 |
| 겸자 5-SA | 루비스 테크 | 5-SA | 수술 |
| 거즈 면봉 대형 | Hartmann | 401723 | 수술 |
| 거즈 면봉 소형 | Hartmann | 401721 | 수술 |
| GFAP 항체 | Dako | Z0334 | 항체 |
| GFP 항체 | Aves labs GFP1020 | 항체 | |
| 유리 캡슐 (필라멘트가있는 붕규산 유리, OD : 1.2mm, ID : 0.69mm, 길이 10cm) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | 전기천공법 |
| 포도당 | Bela-pharm | K4011-02 | 수술 |
| 히트 패드 | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | 수술 |
| 요오드(베타딘 용액 100mg/ml) | Meda | 997437 | |
| Surgery Isofluran | CP | 21311 | 수술 |
| 로딩 팁 20µ l | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
| Metamizol | WDT | 99012 | |
| Surgery Metzenbaum 해부 가위 | Aesculap | BC600R | 수술 |
| 마이크로피펫 풀러 | 셔터 기기 | 모델 P-97 | Electroporation |
| pCAGGS-GFP | NA | NA | Kalebic et al., eLife, 2018 |
| PCNA 항체 | Millipore | CBL407 | 항체 |
| pH3 항체 | Abcam | ab10543 | 항체 |
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| 봉합 바늘 홀더 | Aesculap | BM149R | 수술 |
| Tbr2 항체 | Abcam | ab23345 | 항체 |
| 전달 피펫 3ml | Fischer 과학 | 13439108 | 수술 |
| 수조 | Julabo | TW2 | 수술 |
참고문헌
- Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B. Evolution of Nervous Systems 2e. Kaas, J. 3, Elsevier. 73-89 (2017).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).
- Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, ....
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