쥐 췌장 조직의 신속하고 비용 효율적인 RNA 추출

요약

격리된 RNA의 순도와 무결성은 RNA 의존적 인 에세이에서 중요한 단계입니다. 여기서, 우리는 손상되지 않은 췌장 조직의 소량에서 RNA를 추출하는 실용적이고 빠르며 저렴한 방법을 제시합니다.

초록

추출 방법에 관계없이 조직 및 세포주의 최적화된 RNA 추출은 RNA로부터 의 단백질의 1) 균질화, 2) 효과적인 단백질 성축, 3) 리보넥리스 비활성화, 4) DNA, 단백질 및 탄수화물로부터의 오염 제거의 4단계로 수행된다. 그러나, 조직에 RNase의 높은 수준이 있을 때 RNA의 무결성을 유지하는 것은 매우 힘들다. 자발적인 자가 분해는 그것을 손상시키지 않고 췌장 조직에서 RNA를 추출하는 것을 아주 어렵게 만듭니다. 따라서, 추출 과정에서 췌장 조직의 무결성을 유지하기 위해서는 실용적인 RNA 추출 방법이 필요하다. 기존 프로토콜의 실험 및 비교 연구는 2분 이내에 쥐 췌장 조직의 20-30 mg을 획득하고 RNA를 추출함으로써 수행되었다. 결과는 전기 전도에 의해 평가되었습니다. 실험은 결과의 일반화를 위해 세 번 수행되었다. RNA 안정화 시약에서 췌장 조직을 24시간 동안 -80°C로 침우시키는 것은 RNA 추출 시약으로 사용되었을 때 고결성 RNA를 산출하였다. 얻은 결과는 스핀 컬럼 바인딩이 있는 상용 키트에서 얻은 결과와 비교할 수 있었습니다.

서론

구조적 유전자 데이터는 유전자 발현을 통해 기능성 제품에 전사될 수 있다. RNA 분석은 다른 조건에 걸쳐 유전자 발현의 다름을 발견하기 위하여 이용됩니다. 다음과 같이 핵산을 추출하는 방법에는 여러 가지가 있습니다: guanidinium thiocyanate, 페놀 클로로폼을 통한 추출, 셀룰로오스 계 크로마토그래피, 실리카 행렬에 의한 추출, 및 애니온 교환^1,,2.

유전자 발현의 적절한 검출은 조직으로부터 분리된 RNA의 무결성에 의해 좌우됩니다. 따라서, 저품질 RNA에 대한 보완적인 분자 검사가 진단 적용 결과를 위태롭게 할 수 있기 때문에 추가 검사가 수행되기 전에 조직으로부터 분리된 RNA의 무결성을 평가하는 것이 중요합니다. 따라서, 정량적 RT-PCR, 마이크로 어레이, 리보너클로스 보호 분석, 북부 블롯 분석, RNA 매핑 및 cDNA 라이브러리 건설^3,,4: 따라서, 고무결성 RNA는 다른 진단 응용 프로그램을 가진 분자 생물학적 시험에 필요하다.

RNA는 오랜 시간....

프로토콜

이 연구에 대한 윤리적 승인은 시라즈 의과 대학에서 얻어졌다 (승인 번호: 93-01-01-7178\03-07-2014).

참고: 250g의 수컷 스프라그-Dawley 쥐를 사용하십시오. -80°C의 액체 질소 탱크에서 RNA 안정화 시약에 침지된 췌장 조직의 조각을 함유한 유리병을 배치하고 RNA 추출 시약 용액을 사용하여 RNA의 무결성을 유지한다.

1. 쥐 췌장 조직의 제거

1. 수술실을 준비하고 필요한 모든 재료를 후드 아래에 놓습니다.
2. 모든 수술 기구 (드레싱 집게, 갈색 Adson 집게, 홍채 가위 및 리틀러 가위)를 240 °C에서 적어도 4 시간 동안 오븐에서 살균하여 RNases^15를비활성화합니다. 후드 아래에 70 % 알코올로 수술 장소의 표면을 살균하십시오.
3. 인슐린 주사기를 사용하여 케타민 /자일라진을 주입 [80/8 mg/kg]. 반응의 부족을 위해 쥐의 발가락을 꼬집어 마취의 깊이를 확인합니다.
4. 적절한 마이크로튜브(2mL)에 RNA 안정화 시약 1mL를 추가하여 절제된 조직에서 엔도날리스의 활성화를 억제한다.
5. 즉시....

결과

RNA 안정화 시약없이 일상 적이고 수정 된 수술 프로토콜에 따라 RNA 추출 시약에서 RNA의 무결성 평가
일상적인 외과 프로토콜에서 RNA 추출 시약으로 RNA를 추출한 후 허용되지 않는 대역이 관찰되었다. 레인 1은 간에서 RNA를 대조군으로 나타낸다. 레인 2는 일상적인 수술 프로토콜로부터 얻은 총 RNA에서 28S/18S rRNA 대역의 저하된 상태를 나타낸다. 췌장 조직의 양이 50 mg (차선 3) 또는 20-30 mg (레인 4)으로 감소되고 수술이 RNA 안정화 시약없이 즉시 수행 (수정 프로토콜)을 수행했을 때, RNA 분리는 간 조직 제어 및 비특이적 대역보다 덜 성공적이었다.

RNA 안정화 시약에 침지된 변형된 수술 프로토콜에 따른 RNA 샘플의 무결성 평가
RNA 추출 시약으로 생성된 RNA의 무결성은 보존 시간 및 온도(차선 5-8)에 따라 달라집니다. 대조간 조직과 비교하여, 췌장 .......

토론

분자 생물학에서는 고품질 RNA를 얻는 것이 중요합니다. 세포와 조직에 있는 ribonuclease 효소의 존재는 RNA를 빨리 저하시키고 추출 복합체를 만듭니다. RNases는 어떤 공동 요인 없이 작동 하는 안정적인 효소. 소량의 RNase는 RNA를 파괴하기에 충분합니다. 쥐 췌장 조직이 복강에서 제거되면 강한 세제에 의해 수술 기구를 소독하고 철저히 헹구고 수술 전에 RNases를 비활성화하기 위해 240 °C에서 적어도 4 시간 동안 오븐에 넣어야합니다. RNase 수준이 췌장에서 매우 높다는 사실을 감안할 때, 수술 장소는 NaOH와 가벼운 표백제로 살균되어 RNases를 비활성화합니다. 췌장 조직이 해부 도중 제거되는 동안, RNA는 저하될 것입니다. 효율성을 높이기 위해서는 해부를 가능한 한 빨리^{20,21,,,22, 23,,}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로스	머크	116801	독일
Atoclave	Teb Zaim		이란
원심분리기	시그마		독일
클로로포름	머크	107024	독일
디에틸피로카보네이트(DEPC) 처리수	시그마		독일
EDTA	시그마	60-00-4	독일
전기 영동 탱크	Payapajoohesh		이란
Eppendorf microTube	Extragene		대만
EtBr	시그마	E 8751	독일
에탄올	머크	81870	독일
팔콘 튜브	엑스트라 유전자		대만
포름 알데히드	머크	344198	독일
포름 아미드	Merck	344206	독일
균질화 기 - sunicator	Microson XL 2000		미국
이소프로판올	시그마	19516	독일
케타민 염산염	시그마	1867-66-9	독일
층류 후드	Jal Tajhiz		이란
Mgnetic 교반기	Labrotechnik		미국
마이크로 원심 분리기	Eppendorf		독일
마이크로 피펫 팁	, Extragene		대만
MOPS	시그마	85022106	독일
Na, AC	Merck	, 567422	독일
NaOH	Merck	, 109137	독일
오븐	Teb, Zaim		이란
PH 미터	Knick		독일
RNA 나중에/RNA 안정화 시약	Qiagen	76104	미국
수술 기구	Agn Thos		독일어 제작
주사기	AvaPezeshk		이란
TriPure 시약/RNA 추출 시약	Roche		11667157001 USA
Vortex	Labinco		네덜란드
수조	Memmert		독일
zylazine	sigma	7361-61-7	독일

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