방법 논문

의식이 있는 마우스에서 스트레스로 인한 고혈당증을 완화하기 위해 복강내 인슐린 내성 검사 전 순응

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DOI:

10.3791/61179

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2020년 5월 22일

 ,  ,  , 
1Division of Metabolism, Endocrinology and Nutrition, VA Puget Sound Health Care System, 2Department of Medicine, University of Washington

이 논문에서

요약

스트레스로 인한 포도당 수치 상승은 생쥐의 의식적인 복강 내 인슐린 내성 검사에서 파생된 데이터의 해석에 혼란을 줄 수 있습니다. 이 기사에서는 스트레스로 인한 고혈당증을 제한하기 위해 인슐린 내성 검사를 수행하기 전에 마우스의 취급, 주사 및 혈액 샘플링에 적응시키는 방법을 설명합니다.

초록

인슐린 내성 검사는 설치류의 전신 인슐린 감수성을 평가하기 위한 대사 연구에서 일반적으로 사용됩니다. 이 검사는 인슐린을 복강에 한 번 주입한 후 시간 경과에 따른 혈당 수치를 측정하는 비교적 간단한 검사입니다. 의식이 있는 상태에서 수행되고 꼬리 싹둑을 통해 혈액을 채취하는 경우가 많다는 점을 감안할 때, 취급 및 혈액 채취와 관련된 불안으로 인해 동물로부터 스트레스 반응을 유발할 가능성이 있습니다. 따라서 스트레스로 인한 혈당 상승이 발생할 수 있으며, 이로 인해 1차 종말점 측정치, 즉 인슐린에 의한 혈당 감소를 감지하고 해석하기 어려울 수 있습니다. 이것은 많은 생쥐 균주에서 관찰되었으며, 인슐린 투여 후 포도당 수치가 감소하기보다는 증가할 수 있는 당뇨병 db/db 생쥐에서 매우 일반적입니다. 여기에서는 인슐린 내성 검사를 수행하기 전에 마우스의 취급, 주사 및 혈액 샘플링에 적응하는 방법을 설명합니다. 이를 통해 스트레스로 인한 고혈당증이 낮아지고 전신 인슐린 민감성을 보다 정확하게 반영하는 데이터를 얻을 수 있다는 것을 발견했습니다.

서론

설치류의 대사 검사는 포도당 항상성을 조절하는 다양한 매개변수를 평가하기 위해 일상적으로 수행됩니다1. 생체 내에서 전신 인슐린 작용을 평가하기 위한 황금 표준은 고인슐린-유혈당 클램프2입니다. 이 검사는 순환 인슐린 수치를 높이기 위해 인슐린을 투여하는 한편, 진혈당을 유지하기 위해 포도당을 주입합니다. 진혈당을 유지하는 데 필요한 포도당 주입 속도는 인슐린 작용을 나타냅니다. 대사 연구에서 강력한 도구이지만 마우스의 클램프 기술은 기술적으로 까다롭고 노동 집약적이므로 대사 표현형을 특성화하는 데 있어 초기 스크리닝 도구로 적합하지 않습니다. 이러한 이유로 더 간단한 복강내 인슐린 내성 검사(ITT)가 선택되는 경우가 많습니다.

ITT는 금식 기간(일반적으로 4-6시간) 후 의식 상태에서 수행됩니다. 인슐린 덩어리를 복강내로 투여한 후 일반적으로 60분 동안 혈당을 모니터링합니다. 혈당 수치는 인슐린에 민감한 조직으로의 포도당 흡수를 촉진하는 인슐린의 능력으로 인해 떨어질 것으로 예상됩니다. 이것이 일어나는 정도는 전신 인슐린 작용을 나타냅니다. 어떤 경우에는 인슐린 투여 후 포도당 수치가 감소하는 것이 아니라 역설적으로 증가하는 것으로 나타났습니다. 이 현상은 스트레스 반응에 기인할 수 있습니다. 취급, 주사 및 혈액 채취는모두 스트레스를 유발할 수 있으며3,4,5 시상하부-뇌하수체-부신축(HPA)과 자율신경계(ANS)를 활성화할 수 있습니다6,7,8. HPA와 ANS는 모두 순환 포도당 수치 9,10,11의 증가에 기여한다는 것은 잘 알려져 있습니다. ITT 초기에 스트레스로 인한 고혈당증이 나타나는 것은 인슐린 투여 시 포도당 저하 속도와 정도를 방해하기 때문에 문제가 될 수 있다12. 이것은 인슐린 저항성의 존재에 대해 잘못된 결론으로 이어질 수 있습니다. 따라서 ITT 중 포도당 수치에 대한 스트레스의 혼란스러운 영향을 완화하기 위해 당사는 ITT를 수행하기 전에 마우스의 취급, 주사 및 혈액 샘플링에 적응하는 방법을 개발했습니다.

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프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 VA Puget Sound Health Care System의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

참고: 저혈당증을 경험하는 동물의 모니터링 및/또는 개입에 대한 현지 요구 사항은 여기에 설명된 것과 다를 수 있습니다.

1. 단식 (t= -210분)

  1. 암흑 주기가 끝난 후, 마우스를 셀룰로오스 또는 종이 침구와 같은 영양가가 없는 침구(마우스가 섭취할 경우 대사 종말점에 영향을 미치는 옥수수-속대 침구가 아님)가 있는 새 케이지로 옮깁니다13. 생쥐가 단식 기간 동안 물을 자유롭게 이용할 수 있도록 합니다. 하루 중 단식 시간과 지속 시간을 마우스 그룹 간에 일관되게 유지하십시오. 표시된 데이터의 경우, 음식은 0700에서 0800 시간 사이에 제거되었으며, 이는 어두운 주기가 끝난 후 1-2시간 후였습니다.
  2. ITT가 수행될 위치로 케이지를 이동합니다. 온도, 소음, 빛, 움직임 등의 스트레스 요인이 최소화되는 조용한 공간이어야 합니다.

2. 적응 (t = -150에서 -60 분)

중요 : 쥐를 가능한 한 부드럽게 다루십시오. 가능하면 구속 장치의 사용을 피하십시오.

  1. -150분에서 체중을 측정합니다. 이것은 ITT를 위해 투여될 인슐린의 양을 계산하는 데 사용됩니다.
  2. 꼬리를 잡고 꼬리를 부드럽게 잡으면서 평평한 탁자 표면에 놓습니다. 20g의 바늘(또는 수술용 가위)을 사용하여 꼬리 끝을 작게 절개합니다. 해당 부위에 혈액 한 방울이 형성되기 시작해야 합니다.
  3. 매끄럽고 단단한 표면에 마우스를 놓고 꼬리로 마우스를 부드럽게 제지합니다.
    1. 이때 혈당을 기록하려면 꼬리 끝에서 나온 혈액 한 방울을 휴대용 혈당계의 테스트 스트립에 놓습니다. 필요한 경우 꼬리를 아주 부드럽게 마사지하여 피 한 방울을 얻습니다.
  4. 100μL의 멸균 식염수를 인슐린 주사기에 주입합니다. 부드럽게 긁어주어 마우스를 들어 올리고 복강내로 주입합니다. 식염수 주입 시간을 기록합니다.
    1. 여러 마우스를 연구하는 경우 아래 후속 단계를 위한 시간을 허용하기 위해 1분 간격으로 마우스에 식염수를 주입합니다.
  5. 식염수 주사 후 15분이 지나면 마우스의 꼬리를 부드럽게 들어올립니다. 거즈를 사용하여 꼬리 끝에 있는 혈전을 부드럽게 제거합니다.
    1. 선택 사항: 2.3단계에서 설명한 대로 이 시간에 혈당을 다시 기록합니다.
  6. 식염수 주입 후 30분이 지나면 마우스의 꼬리를 부드럽게 들어올립니다. 원하는 경우 2.3단계에서 설명한 대로 다른 혈당 측정을 얻습니다.
  7. 마우스를 케이지로 되돌리고 필요에 따라 다른 마우스에 대해 반복합니다. -90분까지 마우스를 방해하지 마십시오.
  8. -90분에서 원하는 경우 혈당 수치 측정을 포함하여 2.3-2.6단계를 반복합니다.
  9. 마우스를 케이지로 되돌리고 필요에 따라 다른 마우스에 대해 반복합니다. ITT가 될 때까지 마우스를 방해하지 않고 그대로 둡니다(기준선 혈당 측정은 -5분에 수행됨).

3. 인슐린 내성 검사 (t = -5 to +60 min)

  1. 원하는 용량이 4μL/g 체중으로 주입될 수 있도록 멸균 식염수에 일반 인슐린(CAUTION)의 작업 용액을 준비합니다.
    알림: 인슐린을 취급할 때는 우발적인 주입으로 인해 저혈당이 발생할 수 있으므로 주의해야 합니다.
  2. 멸균 식염수에 25%(v/v) 포도당 용액을 준비하여 마우스가 개입이 필요한 저혈당증이 발생할 경우를 대비하여 준비합니다.
  3. -5분에서 마우스의 꼬리를 부드럽게 들어올립니다. 이때 꼬리 끝의 혈액 한 방울을 휴대용 혈당계의 테스트 스트립에 올려 놓아 기준 혈당 수치를 결정합니다. 필요한 경우 꼬리를 아주 부드럽게 마사지하여 피 한 방울을 얻습니다.
  4. 인슐린 주사기(0.5-2.0 U/kg의 일반적인 용량 범위에 대해 4 μL/g 체중)에 인슐린 작동 용액을 끌어냅니다. 부드럽게 긁어주어 마우스를 들어 올리고 복강내로 주입합니다. 인슐린 주사 시간을 기록합니다.
    1. 여러 생쥐를 연구하는 경우 1분 간격으로 생쥐에게 인슐린을 주입하여 후속 혈액 샘플링 및 아래 데이터 기록에 시간을 할애합니다.
  5. 인슐린 주사 후 15분이 지나면 마우스의 꼬리를 부드럽게 들어올립니다. 거즈를 사용하여 꼬리 끝에 있는 혈전을 부드럽게 제거합니다. 이때 3.3단계에서 설명한 대로 혈당을 다시 확인합니다.
  6. 마우스를 케이지로 되돌리고 저혈당증(예: 과도한 무기력증)의 징후가 있는지 모니터링합니다. 생쥐에서 저혈당증 증상이 나타나면 5단계에서 설명한 대로 혈당을 측정하고 필요한 경우 포도당을 투여합니다. 포도당 중재를 받는 마우스는 현재 ITT 프로토콜에서 제거됩니다.
  7. 인슐린 주사 후 30분 동안 3.5단계와 3.6단계를 반복합니다.
  8. 인슐린 주사 후 45분에 3.5단계와 3.6단계를 반복합니다.
  9. 인슐린 주사 후 60분에 3.5단계와 3.6단계를 반복합니다.
  10. ITT에서 회복하는 데 도움이 되도록 케이지 바닥에 몇 개의 음식 알갱이가 들어 있는 쥐를 집 케이지로 되돌립니다. 30분 동안 계속 모니터링하고 마우스가 정상적인 활동/행동을 회복하지 못하면 3.6단계에 설명된 절차를 따릅니다.
    참고: 그림 1 은 위의 적응 및 ITT 절차를 요약한 것입니다.

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결과

그림 2A 와 그림 3A 는 인슐린 투여 후 15분 동안 당뇨병 db/db 마우스의 혈당 수치가 역설적으로 상승하는 것을 보여주는 대표적인 데이터(각각 개별 및 평균 데이터)로, 스트레스로 인한 고혈당증과 일치합니다. 참고로, 동일한 절차를 거친 대조군 비당뇨병성 리터메이트(db/+ 또는 +/+)에서는 혈당 상승이 분명하지 않았습니다. ITT 절차에 대한 순응이 이러한 혈당 증가를 완화하는 데 효과적인지 여부를 결정하기 위해 동일한 마우스에 대해 위에서 설명한 순응 프로토콜을 수행했습니다. 각 주요 단계는 그래프 내의 수직선으로 표시되며(그림 2B) 마우스를 다룰 때마다 혈액 샘플을 채취했습니다. -150분에 취급 및/또는 식염수 주사를 한 결과 4db/db 마우스 중 3개(빨간색 원)에서 혈당이 상승했습니다. 네 번째 마우스의 혈당 수치는 >600mg/dL였습니다...

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토론

고인슐린-진혈당 클램프는 생체 내에서 인슐린 작용을 평가하기 위한 황금 표준으로 간주됩니다. 클램프를 수행하기 위한 방법론에 대한 수정은 경동맥을 통한 혈액 샘플링 및 경정맥을 통한 주입을 가능하게 하기 위해 이전에 2개의 카테터 시스템(14)을 사용하여 카테터를 삽입한 의식적이고 구속되지 않은 마우스2에서 기술을 수행하는 결과를 낳았습니다. 이는 시술 중 마우스를 다루거나 제지해야 할 필요성을 제한하여 스트레스 반응을 감소시킵니다2. 스트레스가 대사 연구에서 다양한 종말점 측정치를 혼란스럽게 할 수 있다는 것은 잘 알려진 사실이다 1,3. 스트레스는 혈액 채취, 후각 자극, 소음, 빛, 마취 등 취급 외에도 다양한 요인에 의해 유발될 수...

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공개 사항

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감사의 글

이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 P30 DK-017047(워싱턴 대학교 당뇨병 연구 센터, 세포 기능 분석 코어)과 미국 재향 군인회, VA Puget Sound Health Care System(워싱턴주 시애틀)의 지원을 받았습니다. 이 원고의 내용은 미국 재향 군인회나 미국 정부의 견해를 대변하지 않습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
덱스트로스-50화이자 주사제00409-6648-16마우스가 저혈당증을 앓고 있는 경우 사용합니다.
거즈 패드Fisher Scientific22037907꼬리 끝의 혈전을 제거합니다.
혈당계Accu-ChekM001_us혈당을 측정합니다.
그램 스케일: 체중을 측정합니다.
인슐린 (Novolin R)Novo Nordisk0169-1833-11주사용.
인슐린 주사기VWRBD-329461주사용.
분 타이머
멸균 20G 바늘VWRBD-305175꼬리 싹둑 ��
멸균 식염수Lifeshield1261699주사용.
외과 용 가위Fine Science Tools14088-10꼬리 싹둑 싹
테스트 스트립Accu-Chek06908217001_us혈당을 측정합니다.

참고문헌

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