집 먼지 진드기 (HDM)와 같은 환경 알레르겐은 종종 알레르기 염증을 조절하기 위해 선천적 인 면역 반응을 활성화하는 미생물 물질을 함유하고 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 HDM 알레르겐에서 dsRNA 종의 식별과 호산성 폐 염증을 조절하는 면역원성 활동의 특성화를 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
집 먼지 진드기 (HDM)와 같은 환경 알레르겐은 종종 비정상적인 유형 2 반응을 구동하는 알레르기 성 단백질과 타고난 면역 반응을 유도하는 미생물 물질을 포함하는 복잡한 형태로 종종 있습니다. 이러한 알레르겐 관련 미생물 성분은 알레르기 성 천식과 같은 타입-2 염증 조건의 발달을 조절하는 데 중요한 역할을합니다. 그러나 기본 메커니즘은 크게 정의되지 않은 상태로 유지됩니다. 여기서 제시된 프로토콜은 알레르겐 관련 면역 자극RNA의 구조적 특성 및 생체 내 활성을 결정한다. 구체적으로, 일반적인 알레르겐은 폐에서 IFN 반응을 자극하고 HDM 유도 알레르기 천식의 마우스 모델에서 중증 폐 호산구의 발달을 억제할 수 있는 이중 좌초 RNA(dsRNA) 종의 존재를 검사한다. 여기서, 우리는 다음과 같은 세 가지 분석을 포함했다: HDM 종을 포함한 알레르겐으로부터 분리된 총 RNA에서 dsRNA 구조를 보여주는 도트 블롯, RT-qPCR은 마우스 폐및 FACS 분석에서 인터페론 자극 유전자(ISGs) 발현에서 HDM RNA의 활동을 측정하여 각각 BAL및 폐, 폐의 EOSinophils수에 대한 HDM RNA의 효과를 결정한다.
서론
스트라찬1이원래 제안한 위생 가설에 기초하여, 내독소와 같은 환경 미생물 인자에 대한 유아 노출은 알레르기 장애2,,3의발달로부터 보호 할 수 있습니다. 미생물 감염 중, 예를 들어, 바이러스 감염, 외국 핵산(RNA/DNA)의 선천적인 면역 검출은 호스트 방어 반응을4,,5,,6을유발한다. 그러나, 집먼지 진드기(HDM) 또는 다른 곤충 알레르겐에서 긴 이중 좌초 RNA(dsRNA) 종과 같은 면역원성 핵산의 존재 그리고 유병률은 알려지지 않은 채로 남아 있다. 이 프로토콜은 HDM 또는 곤충 및 비 곤충 알레르겐이 알레르기 성 천식의 마우스 모델에서 심각한 호산성 폐 염증의 발달을 중화하기 위해 보호 면역 반응을 활성화 할 수있는 긴 dsRNA 종을 포함 여부를 결정하기 위해 설계되었습니다. 여기서, 우리는 알레르겐 유도 호산성 폐 염증을 조절하는 데 필요한 HDM 총 RNA에서 구조적 결정요인을 평가하는 세 가지 간단하고 빠른 방법을 제공한다.
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프로토콜
여기에 설명 된 실험 절차는 텍사스 건강 샌 안토니오 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다.
1. HDM 총 RNA에서 dsRNA 구조의 존재를 보여주는 도트 블롯
- 알레르겐, 곤충 및 비 곤충 알레르겐으로부터의 총 RNA 절연
- HDM, 곤충 또는 비곤충 동물을 살아 있거나 상업적으로 50mL 튜브에 넣고 액체 N2로신속하게 동결하십시오. 그런 다음 후속 총 RNA 절연을 위해 -70 °C에 저장하십시오.
참고: 이 실험에서는 HDM, 곤충 및 곤충이 아닌 동물이 알레르겐의 일반적인 공급원으로 알려져 있기 때문에 선택되었습니다. 또한, 그들의 RNA의 면역 자극 기능은 불분명한 남아 있습니다. - -70°C에 저장된 HDM, 곤충 또는 비곤충 동물의 적당량(부피 100 μL 이하)을 구슬(1.4mm 세라믹 구체)이 들어 있는 2mL 튜브로 옮은 다음 액체-N2 용기에 튜브를 10분 동안 동결한다.
- 총 RNA 절연을 위해, 각 튜브에 구니디늄 티오야네이트 계 RNA 격리 시약24의 1mL를 추가한 다음, 곤충과 비곤충 소동물을 고에너지 세포 파괴기로 분해하고 얼음에 차가운. ....
- HDM, 곤충 또는 비곤충 동물을 살아 있거나 상업적으로 50mL 튜브에 넣고 액체 N2로신속하게 동결하십시오. 그런 다음 후속 총 RNA 절연을 위해 -70 °C에 저장하십시오.
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결과
HDM, 곤충 및 비 곤충 작은 동물에서 긴 dsRNA 구조의 존재는 dsRNA 특이적 마우스 단일 클론 항체 J2 (≥ 40bp)를 사용하여 점 블롯에 의해 검사되었다. RNase III는 DsRNA를J2(도1)에 의해 검출할 수 없는 12-15 bp dsRNA 단편으로 소화하는 데 사용하였다.
HDM 총 RNA의 능력은 용량 의존적 방식으로 마우스 폐에서 선천적인 면역 반응을 자극하는 RT-qPCR(도2,상부)에 의해 분석되었다. RNase III 치료는 HDM 총 RNA의 면역 자극 활성을 폐지하여 HDM 총 RNA의 dsRNA 구조가 폐의 타고난 면역 활성에 필수적임을나타냅니다(도 2,하급).
중증형 2형 폐염증의 개발에 대한 HDM 총 RNA의 억제 효과는 FAC.......
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토론
현재 프로토콜은 알레르기 성 천식의 마우스 모형에 있는 호산성 폐 염증의 발달에 알레르기성 관련 미생물 RNA의 면역 자극성 속성 및 그들의 충격을 평가하는 방법을 설명합니다. 긴 dsRNAs는 포유류 세포에 있는 인터페론 반응을 강력하게 활성화할 수 있는 많은 바이러스의 복제 중간체로 알려져 있더라도, HDM 알레르겐에 있는 그들의 존재는 우리의 최근 일15까지알려지지 않았습니다. 본 원고에 제시된 RNA 도트 블롯, RT-qPCR 및 FACS 분석의 조합은 알레르겐 유발 호산성 염증 조절에 비판적으로 관여하는 환경 알레르겐에서 dsRNA 종과 같은 선천적 성분을 해부하는 좋은 예를 제공할 수 있다.
이 프로토콜에서, RNA 도트 블롯은 서열에 관계없이 dsRNA(≥40bp)에 구체적으로 결합하는 마우스 단클론 항체 J2를 사용하여 천연 알레르겐에서 dsRNA 구조의 존재를 검출하기 위해 사용되었습니다. 이 방법은 J2 항체가 여전히 .......
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공개 사항
우리는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
카를라 고레나(Karla Gorena) 씨는 유동 세포측정에 대한 기술 지원을 해 주셔서 감사합니다. L.S.는 중국 장학위원회와 후난지방혁신재단(CX201713068)의 지원을 받고 있습니다. H.H.A.는 사우디아라비아 주 사카카 주 응용 의학 대학 임상 실험실 과학과의 지원을 받고 있습니다. X.D.L.은 UT 헬스 샌안토니오 의과 대학 스타트업 펀드와 맥스 및 미니시 보엘커 기금의 지원을 받고 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.40 & 마이크로; m Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL 주사기 | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL 튜브 | TH. 가이어 | 7696702 | |
| 50 mL 튜브 | TH. Geyer | 7696705 | |
| 70% 에탄올 | Decon Labs | 2701 | |
| 절대 계수 구슬 | Life Technologies Europe BV | C36950 | |
| ACK-RBC 용해 완충액 | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ 멤브레인 | GE 헬스케어 | RPN203B | |
| Ant | San Antonio | 참고: 국부적으로 수집된 | |
| 항체 희석 완충액 | (레시피는 표 5 참조) | ||
| Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 to 200 희석 |
| Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (클론 N418) | BioLegend | 117317 | 1-200 희석 |
| Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (클론 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1-200 희석 |
| Anti-Mouse CD3e APC (클론 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1-200 희석 |
| Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (클론 : 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1-200 희석 |
| Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200 희석 |
| Anti-Mouse Siglec-F PE (클론 E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 to 200 희석 |
| BCIP/NBT 기질 | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| Blocking Buffer | (레시피는 표 5 참조) | ||
| 캐뉼, 20G X 1.5" | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| 원심분리기 | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 터치 실시간 PCR 검출 시스템 | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| 클로로포름 | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| 바퀴벌레 | Greer Laboratories | B26 | |
| 카운팅 비드 | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| 디지털 드라이 배스 - Four Blocks | Universal Medical, Inc. | ||
| 지렁 | 샌안토니오 | 참고: 국부적으로 수집된 | |
| 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS 완충액 | (표 5의 레시피 참조) | ||
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| 유세포 분석기(BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| 집게 | Roboz 수술 기구 | RS-5135 | |
| 혈구계 | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | 시그마 | D6898 | |
| In Vivo MAb 안티 마우스 CD16/CD32 (클론: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA 합성 키트 | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isoflurane | Abbott Labs, | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | , Thermo, Fisher Scientific | , BP2618500 | |
| J2, anti-dsRNA, monoclonal antibody | SCICONS | 10010200 | |
| 폐 소화 용액 | (표 5의 레시피 참조) | ||
| lysing matrix, D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| 용해 매트릭스 D, 2 mL 튜브 | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| Mice (암컷, 8-12주령, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| 현미경 | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific 분광 광도계 Medex 공급 | TSCND2000C | |
| 바늘, 21 g x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
| 무지방 우유 | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| 나일론 스트링 | Dynarex | 3243 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| 가위 | Roboz 수술 기구 | RS-6802 | |
| 셰이커 또는 소형 실험실 믹서 | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount 형광 | Spherotech | ACFP-70-5 | 1-10 희석 |
| 스파이 | 샌안토니오 | 참고: 현지에서 수집된 | |
| TBS | (표 5의 레시피 참조) | ||
| TBS-T | (표 5의 레시피 참조) | ||
| TRIzol 시약 | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| 트윈 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | 참고: 현지 수집 |
참고문헌
- Strachan, D. P. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ. 299, 1259-1260 (1989).
- Schuijs, M. J., et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells. Science. 349, 1106-1110 (2015).
- Stein, M. M.....
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재인쇄 및 허가
