Method Article

글로메룰로네프염의 세포외 DNA의 반정화를 위한 감독된 기계 학습

DOI:

10.3791/61180

⸱

June 18th, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Monash University, 2Monash Micro Imaging, Monash University, 3Immunology Department, Monash Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포 사멸 중에 방출되는 세포외 DNA(ecDNA)는 염증성 염증에 기여합니다. 상해 부위에서 ecDNA의 측정은 표적 기관에서 치료 치료의 효능을 결정할 수 있다. 이 프로토콜은 신장 조직에서 ecDNA의 측정을 자동화하기 위해 기계 학습 도구의 사용을 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

구체 세포 사멸은 골수퍼록시다제 항 호중구 세포질 항체 관련 혈관염(MPO-AAV)의 병리학적 특징이다. 세포외 탈옥리보핵산(ecDNA)은 세포사멸, 괴사, 네크로토시스, 호중구 세포외 함정(NETs) 및 파이롭토시스를 포함한 다양한 형태의 세포 사멸 중에 방출된다. 이 세포 죽음의 측정은 세포 사멸의 다른 생화확적인 양식을 확인하는 데 필요한 몇몇 다른 biomarkers와 함께 시간이 많이 걸립니다. ecDNA의 측정은 일반적으로 병리학적 상해가 발생하는 실제 표적 기관이 아닌 신장 손상에 대한 대리로서 혈청 및 소변에서 수행됩니다. 신장에서 ecDNA를 조사하는 현재 어려움은 실험적으로 그리고 보관된 인간 신장 생검에서 포르말린 고정 파라핀 임베디드 조직 (FFPE)을 위한 방법의 부족입니다. 이 프로토콜은 FFPE 조직(인간과 뮤린 모두)에서 ecDNA에 대한 염색에 필요한 단계를 요약하여, 자동 불피를 해소하고 공개적으로 이용 가능한 오픈 소스 ImageJ 플러그인 Trainable Weka 세분화에서 기계 학습 도구를 사용하여 결과 이미지에서 ecDNA를 측정합니다. 훈련 가능한 Weka 세분화는 프로그램이 ecDNA를 분류하는 법을 배우는 글로메룰리 내의 ecDNA에 적용됩니다. 이 분류기는 후속 획득 신장 이미지에 적용되어 각 개별 이미지의 수동 주석이 필요하지 않습니다. 훈련 가능한 Weka 세분화의 적응성은 항MPO GN에 대한 일반적인 병리학 적 기여자 인 NETs 및 ecMPO를 식별하기 위해 실험적인 뮤린 항 MPO 구종염 (GN)에서 신장 조직에서 더 입증됩니다. 이 방법은 훈련 가능한 Weka 세분화 프로그램이 건강한 정상 신장 조직과 병들인 신장 조직 사이 ecDNA를 구별할 수 있는 효험을 명확하게 보여주는 신장 조직에서 ecDNA의 객관적인 분석을 제공합니다. 이 프로토콜은 다른 장기에서 ecDNA, NET 및 ecMPO를 식별하도록 쉽게 조정할 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

골수페록시다아제 항호성 세포질항체 관련 혈관염(MPO-AAV)은 상당한 세포 사멸과 탈옥리보핵산(DNA)1,,2의방출로 병리학적 사구체 손상으로부터 신부전을 초래하는 자가면역 질환이다. DNA는 위험 신호로 작용하여 면역 계통을 활성화할 수 있습니다. 정상적인 건강 한 조건에서, DNA의 핵 위치는 면역 체계에 노출에서 보호를 제공. 병원성 과정 또는 자가면역 중에 세포외적으로 방출되는 자가 DNA는 면역 계통에 의해 강력한 염증 손상과 관련된 분자 자가 단백질(DAMP) 3으로 볼 수있다. 엑스트라 세포 DNA(ecDNA)는 세포 사멸, 네크로토시스 호중구 세포 외 트랩 형성 (NETs), 괴사 또는 발열체44, 5,56,6,7,,8과같은 뚜렷한 생화학적 경로에 의해 조절되는 몇 가지 뚜렷한 메커니즘을 통해 죽어가는 세포에서 방출된다.

본 명세서에서는 MPO-AAV9,,10을가진 환자로부터 실험적인 항MPO GN 및 신장 생검으로부터 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) 신장의 섹션에서 죽어가는 세포로부터 방출되는 ecDNA를 염색하고 측정하는 방법을 설명한다. 혈청과 소변 모두에서 이중 좌초 DNA(dsDNA) 및 DNA 복합체를 순환하는 검출을 위한 여러 가지 방법이 존재하며, 체외 내검사서(11,,12)에서존재한다. 이러한 방법은 ecDNA의 양을 결정하는 데 정확하지만 ecDNA가 해부학적으로 방출되는 위치를 결정하지 는 않습니다. 세포 사멸을 위한 튜클과 같은 ecDNA의 특정 측정을 기술하고 세포이물질(13,,14)의측정을 설명하는 방법이 있다. 병리학적 손상이 발생하는 FFPE 신장의 모든 형태의 세포 사멸에서 절정에 달하는 ecDNA를 측정하는 방법을 설명하는 방법은 없습니다. 이것은 실험적인 치료 처리가 실제 표적 기관에 있는 병리학적인 상해의 사이트에서 ecDNA를 지우는지 결정하는 것이 중요합니다.

신장 샘플에서 여러 이미지를 수집하면 단일 사용자가 일반적으로 분석하는 대량의 데이터가 생성됩니다. 이는 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되며 사용자 편향으로 인해 다른 사용자가 신뢰할 수 없는 재현성을 받을 수 있습니다. Trainable Weka 세분화는 최첨단 생물정보 도구를 사용하여 기계 학습 알고리즘15,,16을사용하여 픽셀을 분류하는 ImageJ용 오픈 소스 소프트웨어 플러그인입니다. 이 메서드는 픽셀 세그먼트의 사용자 분류에서 학습 하 고 다른 이미지에 새로운 학습 분류를 적용 하는 "교육 가능". 이 메서드는 세그먼트의 각 픽셀을 특정 "클래스"에 속하는 것으로 "분류"하는 데 사용되는 ImageJ 프로그램 내의 일반적인 분석 도구에 의존합니다. 프로그램이 "분류자"를 알게 되면 동일한 이미지 내에서 다른 유사한 분류 세그먼트를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 그런 다음 이 모델을 저장하여 동일한 실험 내의 다른 이미지 집합에 적용됩니다.

신장 단면도에서 ecDNA를 결정하는 현재 장애물은 포르말린의 고정및 심상에 있는 노동 집약적인 분석에서 내인성 자동 형광입니다. 우리는 이 자동 형광을 담금질하고, ecDNA를 검출하고, ecDNA의 높은 처리량 측정을 위해 감독된 기계 학습을 사용하는 방법을 여기에서 설명합니다. 우리는 이전에 ImageJ에서 매크로를 사용하여 NET및 세포 외 MPO (ecMPO)의 측정을 발표했습니다, 우리는 지금 감독 기계 학습1을사용하여 이러한 방법의 반 자동화를 시연한다. 우리는 동일한 이미지 내에서 NET 및 ecMPO에 대한 대체 얼룩을 분류하기 위해 기계 학습 도구의 적응성을 보여줍니다. ecDNA, NET및 ecMPO를 검출하기 위해 여기에 기재된 이러한 염색 방법은 ecDNA, NETS 및 ecMPO가 류마티스 관절염 및 루푸스17,,18과같은 질병을 영속시키는 데 중요한 역할을 하는 다른 고체 장기 및 질병으로 번역될 수 있다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 방법은 모든 형태의 세포 사멸에서 pan ecDNA를 검출할 수 있게 합니다. 동일한 방법 및 항체는 인간 신장 생검 조직 (4 단계에서)에 사용됩니다. 모든 동물 과목은 모나쉬 대학과 모나시 건강, 클레이튼, 빅토리아, 호주에서 윤리 승인을 받았습니다.

1. DAPI 및 β 액틴으로 ecDNA 염색

  1. 8-10주 된 C57/Bl6 마우스에서 항골엽수시다스(anti-MPO-GN)의 20일 모델을 유도하여9.
    1. CO2 챔버를 사용하여 마우스를 인도적으로 안락사시다.
    2. 가위로 피부를 통해 전방 중간선 절개를 함으로써 신장을 제거하고, 조심스럽게 회음기를 잘라 해부 보드에 다시 고정합니다. 집게를 사용하여 전방 신장 근막과 정수리 성 심근을 제쳐두고 신장 골반에서 요관과 혈관 (신장 동맥 및 정맥)을 분리하여 신장을 자유롭게 자른다. 집게로 제거하고 신장을 반으로 자르고(간편 평면)는 크기 22 메스로 잘라냅니다.
    3. 실온(RT)에서 16시간 동안 신장을 고정(4% 완충 된 포르말린)에 넣습니다. 고정 신장을 30% 에탄올에 담그고 처리하기 전에 24시간 동안 담가 둡니다.
  2. 표준 6 시간 주기를 사용하여 신장 을 처리하십시오.
    15분 동안 70% 에탄올
    15분 동안 90% 에탄올
    15분 동안 100% 에탄올
    20분 동안 100% 에탄올
    25분 동안 100% 에탄올
    30분 동안 100% 에탄올
    20분 동안 자일렌
    30분 동안 자일렌
    40분 동안 자일렌
    30분 동안 왁스
    35분 동안 왁스
    40분 동안 왁스
    참고: 이것은 신장이 관심있는 항원을 파괴할 수 있기 때문에 왁스의 열에 장기간 노출되어서는 안되기 때문에 중요합니다.
  3. 마이크로톤에 3 μm 섹션을 잘라 양성 전하로 코팅 된 상용 유리 현미경 슬라이드에 마운트. 하룻밤 동안 건조시키십시오.
  4. 60 분 동안 60 °C 오븐에 슬라이드 랙에 유리 슬라이드를 넣어.
    참고: 1.3 및 1.4 단계는 항원 검색 단계에서 단면이 떠다니지 않도록 하는 것이 중요합니다.
  5. 연기 후드에 각각 40 분 용매 (자일렌 또는 대체)의 두 가지 변화에 슬라이드를 몰입하십시오.
  6. 100% 에탄올, 100% 에탄올, 70% 에탄올로 각각 5분 동안 재수화물 슬라이드. 수돗물로 5분 동안 씻으시면 됩니다.
  7. 온수 판을 연기 후드에 넣고 항원 회수 용액(10m Tris, 1mM EDTA pH 9.0)을 압력 솥에 놓습니다. 항원 검색 용액이 끓기 시작하자마자 슬라이드를 냄비에 집게 한 쌍을 사용하여 수평으로 놓고 뚜껑을 잠급합니다. 10 분 동안 높은 (15 psi 또는 103 kPa에 해당)에 끓입니다.
    참고: 이 단계는 항원 에피토프(포르말린 고정을 통해 연결된 교차)를 마스킹하여 관심 있는 항원을 회수하여 후속 염색이 작동하지 않을 것이라는 에피토프 항체 특이적 결합을 허용하기 때문에 매우 중요합니다.
  8. 압력 밥솥을 열에서 제거하고 싱크대에서 뚜껑 위에 차가운 탭을 실행하여 즉시 뚜껑을 제거합니다. 항원 검색 용액에서 20 분 동안 평형슬라이드를 둡니다.
  9. 시궤도 셰이커에서 0.01 M 인산염 완충식식염(PBS)(pH 7.4)에서 5분 동안 두 번 슬라이드를 세척합니다.
  10. 소수성 펜을 사용하여 이 시기에 어떤 조직도 건조시키지 않도록 주의하는 신장 조직 주위의 원을 그립니다.
  11. 블록 티슈는 5% 소 세럼 알부민(BSA)/PBS(pH 7.4, 0.01 M)에서 10% 닭고기 세라를 30분, 섹션당 60μl로 차단한다. 이 단계 후에 씻지 말고 60 μL 파이펫을 사용하여 차단 용액을 조심스럽게 제거하십시오.
  12. β-actin 희석 1/1000에 대 한 기본 항체 칵테일 1% BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M), 섹션 당 60 μL 및 4 °C에서 습도 챔버에서 하룻밤 배양.
  13. 시궤도 셰이커에서 PBS(pH 7.4, 0.01M)에서 5분 동안 두 번 슬라이드를 세척합니다.
  14. 이차 항체, 닭 항토끼 488 (1/200), 1 %BSA / PBS (pH 7.4, 0.01 M)로 희석 된 섹션 당 60 μL을 RT에서 40 분 동안 적용하십시오.
  15. 오비탈 셰이커에서 PBS(pH 7.4, 0.01 M)에서 5분 동안 슬라이드를 두 번 세척합니다.
  16. 코플린 항아리에 30 분 동안 70 % 에탄올에 0.3 % 수단 블랙슬라이드를 침수.
    참고: 이 단계는 포르말린 고정으로 인한 자동 불광을 담금질하기 때문에 중요합니다.
  17. 침전물을 제거하기 위해 수돗물에 슬라이드를 세척한 다음 PBS(pH 7.4, 0.01 M)에 10분 간 담그어 수단 블랙 침전물이 형성되는 것을 방지합니다.
  18. 탈은 DAPI가 장착된 장착 용액 3개를 사용하여 공초점 유리 커버립에 밀어 넣고 커버슬립 둘레에 적용하여 매니큐어로 커버립을 밀봉합니다.
  19. 슬라이드가 RT에서 24시간 동안 치료할 수 있도록 허용한 다음 빛으로부터 보호되는 4°C에 보관합니다.
    참고: 형광 프로브의 퇴색을 방지하기 위해 어둠 속에서 유지하는 것이 중요합니다.
  20. 현미경에 부착된 공초점 레이저 스캐닝 헤드를 사용하여 이미지 슬라이드. DAPI용 레이저 405대와 베타 액틴용 레이저 488로 슬라이드를 흥분시킵니다. ecDNA 검출에 필수적인 라인 순차 적 캡처 및 4라인 평균을 사용하여 단일 평면 1024 x1024 픽셀 이미지를 캡처합니다. 40x 1.0 NA 오일 목표가 사용됩니다.
    1. 샘플당 최소 20개의 글로메룰리 이미지를 이미지합니다. 이미지를 ND2 파일로 저장합니다.

2. DAPI 및 β 액틴 분석

  1. 이미지J 설치: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. 플러그인에서 기차 가 가능한 Weka 세분화를 사용할 수 있는지 확인 | 세분화 | 훈련 가능한 웨카 세분화.
  3. ImageJ 도구 모음에 이미지를 놓습니다. 이미지 클릭 | 색상 | 분할 채널. 모든 핵을 염색하는 파란색 염색에 DAPI를 가진 1개의 심상이 나타나고 녹색에 β 액틴을 가진 1개의 심상이 나타나고, 이는 구체를 묘사합니다.
    1. 단일 이미지의 병합된 파일을 만들어 색을 클릭하여 구엽에 대한 관심 영역(ROI)을 그립니다 | 채널을 병합합니다. 팝업 상자는 각 채널에 색상을 할당하도록 요청합니다. 각 채널에 색상을 할당한 후 컴포지트 만들기 상자와 소스 이미지 유지 상자를 체크하고 확인을 클릭합니다. 병합된 복합 이미지가 나타납니다.
    2. β 액틴 염색을 가이드로 사용하여, 구체 터프 주위에 ROI를 그립니다. 이 프로토콜의 끝에 ROI를 사용 하려면 옆으로이 이미지를 유지 합니다.
  4. 단일 파란색 DAPI 이미지에서 가우시안 블러를 수행합니다. 클릭 프로세스 | 필터 | 가우시안 블러,1-2.00에 넣어. 이제 이미지가 약간 흐려 보이지만 핵은 이제 매끄럽고 배경이 부드러워집니다.
    참고: 이 단계는 이미지 특성의 관련 검색이 분석되지 않을 수 있는 아티팩트에서 이미지를 정리하기 위해 노이즈를 제거하기 위해 미리 형성됩니다.
  5. 플러그인을 클릭 | 세분화 | 훈련 가능한 웨카 세분화.
  6. ImageJ의 도구 모음의 라인 도구를 사용하여 먼저 무료 핸드 도구를 사용하여 그대로 핵을 추적한 다음 클래스 1 상자 추가에 추가합니다.
  7. ImageJ의 도구 모음의 줄 도구를 사용하여 배경 영역을 클래스 2 박스로 묘사합니다.
  8. Weka 세분화 창에서 새 클래스 만들기 단추 레이블을 클릭하고 "ecDNA"라고 레이블을 지정합니다. DAPI에 의해 염색된 외핵 DNA를 묘사하기 위해 선 도구(ImageJ 도구 모음에서)를 사용합니다.
  9. 기차 가세그먼트 창에서 교육 메뉴에서 기차 분류기 버튼을 클릭합니다.
    참고: STOP 버튼은 기차 분류기 버튼 대신에 나타나고 훈련이 완료될 때까지 유지됩니다. 프로세스가 중단되므로 교육 중에이 버튼을 클릭하지 마십시오.
  10. 결과 만들기 버튼을 클릭하여 그대로 핵, 배경 및 식별된 ecDNA로 구성된 모든 분류 된 구성 요소를 가진 이미지를 만듭니다.
  11. 확률 얻기 버튼을 클릭합니다. 마우스를 전환하여 선택 객체가 흰색으로 강조 표시된 모든 클래스의 흑백 이미지를 제공합니다.
  12. 이미지를 클릭하여 이 이미지를 복제 | 중복.
  13. ecDNA가 포함된 마우스 버튼을 사용하여 화면으로 전환합니다. 임계값을 적용하여 ecDNA로 확인된 것만 가져옵니다. 임계값이 충분할 때 적용을 클릭합니다.
  14. 임계값 을 설정 한 후, ecDNA가 아닌 DNA의 더 많은 영역이있는 경우, 원래 훈련 된 이미지로 돌아가고, 더 많은 분류자를 추가하고, 단계를 반복 2.1-2.13.
  15. 이미지 클릭 | 이미지 조정 | 바이너리를 만듭니다. 2.3단계에서 만들어진 사구형 ROI를 복사하고 Ctrl+Shift+E를 클릭합니다. 편집하여 웨카 창을 활성화 | 선택 | 복원하여선택을 복원합니다. 입자 분석을클릭하여 구체 내의 ecDNA 입자만 측정합니다.
    참고: 결과 시트는 파티클, 면적, 평균 픽셀 및 ecDNA를 포함하는 구두의 백분율로 계산됩니다. 이러한 결과는 스프레드시트로 내보내고 나중에 통계 분석을 위해 저장할 수 있습니다.
  16. 옵션 메뉴에서 분류기 저장을 바탕 화면의 ImageJ 앱으로 클릭하여 분류어를 ecDNA.분류자로 저장합니다. 그런 다음 옵션 메뉴에서 데이터 저장을 클릭하고 imageJ 폴더에 ecDNA.arff로 저장합니다. ROI는 구성 크기와 모양이 변경되기 때문에 매번 수동으로 추가되어야하지만 프로그램은 ecDNA가 무엇인지 배웠습니다.
  17. 모델을 후속 이미지에 다시 적용하려면 새 이미지와 함께 2.1-2.5 단계를 반복합니다. 옵션 메뉴에서 로드 분류기와 2.16단계에서 ImageJ 폴더에서 ecDNAmodel.분류를 클릭합니다. 로그 메뉴가 나타나 모델을 실행합니다.
  18. 모델이 실행되면 옵션 메뉴에서 데이터 로드를 클릭하고 2.16 단계에서 ImageJ 폴더에 저장된 ecDNA.arff 파일을 선택합니다. 결과 만들기를클릭합니다. 결과 이미지가 모든 핵을 선택하지 못한 경우, 배경 또는 ecDNA는 재열차 분류기를 클릭하고 더 많은 분류기를 추가하고 새 모델을 저장합니다. 2.9-2.16 단계를 반복하여 분석 프로세스를 완료합니다.
    참고: 여러 이미지를 사용하여 ecDNA를 감지하는 데 사용되는 최종 모델을 생성할 수 있습니다. 이는 모델을 후속 이미지에 적용하여 더 많은 분류자를 추가하고 새로운 모델과 데이터를 ImageJ 폴더에 저장하여 달성됩니다. 이는 다른 샘플에 배경이 더 높은 경우에 특히 중요할 수 있습니다. Weka 세분화 프로그램은 ImageJ 매크로 언어와 호환되어 많은 명령이 매크로를 기록하여 일부 단계를 자동화할 수 있습니다.

3. 호중구 세포 외 트랩 및 ecMPO의 측정

참고: 이 방법은 세포외 DNA, 시트룰러 히스톤 펩다이딜 아르기나제 4 (PAD4) 및 MPO의 공동 국화에 의해 NET를 식별합니다.

  1. 8-10주 된 C57/Bl6 마우스에서 항골엽수시다스(anti-MPO-GN)의 20일 모델을 유도하여9.
    1. CO2 챔버를 사용하여 마우스를 인도적으로 안락사시다.
    2. 가위로 피부를 통해 전방 중간선 절개를 함으로써 신장을 제거하고, 조심스럽게 회음기를 잘라 해부 보드에 다시 고정합니다. 집게를 사용하여 전방 신장 근막과 정수리 성 심근을 제쳐두고 신장 골반에서 요관과 혈관 (신장 동맥 및 정맥)을 분리하여 신장을 자유롭게 자른다. 집게로 제거하고 신장을 반으로 자르고(간편 평면)는 크기 22 메스로 잘라냅니다.
    3. 실온(RT)에서 16시간 동안 신장을 고정(4% 완충 된 포르말린)에 넣습니다. 고정 신장을 30% 에탄올에 담그고 처리하기 전에 24시간 동안 담가 둡니다.
  2. 표준 6 시간 주기를 사용하여 신장 을 처리하십시오.
    15분 동안 70% 에탄올
    15분 동안 90% 에탄올
    15분 동안 100% 에탄올
    20분 동안 100% 에탄올
    25분 동안 100% 에탄올
    30분 동안 100% 에탄올
    20분 동안 자일렌
    30분 동안 자일렌
    40분 동안 자일렌
    30분 동안 왁스
    35분 동안 왁스
    40분 동안 왁스
    참고: 신장은 관심있는 항원을 파괴할 수 있기 때문에 왁스의 열에 장기간 노출되어서는 안됩니다.
  3. 마이크로톤에 3 μm 섹션을 잘라 양성 전하로 코팅 된 상용 유리 현미경 슬라이드에 마운트. 하룻밤 동안 건조시키십시오.
  4. 60 분 동안 60 °C 오븐에 슬라이드 랙에 유리 슬라이드를 넣어.
    참고: 단계 3.3-3.4항원 검색 단계에서 단면이 부동되지 않도록 하는 것이 중요합니다.
  5. 연기 후드에 각각 40 분 용매 (자일렌 또는 대체)의 두 가지 변화에 슬라이드를 몰입하십시오.
  6. 100% 에탄올, 100% 에탄올, 70% 에탄올로 각각 5분 동안 재수화물 슬라이드.
  7. 수돗물로 5분 동안 씻으시면 됩니다.
  8. 온수판을 연기 후드에 넣고 항원 회수 용액(10m Tris-1 mM EDTA pH 9.0)을 압력 솥에 놓습니다. 항원 검색 용액이 끓이기 시작하자마자 슬라이드를 냄비에 수평으로 놓고 뚜껑을 잠급합니다. 10 분 동안 높은 (15 psi 또는 103 kPa에 해당)에 끓입니다.
    참고: 이 단계는 항원 에피토프(포르말린 고정을 통해 연결된 교차)를 해제하여 관심 있는 항원을 회수하여 에피토프 항체 특이적 결합을 허용하여 후속 염색이 이 단계 없이는 작동하지 않습니다.
  9. 압력 밥솥을 열에서 제거하고 싱크대에서 뚜껑 위에 차가운 탭을 실행하여 즉시 뚜껑을 제거합니다. 항원 검색 용액에서 20 분 동안 평형슬라이드를 둡니다.
  10. 시궤도 셰이커에서 인산완충식염(PBS) (pH 7.4, 0.01 M)에서 5분 동안 두 번 슬라이드를 세척합니다.
  11. 소수성 펜을 사용하여 이 시기에 어떤 조직도 건조시키지 않도록 주의하는 신장 조직 주위의 원을 그립니다.
  12. 블록 티슈는 5% 소 세럼 알부민(BSA)/PBS(pH 7.4, 0.01 M)에서 10% 닭고기 세라를 30분, 섹션당 60μl로 차단한다. 이 단계 후에 씻지 말고 60 μL 파이펫을 사용하여 차단 용액을 조심스럽게 제거하십시오. 단면도를 건조시키지 마십시오.
  13. 1관에서 1%BSA/PBS(pH 7.4, 0.01M)로 희석된 1차 항체의 칵테일을 만든다. 신장 섹션당 60 μL을 적용합니다. 1차 항체의 농도는 다음과 같습니다.
    토끼 안티 인간 / 마우스 H3Cit 1/100
    마우스 안티 인간 /마우스 PAD4 1/50
    염소 안티 인간 / 마우스 MPO 1/200
  14. 습도 챔버에서 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
  15. 시궤도 셰이커에서 PBS(pH 7.4, 0.01M)에서 5분 동안 두 번 슬라이드를 세척합니다.
  16. 1 개의 튜브에서 이차 항체의 칵테일을 만듭니다. 이차 항체는 1% BSA/PBS, 섹션당 60 μL에 다음과 같이 적용됩니다.
    치킨 안티 토끼 488 1/200.
    치킨 안티 마우스 647 1/200.
    치킨 안티 염소 594 1/200.
  17. 40 분 동안 RT에서 인큐베이션.
  18. 시궤도 셰이커에서 PBS(pH 7.4, 0.01M)에서 5분 동안 두 번 슬라이드를 세척합니다.
  19. 이차 항체 1:200을 1%BSA/PBS(pH 7.4, 0.01 M)에서 단면당 RT 60 μL에서 40분 동안 적용하십시오.
  20. 시궤도 셰이커에서 PBS(pH 7.4, 0.01M)에서 5분 동안 두 번 슬라이드를 세척합니다.
  21. 30분 동안 70% 에탄올로 0.3% 수단 블랙으로 슬라이드를 몰입시다.
  22. 수돗물로 슬라이드를 세척하여 침전물을 제거한 다음 PBS(pH 7.4, 0.01 M)에 10분 동안 침전하여 수단 블랙 침전물이 형성되는 것을 방지합니다.
  23. 마운트 슬라이드는 DAPI가 장착된 장착 용액 3방울을 사용하여 공초점 유리 커버립에 밀어 올립니다. 커버슬립 의 둘레에 적용하여 매니큐어로 커버립을 밀봉합니다.
  24. 슬라이드가 RT에서 24시간 동안 치료할 수 있도록 허용한 다음 빛으로부터 보호되는 4°C에 보관합니다. 형광 프로브의 퇴색을 방지하기 위해 어둠 속에서 유지.
  25. 현미경에 부착된 공초점 레이저 스캐닝 헤드를 사용하여 이미지 슬라이드. DAPI용 레이저 405대와 H3Cit용 레이저 488대, MPO용 561대, PAD4용 647대와 함께 슬라이드를 흥분시킵니다. cDNA 검출에 필수적인 라인 순차 적 캡처 및 4라인 평균을 사용하여 단일 평면 1024x1024 픽셀 이미지를 캡처합니다. 40x 1.0 NA 오일 목표를 사용합니다. 샘플당 최소 20개의 글로메룰리 이미지를 이미지합니다. 이미지를 ND2 파일로 저장합니다.

4. 호중구 세포 외 트랩 및 ecMPO 분석

  1. 이미지J 설치: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. 플러그인에서 기차 가 가능한 Weka 세분화를 사용할 수 있는지 확인 | 세분화 | 훈련 가능한 웨카 세분화.
  3. 이미지를 ImageJ에 넣습니다. 이미지 클릭 | 색상 | 분할 채널. 파란색 으로 염색 하는 DAPI와 하나의 이미지가 나타납니다., 녹색 H3Cit와 하나의 이미지, 빨간색MPO와 하나의 이미지, 그리고 흰색PAD4와 하나의 이미지가 나타납니다.
    1. 색상을 클릭하여 글로메루스에 대한 ROI를 그리도록 단일 이미지의 병합된 파일을 만듭니다 | 채널을 병합합니다. 팝업 상자는 각 채널에 색상을 할당하도록 요청합니다. 각 채널에 색상을 할당한 후 컴포지트 만들기 상자와 소스 이미지 유지 상자를 체크하고 확인을 클릭합니다. 병합된 이미지가 나타납니다. 이전에 ecDNA프로토콜과 달리 복합 이미지를 사용하여 나머지 단계를 수행합니다.
  4. 합성 이미지에서 가우시안 블러를 수행합니다. 이것은 핵에서 부드럽게 할 수 있습니다. 클릭 프로세스 | 필터 | 가우시안 블러,1.00-2.00에 넣어. 이미지는 이제 약간 흐리게 보이지만 핵은 이제 부드럽고 배경이 부드러워집니다.
    참고: 이 단계는 이미지 특성의 관련 검색이 분석되지 않을 수 있는 아티팩트에서 이미지를 정리하기 위해 노이즈를 제거하기 위해 미리 형성됩니다.
  5. 플러그인을 클릭 | 세분화 | 훈련 가능한 웨카 세분화. 분석할 이미지와 Weka 세분화 특정 메뉴 도구와 함께 완전히 새 창이 나타납니다.
  6. 도구 모음(ImageJ)의 라인 도구를 사용하여, 먼저 무료 핸드 툴을 사용하여 모든 4NET 구성 요소(MPO, PAD4, DAPI 및 H3Cit)에 대해 양수되지 않은 그대로 핵을 추적한 다음 클래스 1 추가 상자에 추가합니다.
  7. ImageJ 도구 막대의 선 도구를 사용하여 배경 영역을 클래스 2 상자에 설명합니다.
  8. 레이블 메뉴에서 새 클래스 만들기 버튼 레이블을 클릭하고 "NETs"라고 표시합니다. 라인 도구를 사용하여 공동 국소화 DAPI(파란색), MPO(빨간색), PAD4(흰색) 및 시트룰러히 된 히스톤(녹색)으로 식별된 NETS를 설명합니다.
  9. 레이블 메뉴에서 새 클래스 만들기 버튼 레이블을 클릭하고 "ecMPO"라고 표시합니다. 줄 도구를 사용하여 셀이 없는 MPO(빨간색)를 설명합니다.
  10. 기차 학습 가능한 Weka 세분화 창의 교육 메뉴에서 기차 분류기 버튼을 클릭합니다.
    참고: STOP 버튼은 기차 분류기 버튼 대신에 나타나고 훈련이 완료될 때까지 유지됩니다. 교육 중에 이 버튼을 클릭하지 말고 프로세스가 중단됩니다.
  11. 학습 메뉴에서 결과 만들기 버튼을 클릭하면 이미지가 모든 분류 된 구성 요소로 생성되며, 그대로 핵, 배경 및 ecMPO로 식별 된 구성 요소로 구성됩니다.
  12. 교육 메뉴에서 확률 얻기 버튼을 클릭합니다. 마우스를 전환하여 선택 객체가 흰색으로 강조 표시된 모든 클래스의 흑백 이미지를 제공합니다.
  13. 이미지를 클릭하여 NET 확률과 ecMPO 확률 이미지를 모두 복제 | 중복.
  14. NET가 포함된 마우스 버튼을 사용하여 화면으로 전환합니다. 임계값을 적용하여 식별된 NET만 강조 표시되도록 합니다. ImageJ 메뉴 도구 모음에서 이미지를 클릭 | 조정 | 임계값. NET 구성 요소가 강조 표시될 때까지 슬라이딩 토글 막대를 이동합니다. 임계값에 만족할 때 적용을 클릭합니다. ecMPO에 대해 동일한 단계를 반복합니다.
  15. 임계값 을 설정한 후에도 ecMPO 또는 NET의 검색 영역이 여전히 있는 경우 원래 학습된 이미지로 돌아가 더 많은 분류기를 추가하고 4.1-4.14 단계를 다시 적용합니다.
  16. 이미지 클릭 | 이미지 조정 | 바이너리를 만듭니다. 4.3 단계에서 만들어진 사구형 ROI를 복사하고 Ctrl+Shift+E를 클릭합니다. 편집하여 웨카 창 활성화 | 선택 | 복원하여선택을 복원합니다. 입자 분석을 클릭하여 구성내 NET 파티클만 측정합니다.
  17. ecMPO가 포함된 마우스 버튼을 사용하여 화면으로 전환합니다. 임계값을 적용하여 식별된 ecMPO만 얻을 수 있도록 합니다. 임계값에 만족할 때 적용을 클릭합니다. 위의 4.16 단계를 반복합니다.
    참고: 결과 시트는 입자 수, 영역, 평균 픽셀 및 NET와 ecMPO를 모두 포함하는 구불구의 백분율로 계산됩니다. 그런 다음 이러한 결과를 스프레드시트에 넣고 나중에 통계 분석을 위해 저장할 수 있습니다.
  18. 옵션 메뉴에서 분류자 저장을 클릭하고 데스크톱의 ImageJ 앱에 파일을 저장하여 분류기를 NETs.분류자로 저장합니다(ImageJ 폴더). 그런 다음 옵션 메뉴에서 데이터 저장을 클릭하고 NETs.arff 파일로 저장합니다. 사구형 ROI는 사구체 크기와 모양이 변경될 때마다 수동으로 추가되어야 하지만 이 프로그램은 NET와 ecMPO가 무엇인지 배웠습니다.
  19. 모델을 후속 이미지에 다시 적용하려면 새 이미지로 4.1-4.5 단계를 반복합니다. 옵션 메뉴에서 클래스어로드를 클릭합니다. ImageJ 폴더에서 Nets.분류기를 클릭합니다. 로그 메뉴가 나타나고 모델을 실행하면 모델이 옵션 메뉴에서 로드 데이터로드를 클릭하고 NETs.arff 파일을 선택합니다.
    1. 결과 만들기를클릭합니다. 결과 이미지가 모든 핵을 선택하지 못한 경우, 배경 또는 ecDNA는 재열차 분류기를 클릭하고 더 많은 분류기를 추가하고 새 모델을 저장합니다. 4.11-4.19 단계를 반복하여 분석 프로세스를 완료합니다.
      참고: 여러 이미지를 사용하여 ecDNA, ecMPO 및 NET를 감지하는 데 사용되는 최종 모델을 생성할 수 있습니다. 이는 모델을 후속 이미지에 적용하여 더 많은 분류자를 추가하고 새로운 모델과 데이터를 ImageJ 폴더에 저장하여 달성됩니다. 이는 다른 샘플에 배경이 더 높은 경우에 특히 중요할 수 있습니다. Weka 세분화 프로그램은 ImageJ 매크로 언어와 호환되어 많은 명령이 매크로를 기록하여 일부 단계를 자동화할 수 있습니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이러한 이미지는 유도된 항MPO GN을 가진 마우스에서 형광 염색 된 FFPE 신장 조직에서 ecDNA의 노동 집약적 인 수동 측정을 최소화하기 위해 성공적으로 훈련 가능한 Weka 세분화를 사용하는 데 필요한 여러 단계를 나타냅니다. 이러한 단계는 그림 1 및 그림 2로 요약되어 있으며 Weka 세분화 프로그램에서 직접 촬영한 이미지가 분석 프로세스의 모든 단계를 요약합니다. 이러한 분석으로부터의 측정은 유도된 항MPO GN 없이, 대조조직에서, 사구체에 증착된 ecDNA의 상이한 양을 결정하는 프로그램의 능력을 보여주는 도 3에 도시된다. 도 4는 ecDNA모델이 대조군 환자로부터 신장 생검 표본에서 ecDNA를 식별하도록 적응할 수 있음을 입증한다(최소한...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

구종염의 환자 및 마우스 모델 모두의 혈청 및 소변에서 염증 성 마커를 측정하는 다중 프로토콜이 존재합니다. 이 설명된 프로토콜은 사구체 내세포사(ecDNA, NETs 및 ecMPO)의 제품을 직접 분석할 수 있게 한다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 조직 준비 및 이미징입니다. 분석을 위한 형광 염색 방법을 사용하는 주요 제한 요소는 조직 자가형광입니다. 포르말린 고정 파라핀 조직은 특정 형광 얼룩을 가릴 수 있는 자동 형광의 대상이 됩니다. 슬라이드가 수단 블랙에 침지되고, 조직의 자동 불발성을 감쇠하고, 신호 대 잡음비(19)의감소를 통해 항체 특이적 염색의 조명을 허용하는 염색 방법의 마지막 단계. 조직의 화상 진찰은 ecDNA와 MPO의 더 작은 단편을 검출할 수 있기 위하여 적어도 40 배율로 수행되어야 합니다. 이미징을 습득할 때, 한 마커의 형광을 통해 다른 마커의 형광을 통해 출혈을 보장하기 위해 선 순차적인 방식으로 수행되는 것이 중요합니다.

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

아무것도 공개할 수 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 니콘 C1 직립 공초점 레이저 스캐닝 현미경과 신장 조직의 처리를위한 모나시 조직학 플랫폼의 사용에 대한 모나시 마이크로 이미징을 인정합니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
소 혈청 알부민SIGMAA21535% 및 1% 용액은 PBS로 구성되어 있으며 대량으로 만들 수 있으며 냉동 후 폐기할 수 있습니다.
치킨 안티 염소 IgG (H+L) 교차 흡수 항체 Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA-21468항체 칵테일의 유리 접합체를 피하기 위해 사용 전 1분 동안 미니 원심분리기에서 회전
치킨 안티 마우스 IgG (H+L) 교차 흡수 항체, Alex Fluor 647ThermoFisher ScientificA-121468항체 칵테일
의 자유 접합체를 피하기 위해 사용 전 1분 동안 미니 원심분리기에서 스핀치킨 안티 래빗 IgG (H+L) 교차 흡수 항체 Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-21441항체 칵테일에 자유 접합체를 피하기 위해 사용 전 1분 동안 미니 원심분리기에서 스핀
킨 세라SIGMAC54051%BSA/PBS
커버슬립으로 구성 24 x60 mmAzerscientificES0107222#1.5 이것은 컨포칼 현미경 검사
에서 사용하도록 설계된 표준 두께가 아닙니다.EDTA 10mMSIGMAE6758항원 검색을 위해 증류수와 pH에 TRIS와 EDTA를 함께 추가하고 항원 검색을 위해 10x 용액
에탄올 30%, 70% 및 100%Chem 공급UN1170사용하여 30% 및 70%로 희석된 100% 비변성 에탄올
, 4%(10% 중성 완충 포르말린)TRAJANNBF-500신장은 RT에서 16시간 동안 3ml의 포르말린이 들어있는 5ml 튜브에 넣고, 포르말린은 흄 후드에 사용해야 합니다.
유리 조직학 슬라이드- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mmTRAJAN J3800AM4양전하를 띤 코팅 슬라이드를 사용하는 것이 필수적입니다. 항원 회수 단계에서 조직이 슬라이드에서 떨어져 나옴에 따라 슬라이드 코팅에 폴리 L-라이신을 사용하지 않는 것이
염소 안티 인간/마우스 MPO 항체R& DAF3667도착 시 영하 80도에서 분취 및 동결
HistosolClini PureCPL HISTOSOL 08200ml 염색 랙 용기에 깔끔하게 사용, 흄 후드에 사용
소수성 펜VECTOR LabsH-400신장 조직 주위에 원을 그리는 데 사용
마우스 안티 휴먼/마우스 펩티딜 아르기나제 4 (PAD4)ABCAMab128086도착 시 영하 80도에서 분취 및 동결
Nikon C1 컨포칼 스캐닝 레이저 헤드 Nikon Ti-E 도립 현미경Coherent ScientificAliquot에 부착되어 도착 시 영하 80도에서 동결
산염 완충 식염수SIGMAP381350.01M PB/0.09% NaCl 한 번에 5L 메이크업
압력솥 6L Tefal secure 5 Neo 스테인리스TefalGSA-P2530738지역 가정용품점에서
구입 Prolong Gold DAPILife TechnologiesP36962커버슬립에 직접 방울을 바르십시오
토끼 안티 인간/마우스 베타 액틴 항체ABCAMab8227분취 및 도착 시 영하 80도에서 동결
토끼 반인간/생쥐 H3Cit 항체ABCAMab5103도착 시 영하 80도에서 분취 및 동결
염색 랙 24 슬라이드ProScitechH4465선택한 염색 랙은 60도 오븐에서 압력과 배양으로 끓는 것을 견딜 수 있어야 합니다
수단 블랙 B시그마1996640.3% 70% 에탄올에 1L 병에 3g을 넣고 여과하고 실온에서 6개월 동안 내광으로부터 보호합니다
Tris 10mMSIGMAT4661증류수와 pH에 TRIS와 EDTA를 함께 넣고 pH를 9로 만듭니다. 항원 회수를 위해 10x 용액으로 구성할 수 있습니다.
XyleneTrajanXL005/20흄 후드에 사용해야 합니다.
치으로 구성할 수 있습니다. 증류수 포름알데히드를 좋습니다 인. . 은

References

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