설명된 것은 계란을 계산하고 24개의 잘 조직 배양 판을 사용하여 개별 모기의 해치 비율을 결정하는 시간과 공간 절약 방법이며, 이는 실질적으로 fecundity 및 불임 검사의 규모와 속도를 증가시킬 수 있습니다.
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방법 논문
24 잘 조직 배양 플레이트를 사용하여 Aedes aegypti에 대한 개선 된 Fecundity 및 불임 분석 (EAgaL 플레이트)
이 논문에서
요약
초록
모기는 다양한 병원균의 벡터로서 중요한 공중 보건 문제를 나타냅니다. 모기 피트 니스 매개 변수의 평가를 필요로 하는 그 연구에 대 한, 특히 계란 생산 및 개별 수준에서 해치 속도, 기존의 방법은 높은 노동 강도 와 실험실 공간 요구 사항으로 인해 조사자에 상당한 부담을 넣어. 설명된 간단한 방법은 각 웰에 아가로즈를 가진 24개의 잘 조직 배양 판을 사용하고, 각 웰의 디지털 이미징을 사용하여 시간과 공간 요구 사항이 크게 감소된 개별 수준에서 계란 수와 해치 비율을 결정합니다.
서론
벡터 매개 병원균으로부터 인간을 보호하기 위한 모기의 통제는 중요한 공중 위생 목표입니다, 주로 모기에 의해 운반된 병원체의 대부분을 위한 효과적인 백신의 부족 때문입니다. 많은 연구는 현장 적용 인구 감소 전략1,2,3과함께 모기체력을감소시키는 것을 목표로합니다. 여기에는 형질전환 모기 및/또는 CRISPR/Cas9 녹아웃 라인을 만드는 광범위한 연구가 포함됩니다. 이러한 인구 수정 접근 방식은 개별 피트니스 매개 변수4에대한 상세한 평가가 필요합니다. 여성 모기의 적합성을 평가하는 종래의 실험실 기법은 100mL 용기5,변형된 50mL 원추형 튜브 또는 드로소필라 사육을 위한 튜브의 개별 봉쇄를 포함하며, 배란용 습기가 많은 표면을 제공함으로써 변형된 드로소필라 의 튜브(즉, 계란 종이)1,2,6,7.
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프로토콜
1. 플레이트 준비
- ~1.6mm(1/16in)비트(도 2)를가진 가정용 드릴을 사용하여 24개의 잘 조직 배양 플레이트 뚜껑(웰당 4~6홀)에 구멍을 뚫는 구멍을 뚫는다.
참고: 이 구멍은 모기가 알을 낳을 수 있는 뚜껑에 축적되는 아가로즈에서 물 응축을 방지합니다. 여성 Ae. aegypti ("리버풀"변형)의 표준 크기는 ~ 3.11 mm 날개 길이입니다. 접시에서 탈출하지 않도록 작은 모기를 사용할 때 구멍의 크기를 줄이는 것이 좋습니다. - oviposition 실험 전날, 접시를 철저히 씻고 헹구고 실온에서 30-60 분 동안 1-5 % 표백제에 담급니다. 탈이온화된 물을 철저히 헹구고 건조시다.
참고 : 이 과정은 아가로즈에서 성장하는 곰팡이와 박테리아의 기회를 감소시킵니다. - 용융 아가로즈를 2%로 탈온된 물에 넣고 1,000 μL 파이펫(도3A,B)을사용하여 24개의 웰 플레이트의 각 웰에 용융 아가로즈의 500 μL을 즉시 첨가합니다. 아가로즈가 식히고 파이펫 팁을 막히기 시작하면 아가로즈를 다시 가열하고 새 파이펫 팁을 사용합니다.
참고: 여성이 알을 낳을 수....
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결과
모기는 전술한 절차에 따라 후보철 수송기(FeT) 또는 대조군 유전자(EGFP), 혈액 공급, EAgaL 플레이트 방법을 이용한 fecundity 및 불임 출력을 측정한 dsRNA를 주입하였다.
DsRNA 주사에 따라 FeT 발현이 침묵된 모기는 계란 수와 해치 비율 모두에서 현저한 감소를나타냈다(도 11A-C). 모든 제어 및 치료 모기는 72 h PBM 후 EAgaL 플레이트에 배치되었다. 태아 침묵 모기는 또한 지연 배설 및 작고 밝은 색깔의 계란(그림 12A,B)를전시했습니다. 예결과는 츠지모토등8에서도찾을 수 있다.
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토론
EAgaL 플레이트는 FT 방법에 비해 Aedes aegypti에서 개별 적인 fecundity 및 불임 검사를 수행하기 위해 노동, 시간 및 공간을 크게 줄입니다. FT 방법과 EAgaL 플레이트 간의 예비 비교결과 모든 단계(영상 기술이 FT 방법에 적용되었다)(표1)에대한 짧은 시간.. 참고로, 시작 및 분석당 추정치(24개의 웰 EAgaL 플레이트 대 24FT)의 비용은 표 2에제공됩니다.
EAgaL 플레이트를 사용할 때 고려해야 할 몇 가지 사항이 있습니다. 초기 관심사는 그러한 작은 공간에 놓인 모기가 제한된 움직임으로 인해 모든 알을 낳지 않을 수 있다는 것이었습니다. 이것이 사실인지 확인하기 위해 모기는 EAgaL 플레이트에서 48 h를 보낸 후 48 h를 추가로 종이 타월로 줄 지어있는 oviposition 컵이있는 큰 케이지로 집합적으로 옮겨졌습니다. 모기는 실제로 추가.......
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공개 사항
저자는이 연구에 대한 이해의 충돌을 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 자금 조달을 위한 텍사스 A&M 농업 연구 곤충 벡터 질병 보조금 프로그램에 감사드립니다. 또한 원고 작성 시 이 방법과 제안을 개발하는 데 도움을 준 Adelman Lab 회원과 케빈 마일스 랩 회원에게도 감사드립니다. 또한 이 원고를 더 잘 만들 수 있도록 도와준 리뷰어와 편집자들에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.6 mm Φ 드릴 비트 | 양자택일로 가열된 못 | ||
| 1000 μ L 피펫 팁(긴) | Olympus 플라스틱 | 24-165RL | |
| 24웰 조직 배양 플레이트 | Thermo Scientific | 930186 | 고리형 뚜껑 플레이트가 있는 투명하고 평평한 바닥 |
| 아가로스 | VWR | 0710-500G | |
| 컴팩트 디지털 카메라 | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| 컴퓨터(Windows, Mac 또는 Linux) | |||
| 탈이온수 | |||
| 피지 (imageJ) 소프트웨어 | 다운로드 : https://fiji.sc/ | ||
| 집게 | Dumont | 날카로운 집게는 모기의 몸을 부러뜨릴 수 있습니다 | |
| 유리 페트리 접시 | VWR | ||
| 가정용 표백제 | |||
| 가정용 전기 드릴 | |||
| 조명기 실체 현미경 (구즈넥) | |||
| P-1000 피펫 | Gilson | ||
| 페인트 브러시 | |||
| 디지털 카메라 이미지를 기록하기위한 고무 밴드 | |||
| 스프레드 시트 소프트웨어 (Microsoft Excel) | Microsoft | 모든 스프레드 시트 소프트웨어 작동 | |
| TetraMin 생선 음식 | 테트라 | 그라운드 커피 그라인더, 블렌더 또는 모르터 & 유 봉 | |
| 전송 피펫 | VWR | 16011-188 |
참고문헌
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520(2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti....
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재인쇄 및 허가
