포토컨버터블 덴드라2를 사용하여 노화 C. 엘레간스의 단백질 회전율의 생체 내 정량화

요약

여기에 제시된 단백질 헌팅틴의 분해를 광변환형 형광소 덴드라2에 융합한 분해를 모니터링하는 프로토콜이 있다.

초록

단백질은 항상성을 유지하기 위해 세포 내에서 지속적으로 합성되고 저하됩니다. 관심 있는 단백질의 저하를 모니터링할 수 있다는 것은 수명 주기뿐만 아니라 프로테오스타증 네트워크의 불균형을 발견하는 데 핵심적인 역할을 합니다. 이 방법은 질병을 유발하는 단백질 헌팅틴의 분해를 추적하는 방법을 보여줍니다. 덴드라2에 융합된 헌팅틴의 두 가지 버전은 C. elegans 신경계에 표현됩니다: 생리적 버전 또는 글루타민의 확장되고 병원성 스트레칭이 있는 것. 덴드라2는 광변환형광단백질; 짧은 자외선(UV) 조사 펄스에 따라 Dendra2는 초록색에서 빨간색으로 여기/방출 스펙트럼을 전환합니다. 펄스-체이스 실험과 유사하게, 새로 합성된 그린 덴드라2의 간섭에 관계없이 변환된 적색-덴드라2의 회전율을 모니터링하고 정량화할 수 있다. 공초점 기반 현미경 검사법을 사용하고 C. elegans의광학 적 투명성으로 인해 살아있는 노화 유기체에서 헌팅틴 덴드라2의 분해를 모니터링하고 정량화 할 수 있습니다. 뉴런 헌팅틴-덴드라2는 변환 직후 부분적으로 저하되고 시간이 지남에 따라 더 지워집니다. 돌연변이 헌팅틴의 존재가 부족하고 노화가 더욱 손상됩니다. 같은 신경계 내의 신경 아류형은 헌팅틴-덴드라2에 대해 서로 다른 회전율을 나타낸다. 전반적으로 Dendra2에 융합된 관심 있는 단백질을 모니터링하면 그 성능 저하및 프로테오스타증 네트워크의 플레이어뿐만 아니라 위치, 인신 매매 및 운송에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있습니다.

서론

살아있는 유기체의 프로테아메는 끊임없이 자신을 갱신하고 있습니다. 단백질은 세포의 생리적 요구에 따라 지속적으로 분해되고 합성됩니다. 몇몇 단백질은 빨리 제거됩니다, 그 외는 더 오래 살아있는 반면. 단백질 역학을 모니터링하는 것은 유전자 인코딩형 형광 단백질(FPs)을 사용할 때 더 간단하고 정확하며 덜 침습적인 작업입니다. FPs는 자가촉매를 형성하고 관심있는 단백질 (POI)에 융합 될 수 있지만 산소^1을위해 보조 인자를 구하거나 필요로하는 효소를 필요로하지 않습니다. 새로운 세대의 FP는 최근에 결정된 파장의 가벼운 펄스로 조사 시 색상을 전환하도록 설계되었습니다. 이러한 포토액티브ApP(PAFP)는 POI, 또는 그들이 거주하는 세포기관 또는 세포의 라벨링 및 추적을 허용하고, 그들의 정량적 및/또는 질적 파라미터^2를검사한다. FP는 POI의 움직임, 방향성, 운동 속도, 확산 계수, 모바일 대 움직이지 않는 분수, 한 셀룰러 컴파트먼트에 거주하는 시간, 회전율을 추적할 수 있게 합니다. 특정 소기관, 운동 및 수송, 또는 핵분열 및 융합 이벤트를 결정할 수 있다. 특정 셀 타입의 경우 셀의 위치, 분할 속도, 부피 및 형상을 확립할 수 있습니다. 결정적으로, PAFP를 사용하면 연속 시각화 없이 새로 합성된 프로브의 간섭 없이 추적할 수 있습니다. 세포와 전체 유기체 에서 모두 연구 결과는 성공적으로 암과 전이의 발달, 세포 골격의 조립 또는 분해, 및 RNA-DNA/단백질 상호 작용^3과같은 생체 내생물학적 질문을 해결하기 위하여 PAFPs를 채택했습니다. 이 원고에서, 가벼운 현미경 검사법과 PAFPs는 신경 퇴행성 질병의 C. elegans 모형에 있는 생체내에서 응집되기 쉬운 단백질 헌팅틴 (HTT)의 회전율을 밝히기 위하여 이용됩니다.

여기서 설명된 프로토콜은 융합 단백질 헌팅틴-덴드라2(HTT-D2)의 안정성과 분해를 정량화한다. Dendra2는 UV 또는 가시광선에 대한 응답으로 방출/여기 스펙트럼을 녹색에서 빨간색으로 돌이킬 수 없이 전환하는 2세대 단황 PAFP^4로, 최대 4,000배^5,,6의강도가 증가한다. 헌팅틴은 치명적인 유전성 신경 퇴행성 질환인 헌팅턴병(헌팅턴병)을 유발하는 단백질이다. 헌팅틴 엑슨-1에는 글루타민(CAG, Q)이 들어 있습니다. 단백질이 39Q 이상으로 표현되면 돌연변이, 독성 및 병원성 단백질로 잘못 접습니다. 돌연변이 HTT는 응집되기 쉽고 짧은 올리고머 종또는 더 큰 고도로 구조화 된 아밀로이드^7로뉴런 세포 죽음과 변성으로 이어집니다.

선충은 조작의 용이성, 동종 성질, 짧은 수명 및 광학 투명성^8덕분에노화와 신경 변성을 연구하기 위한 모델 시스템입니다. 생체 내에서 HTT의 안정성을 연구하기 위해, 융합 구조는 C. elegans의신경계에서 발현되었다. 25Qs(HTTQ25-D2)의 생리적 스트레치 또는 97Q(HTTQ97-D2)의 병리학적 스트레칭을 포함하는 HTT-D2 트랜스진은 선충의 일생^동안팬뉴런으로 과발현된다. 라이브 C. elegans를 짧고 집중적인 빛의 지점에 복종시킴으로써 단일 뉴런이 포토전환되고 변환된 HTT-D2는 시간이 지남에 따라 추적됩니다. HTT-D2의 양을 분해하기 위해, 갓 변환된 HTT-D2의 적색 신호 의 차이는 결정된 기간 후에 HTT-D2의 나머지 적신호와 비교된다. 따라서, 헌팅틴이 생리적 형태에 비해 확장되고 독성이 있는 형태로 발견될 때 헌팅틴이 어떻게 저하되는지 조사할 수 있게 된다. 전방 또는 후방 뉴런이 Q97 대 Q25의 존재에 다르게 반응하는 방법, 특히 장기간에 걸쳐; 노화 중 프로테오스타증 네트워크(PN)의 붕괴가 저하율의 차이에 어떻게 기여하는가. 이러한 결과는 HTT-D2의 회전율에 대한 작은 관찰 집합에대해서만 설명합니다. 그러나, 단백질 응집 및 proteostasis의 필드에 관련있는 더 많은 생물학 질문은 생체 응용에서 이것으로 해결될 수 있습니다.

프로토콜

1. 뉴런 헌팅틴-덴드라2 융합 단백질을 표현하는 C. 엘레간 세대

1. 기존의 제한 효소^{다이제스트(10),}깁슨 어셈블리(11) 또는 임의의 선택 방법에 의해 선충발발¹¹벡터(즉, pPD95_75, addgene #1494)에서 POI를 코딩하는 유전자를 복제한다. 프로모터를 삽입하여 원하는 조직 또는 원하는 발달 단계에서 발현을 유도합니다. DENdra2 플루오로포어를 POI와 함께 프레임에 N-또는 C-말단을 삽입합니다.
2. 융합 구조를 발현하는 형질전환 C. 엘레간을 생성한다(예를 들어, 미세 주입을 통해)^12.
   참고: 트랜스진을 운반하는 플라스미드는 초염색체 배열로 유지됩니다. 구문 통합은 필요하지 않지만 원하는 경우 수행할 수^{있습니다(13)}. 본 프로토콜에서, C. elegans는 범뉴신경 프로모터 Prgef-1의통제 하에 융합 구조물 헌팅틴 엑슨 1-Dendra2 (HTT-D2)를 운반하는 플라스미드로 마이크로인주사하였다. C. elegans 발현 백본은 크리스 외^14로부터얻어졌으며, 헌팅틴 엑슨 1은 Q25 또는 Q97을 통해 주네만 외^15로부터얻어졌고, 덴드라2는 해머 외^16로부터입수되었다.

2. C. 예인자의 연령 일치 및 유지 보수

1. 나이는 알칼리성 하이포염소염 용액^{처리(17)와} 동기화하거나 20°C에서 4시간 동안 누워있는 계란을 통해 모든 선충과 일치합니다. 계란 누워의 경우, 갓 씨를 뿌린 선충 성장 매체(NGM) 접시에 10명의 중력 성인을 놓고 제거하기 전에 4시간 동안 둡니다. 이 기간에 놓인 계란은 동기화 된 선충을 낳을 것입니다.
2. 선충 성장 매체(NGM) 플레이트에 실험C. 예레간을 보관하여 세균식품원천 E. 대장균 OP50과 함께 시종하고, 표준 선충축축(18)에 따라 한다.¹⁸
3. 원하는 단계로 20 °C에서 선충을 성장. 이 프로토콜의 경우 필요한 연령은 4일과 10일입니다.
   참고: 4일째의 청년 성인은 곤나드에 계란이 있고 이동성이 높은 것으로 식별할 수 있습니다. 숙성일 10선충은 비옥후이며, 조직 악화 및 기관차 감소^19.
4. 10일째선에는 선충이 비옥한 3일째L4 단계 이후 매일 통로를 통과하여 혼혈을 피한다.

3. 이미징용 현미경 슬라이드 준비

1. 이미징 당일 현미경 슬라이드를 준비합니다. 전자레인지에서 일반급 아가로즈를 3%(w/v)의 농도로 ddH₂O.로 녹여 약간 식힙니다.
2. 1mL 파이펫 팁의 끝을 자르고 약 400 μL의 녹은 아가로즈를 흡인합니다. 깨끗한 유리 슬라이드에 아가로즈 몇 방울을 부드럽게 놓고 즉시 다른 슬라이드를 위에 놓아 두 사이에 아가로즈의 얇은 패드가 생성되도록합니다. 부드럽게 미끄러지거나 상단 슬라이드를 들어 올리기 전에 말리십시오.
3. 아가로즈 패드 슬라이드를 가습 용기에 넣고 건조하지 않도록 하십시오. 이들은 2-3 시간 안에 사용할 수 있습니다.
   참고 : 선충이 안에 갇혀 있을 수 있기 때문에 아가로즈에 작은 거품이 형성되지 않도록하십시오.

4. 공초점 현미경 매개 변수의 정의

참고: 선충 및 데이터 수집을 장착하기 전에 공초점 획득 소프트웨어의 모든 설정을 정의합니다. 설정은 선택한 이미징 하드웨어 및 소프트웨어에 맞게 조정할 수 있습니다.

1. 공초점 소프트웨어를 열고 레이저 이미징 설정을 정의합니다. 486-553 nm에서 녹색 Dendra2에 대한 흥분 / 방출을위한 광 경로를 설정하고 빨간색 Dendra2의 경우 580-740 nm에서 설정합니다. 플루오로포어의 강도에 따라 두 채널/레이저의 힘과 게인을 조정합니다. 디지털 게인 또는 오프셋을 변경하지 말고 핀홀을 완전히 열것으로 설정하지 마십시오.
2. 획득 설정 정의: 순차채널 모드를 선택하고 모든 프레임을 추적합니다. 스캔 모드를 프레임으로 설정하고 프레임 크기를 1,024 x 1,024로 설정하고 라인 스텝은 1로 설정합니다. 평균을 2로 설정하고, 단방향 선의 평균 방법과 모드로 평균을 설정합니다. 비트 깊이를 8비트로 설정합니다.
3. Dendra2 변환을 위한 다차원 획득 설정을 정의합니다. 변환 및 표백을 위해 60%의 에너지 출력으로 설정된 405 nm 다이오드 레이저를 사용하십시오. 사용 가능한 경우 안전한 표백 GaAsP를 활성화하여 검출기를 보호합니다.
4. 0.0ms 간격과 일반 시작 및 중지가 있는 두 사이클의 시간 시리즈를 선택합니다. 2 중 1을 스캔한 후 표백을 시작하고 30회 반복을 반복합니다. 강도가 50 %로 떨어지면 표백을 중지합니다.
5. 스냅 이미지를 캡처하기 위한 획득/픽셀 의 속도(예: 최대 =12)와 중간 속도(예: 중간 =5)를 정의합니다.
   참고: 여기에 정의된 표백 매개 변수는 지침입니다. 다른 Dendra2 태그 POI의 경우 레이저 전원 설정 및 표백 반복 및 값을 경험적으로 확립해야 합니다.

5. 현미경 슬라이드에 C. 예레건의 장착

참고: 가능하면, 공초점 현미경 설정에 가까운 장착 스테레오 현미경을 배치하고 이미징 직전에 선충을 장착하십시오.

1. 아가로즈 패드 의 반대편에있는 유리 커버 슬라이드에 영구 마커가있는 4 개의 사각형이있는 창을 그리고 번호가 매겨지십시오.
2. 아가로즈 패드 의 중간에 레파미솔의 파이펫 15 μL. 레바미솔의 농도는 선충의 나이에 따라 달라집니다: 이미징 일 4 선충이 2 mM 레바미솔을 사용하는 경우; 화상 진찰일 10일 선충이 0.5 mM 레바미솔을 사용하는 경우.
3. 와이어 픽을 사용하여 4개의 선충을 액체로 옮기습니다. 속눈썹 피크의 도움으로 각 개별 선충을 창 사각형으로 부드럽게 이동합니다. 대장균 OP50의 흔적이 희석되고 형광 배경이 신호 수집을 방해하지 않도록 속눈썹을 회전시하십시오.
4. 선충이 거의 움직이지 않을 때까지 기다렸다가 액체 위에 커버 슬립을 부드럽게 놓아 아가로즈 패드와 커버 슬립 사이의 레바미솔 층의 선충을 고정하십시오.
5. 반전된 슬라이드를 공초점 단계에 배치하여 선충을 이미지화합니다.

6. 녹색 Dendra2의 변환: 시간 제로에서 데이터 수집

참고: 펄스-체이스 실험은 덴드라2 융합 단백질을 녹색 방출 형광에서 빨간색 단백질로 돌이킬 수 없이 변환하는 것으로 시작합니다.

1. 현미경의 안구를 사용하여 녹색 형광하에서 20 배 의 목표를 가진 첫 번째 선충을 찾습니다. 머리 또는 꼬리에 초점을 맞추고 공초점 모드로 전환합니다.
2. EGFP 그린 채널(예/em = 486-553 nm)에서 녹색 덴드라2를 시각화하려면 488nm 블루 레이저로 라이브 레이저 스캐닝을 시작합니다. 단일 뉴런을 선택하고 초점을 맞춥니다. 3배 확대하여 레이저 빔^4의대상을 늘립니다.
   참고: 선충당 하나의 뉴런을 선택합니다. 각 뉴런은 하나의 샘플 또는 데이터 요소를 구성합니다.
3. 최대 프로젝션 평면을 찾아, 플루오로포어의 밝기에 따라, 색상 범위 표시기에 의해 식별되는 포화되었지만 과노출된 이미지를 얻기 위해 게인 또는 레이저 전력을 증가 또는 감소시킵니다. 이 작업이 정의된 후에는 스캔을 중지합니다.
   참고: 눈에 보이는 파란색 488 nm 빛과 함께 자궁어창이 덴드라2를 변환할 수 있으므로 너무 오래 또는 너무 많은 힘으로 샘플을 조사하지^{마십시오.}
4. 소프트웨어에서 탭을 열어 관심 영역(ROI)을 선택하고 선택한 뉴런 주위에 첫 번째 ROI를 그립니다. 선충의 머리를 포괄하고 첫 번째 ROI를 포함하는 더 큰 두 번째 관심 영역을 정의합니다.
5. 표백 설정에서, 획득, 표백 및 분석될 첫 번째 ROI를 선택한다. 두 번째 ROI를 획득하고 분석하지만 표백하지 않도록 선택합니다.
6. 스캔 속도를 최대(즉, 빠른 픽셀 거주)로 설정하고 선택한 Dendra2 뉴런을 변환하는 실험을 시작합니다.
   참고: 실험이 완료되면 획득한 그림의 두 이미지가 생성됩니다: 변환 후 1개. 녹색 채널의 경우 첫 번째 이미지는 녹색 Dendra2의 변환으로 인해 두 번째 이미지에서 감소하는 녹색 신호가 높아야 합니다. 빨간색 채널의 경우 첫 번째 이미지는 음수여야 하며 변환 후 이미지에 빨간색 신호가 나타나는 신호가 표시되지 않아야 합니다. 녹색 신호가 감소하지 않으면 변환이 발생하지 않았으며 405 레이저 전원 또는 반복 횟수와 같은 설정을 수정해야 합니다. 첫 번째 이미지에 빨간색 신호가 있는 경우 사용된 488 nm 레이저 전력이 너무 높았고 녹색 Dendra2의 일부가 이미 빨간색으로 변환되었습니다. 이 경우 새로운 뉴런/선충을 선택해야 합니다.
7. 변환 직후 녹색 561 nm 레이저로 라이브 스캐닝을 시작하여 빨간색 채널에서 Dendra2를 시각화합니다(예/em = 580-740 nm). 과다 노출을 피하기 위해 범위 색상 표시기를 사용하여 변환 된 뉴런의 초점과 각각의 최대 투영을 찾습니다.
8. 스캔 속도를 낮은 픽셀 거주 속도(예: 5x)로 빠르게 설정하고 더 높은 해상도로 두 채널의 스냅샷 이미지를 획득합니다. 이 이미지는 변환 후 시간점 0(T0)으로 정의됩니다.
   참고: 변환된 이미지에 대한 획득 속도는 다양할 수 있습니다. 그러나 일단 선택되면 이 속도는 데이터 수집 전반에 걸쳐 일정하게 유지되어야 합니다.
9. 식별 가능한 이름 및/또는 번호로 스캔을 저장한 다음 시간 제로 레이블(T0)이 뒤따릅니다.
   참고: 변환 실험(단계 6.6)의 이미지를 저장하여 변환 전에 적신호가 부족하고 그 이후에 나타나는 것을 설명하는 것이 좋습니다.

7. 선택한 두 번째 시점에서 데이터 수집을 위해 변환된 빨간색 Dendra2 이미징

1. 시간이 지남에 따라 Dendra2 저하를 추적하려면 두 번째 시간점을 정의하여 동일한 선충/뉴런을 다시 이미지화합니다. 두 번째 시간점을 실험적으로 선택하여 관련 생물학적 문제를 해결합니다. 여기서 설명된 프로토콜의 경우 Dendra2는 2h(T2) 및 24h(T24) 포스트 변환에서 모두 이미지화됩니다.
   1. 선택한 시점에서, 접안과 적색 형광을 사용하여 동일한 선충 / 뉴런을 찾습니다.
   2. 각 선충/뉴런의 T0 이미지를 열고 이미지 설정을 다시 로드/재사용합니다. T0, T2 및 T24 h 이미지를 획득할 때 스냅숏의 획득 설정이 정확히 동일한지 확인합니다.
   3. 빨간색 채널에서 라이브 스캔을 하고 변환된 빨간색 뉴런을 초점으로 가져옵니다. 빨간색 Dendra2가 시간이 지남에 따라 저하되므로 범위 표시기는 덜 강렬한 최대 투영을 표시합니다. 획득 매개 변수를 변경하지 말고 첫 번째 이미지와 동일한 속도(예: 5x)로 스냅샷을 가져오지 마십시오.
2. 4시간 이상 후에 Dendra2의 분해를 추적하려면 변환 후 선충을 구출하십시오.
   1. 4개의 선충을 변환하고 화상 진찰한 후에 즉시 현미경에서 슬라이드를 제거합니다. 커버슬립을 부드럽게 제거하고 와이어 픽을 사용하여 아가로즈 패드에서 각 선충을 들어 올립니다.
   2. 각 선충을 적절히 표시하고 식별 가능한 NGM 플레이트에 개별적으로 배치합니다.
   3. 두 번째 시간 지점에 대해 선충을 신선한 아가로즈 패드에 다시 장착하고 6절의 지침에 따라 변환된 빨간색 Dendra2의 이미징을 진행한다.

8. 변환 된 덴드라2의 이미지 분석

참고 : 덴드라2의 저하의 분석은 피지 / ImageJ 소프트웨어^20으로수행됩니다.

1. 피지를 열고 드래그 피지 바에 .lsm 파일을 드롭. 변환 직후 촬영한 T0 이미지와 변환 후 선택한 시점에서 촬영한 동일한 선충의 이미지를 엽니다(T2 또는 T24 h).
   참고: Dendra2에 융합된 관심 있는 단백질의 분해를 추적하려면 적색 채널만 분석할 필요가 있다.
2. 메뉴에서 측정 매개 변수 설정: 분석 | 측정값을 설정합니다. 영역 및 통합 밀도 함수를 선택합니다.
3. 빨간색 채널에서 얻은 이미지를 선택합니다. 피지 바에서 다각형 선택 도구를 선택합니다.
4. T0 이미지에서 변환된 뉴런을 식별하고 선택 도구를 사용하여 ROI를 그립니다.
   1. 뉴런의 윤곽을 제대로 식별하려면 막대 이미지에서 선택하여 강도 임계값을 강조 표시 | 조정 | 임계값. 막대 커서를 드래그하여 임계값을 표시하고 다각형 도구를 사용하여 이 영역을 추적합니다. 정확한 ROI를 생성하기 위해, 녹색 채널에서 선택한 뉴런의 윤곽을 사용할 수도 있다.
5. 빨간색 채널 창에서 선택된 후 분석 | 측정합니다. 결과라는 팝업 창이 나타나고 영역,IntDen 및 RawIntDen에대한 ROI 값이 포함됩니다. IntDen
6. 두 번째 시간 점(T2 또는 T24 h)의 이미지에 대해 동일한 선택 및 측정 프로세스를 수행합니다.
7. 얻은 값을 스프레드시트 소프트웨어에 복사하여 변환 후 T0및 변환 후 T2 또는 T24 h에서 값을 적절하게 기록합니다.

9. 덴드라2 분해비율 계산

1. 분해 비율을 계산하려면 먼저 값을 1(또는 100%)으로 할당합니다. 시간 까지 시간 지점 0에서 저하 (즉, 변환 직후, 모든 빨간색 Dendra2 변환이 여전히 존재하는 경우). 이는 T0의 IntRawDen 값을 그 자체로 나눈 결과입니다.
2. 시간에 따른 적색 덴드라2 강도 신호의 감소를 계산하고, 열화, 두 번째 시간 점(예: T2 또는 T24 h)의 RawIntDen값을 T0의 RawIntDen값으로 나눕니다. 결과 수는 1보다 적어야 합니다. 이러한 값은 T0을 100%로 정의하는 백분율로 표현할 수도 있습니다.
3. 변환된 각 선충에 대해 7절을 반복합니다. Dendra2의 저하를 그래픽으로 표현하기 위해 y 축에서 얻은 형광 감소의 백분율 또는 비율 값을 가진 분산 플롯 또는 막대 그래프를 차트로 표시합니다. 원하는 통계 분석을 적용하고 그래프에 설명합니다.

결과

광변환 단백질 Dendra2와 함께 프레임에서 헌팅틴 엑슨-1 단백질 단편을 발현하는 두 개의 선충균은 미세 주입을 통해 수득되었고 플라스미드는 엑스트라크로모솜 배열로 유지되었다. 융합 구조는 노화를 통해 개발에서 전체 C. elegans 신경계에서 표현되었다. 여기서, HTT-D2는 생리학적 25폴리글루타민 스트레치(HTTQ25-D2, 도 1A)또는 97글루타민(HTTQ97-D2, 도 1B)을함유한 완전 관통및 병원성 반복을 포함하였다. 처음에 융합 단백질은 UV 조사에 그것의 녹색 스펙트럼에서 그것의 적색 스펙트럼으로 변경되었는지 확인하기 위하여 시험되었습니다. HTT-D2는 조명된 영역 내에서만 녹색에서 빨간색으로 성공적으로 전환되었습니다. UV 펄스의 전력 및 반복에 따라 선충의 표...

토론

단백질의 기능을 이해하려면 합성, 위치 및 저하를 이해하는 것이 중요합니다. 소설, 안정적이고 밝은 FP의 개발로 POI를 시각화하고 모니터링하는 것이 더 쉽고 효율적입니다. Dendra2와 같은 유전적으로 발현된 융합 PAFP는 POI의 안정성을 연구하기 위해 독특하게 배치됩니다. 보라색-청색 광에 노출되면 Dendra2는 보존된 아미노산의 삼합체 내에서 정확한 위치에서 휴식을 취합니다. 불소는 작은 구조적 변화를 겪으며, 그 결과 스펙트럼이 녹색에서 빨간색^23으로완전히 바뀝니다. 이 시프트를 통해 Dendra2에 연결된 POI를 감지하고 모니터링할 수 있습니다. 실제로, 이러한 융합 구조는 먼저 생체^16에서유비퀴틴 프로테솜 시스템을 연구하기 위해 C. elegans 기자 변형을 만드는 데 사용되었다. Dendra2는 또한 선택적 뉴런 아류형의 취약성과 확장된 폴리글루타민^{단백질(24)을}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
한천 고베 I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM 구성
요소 Agarose, 범용 바이오	& GmbH	BS20.46.500	마운팅 슬라이드 구성 요소
BD Bacto Peptone	BD-Bionsciences	211677	NGM 구성 요소
Deckgl ä ser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	커버 슬립
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27	Carl Zeiss AG		Objective
Fiji/ImageJ 1.52p	NIH		분석 소프트웨어
Levamisole	Hydrochloride AppliChem GmbH	A4341	마취제
LSM710-ConfoCor3	Carl Zeiss AG		레이저 스캐닝 컨포칼 미코스코프
실체 현미경	장착 Leica Camera AG		장착
현미경 neuronal-HTTQ25-Dendra2	이 논문		C. elegans strain
neuronal-HTTQ97-Dendra2	이 논문		C. elegans 균주
OP50 Escherichia coli	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OP50	선충 식품 공급원
염화나트륨	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	NGM 구성 요소
Standard-Objektträ ger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	유리 슬라이드
ZEN2010 B SP1	Carl Zeiss AG		컨포칼 수집 소프트웨어