현재 프로토콜은 해마에 복부 테진 영역 (VTA) 글루타민트 프로젝션을 추적하기위한 간단한 방법을 보여줍니다. VTA 글루타민트 뉴런의 사진 자극은 VTA 글루타민단 단자가 생체 내에서 CA1 퍼티티 피라미드 발사 속도를 조절하는 방법을 보여주기 위해 CA1 레코딩과 결합되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
두뇌에 있는 신경 하위 인구의 Optogenetic 변조는 연구원이 생체 내및 ex vivo에 있는 신경 회로를 해부하는 것을 허용했습니다. 이것은 신경 회로 내의 신경 모형의 역할 및 학습에 상대적인 정보 인코딩에 있는 그들의 중요성을 결정하기 위한 전제를 제공합니다. 마찬가지로, 이 방법은 깨어 있는 동물및 마취동물에서 두 개 이상의 연결된 뇌 영역의 생리적 중요성을 테스트하는 데 사용될 수 있다. 현재 연구는 VTA 글루타민트 뉴런이 마취 된 마우스의 CA1 (해마)에서 푸티피라미드 뉴런의 발사 속도를 조절하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 해마층의 VTA 전시냅스 글루타메이트 단자 추적을 위해 VTA 글루타민트 뉴런의 아데노 관련 바이러스(AAV)의존 라벨을 사용합니다. VTA 글루타민트 말미제 말단의 전방 추적을 허용한 AAV 벡터에 의해 수용된 광 제어 옵신(channelrhodopsin; hChR2) 및 형광 단백질(eYFP)의 발현( VTA 글루타메이트 뉴런 세포 체체)의 사진 자극(VTA에서). 고임피던스 급성 실리콘 전극은 생체 내에서 VTA 사진 자극에 대한 다중 장치 및 단일 단위 응답을 검출하기 위해 CA1에 배치되었다. 이 연구의 결과는 해마 (CA1, CA3 및 DG)에 있는 전시냅스 VTA 글루타민단 단자의 층 의존분포를 보여줍니다. 또한, VTA 글루타민트 뉴런의 사진 자극은 생체 내에서 PUTative CA1 피라미드 단위의 발사 및 버스트 속도를 증가시켰습니다.
서론
지난 10년 동안, 뉴런형 변조의 특이성을 높이기 위해 다양한 유전도구가 개발되었으며, 복잡한 신경망1의매핑. 특히, 신경 세포에서 감염 하 고 복제 하는 고유 한 능력을 가진 신경 tropic 바이러스 는 표현 하거나 뉴런 하위 유형에 특정 단백질을 ablate 배포 되었습니다. 형광 단백질 또는 유전적으로 인코딩된 시냅스 활동 지표를 수용할 때, 전감염된 AAV 벡터 라벨및 뇌 영역2,3을통해 신경망을 묘사한다. AAV 구조에서 프로모터의 선택은 어느 정도의특이성(프로모터 의존식)을 가진 뉴런 유형에서 벡터의 발현을 지시한다. 그러나, Cre-lox 재조합을 통해, AAV 구문은 뉴런 라벨링4,5,6,7에대한 더 큰 특이성을 가지고 배포된다. 참고로, AAV 벡터에 포장된 광활성화 미생물 opsinsins 및 형광 단백질은 다양한 뉴런 아형8으로발....
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프로토콜
모든 실험 및 동물 취급 절차는 루이지애나 주립 대학 수의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 실험동물
- 5-6 주 된 쥐를 사용.
- 12h번의 빛과 어두운 주기의 표준 조건하에서 케이지당 3-5마리의 동물을 보관합니다. 음식과 물은 광고 리비툼을 제공해야합니다.
2. 두개골 절제술 및 동물 준비
참고: 이 섹션에서는 마우스 두개골 절제술에 대한 사전 및 peri 수술 절차를 설명합니다. 표준 입체 장치와 적절한 좌표(Anteroposterior: AP, 평범석: ML 및 도르소벤트랄: DV)을 사용합니다. 관심있는 뇌 영역에 대한 좌표를 결정하기 위해 마우스 뇌 아틀라스를 참조하십시오.
- 인트라테오네아 케타민(100 mg/kg)/자일라진(10 mg/kg) 칵테일 주사로 쥐를 마취시킵니다. 수술 이 시작되기 전에 감각의 부재를 보장하기 위해 발가락 핀치 테스트를 수행.
참고: 또는 적절한 코 챔버가 있는 이소플루란 마취도 이 단계에 사용될 수 있다. - 스테레오탁스 장치에 동물의 머리를 부드럽게 고정합니다.
참고:....
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결과
앤티로그라드 추적
AAV 발현은 C57BL/6 마우스의 VTA에서 기자 단백질(eYFP)의 면역형광 이미징에 의해 확인되었다 21일 후사(그림2). 해마에서 사전 시냅스 VTA 글루타민트 프로젝션의 성공적인 anterograde 라벨링은 또한 DG, CA3 및 CA1의 층에서 eYFP 검출에 의해확인되었다(도 6a-d; 영화 2와 3).
해마변CA1 활성에 대한 VTA 글루타민트 프로젝션
VTA 글루타민트 뉴런의 사진 자극은 퍼티피라미드 CA1 뉴런의 활동을 증가시켰습니다. 이는 라이트 온(1) 경상(영상1)과비교하여 라이트 OFF 단계(그림
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토론
지난 10년 동안 AAV 구조의 설계가 크게 발전했습니다. 이와 같이, 더 많은 뉴런 특이성 프로모터는 향상된 형질 전환특이성(14)을위한 AAV 혈청형배열에 편입되었다. 형광 단백질, 수송기, 수용체 및 이온 채널을 위한 유전자를 결합함으로써, AAV의 도서관은 지금 화상 진찰, 신경 변조 및 시냅스 활동 검출을 위해 존재합니다. 시판되는 AAV-constructs에서, 유전적으로 인코딩된 형광소 및 이온 채널(opsin)의 조합은 신경 회로의 결합된 신경 해부학 및 전기생리학적 추적을 허용한다14,18,19. 마찬가지로, 프로모터(또는 cre-lox 재조합 방법)의 선택은 회로 내의 뉴런 유형 별 투영의 추적을 허용할 수 있다. 현재 연구에서는, 이 프로토콜은 해마(CA1 지역)에 대한 VTA 글루타민.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 OOM에 수여 CBS 브리징 그랜트에 의해 지원됩니다. OOM, PAA 및 AS는 연구를 설계하고 실험을 수행했습니다. AS와 PAA는 결과를 분석했습니다. OOM과 PAA는 원고를 준비했습니다. 우리는 우리의 사용에 대 한 AAV를 사용할 수 있도록 칼 디세로스 박사 (스탠포드 대학) 감사.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3% 과산화수소 | 피셔 화학물질 | H312 | |
| AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
| BNC 케이블 | Amazon | ||
| BNC 스플리터 | Amazon | ||
| Ceramic Split Mating Sleeve for Ø 1.25mm 페룰. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| 드릴 | Dremel | LR 39098 | |
| 젤라틴 코팅 슬라이드 | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
| Hamilton의 주사기 (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| 헤드 스테이지 어댑터 | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| 고임피던스 실리콘 프로브 | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| INTAN 512ch 녹음 컨트롤러 | INTAN | RHD2000 | |
| 요오드 용액 | Dynarex | 1425 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| 케타민 | 스펙트럼 | K1068 | |
| LED 드라이버 | Thorlabs | LEDD1B | |
| LED 광원(470nm)-블루 라이트 | Thorlabs | M470F3 | |
| Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
| 광섬유 | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| 팬 헤드 필립스 나사(M0.6 X 2mm) | 아마존 | M0.6 X 2mm | |
| 프리앰프 헤드스테이지 (32 채널) | INTAN | C3314 | |
| 스테레오택시 프레임 | Kopf | 1530 | |
| TTL 펄서 | Prizmatix | 4031 | |
| 우레탄 | 시그마 | U2500 | |
| 자일라진 | 알파 Aesar | J61430 | |
| 소프트웨어 | Company | Version | |
| Graphpad Prism | GraphPad 소프트웨어 | 버전 8 | |
| Intan Recording Controller | Intantech | 버전 2.07 | |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | 버전 5.215 | |
| Plexon 오프라인 스파이크 분류기 | Plexon Inc | 버전 4.5 | |
| ACSF 구성: ACSF를 통해 지속적으로 거품이 발생하는 95% 산소/5%CO2<>의 강> | |||
| 산소화된 ACSF(ACSF, mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 및 25 포도당). |
참고문헌
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
- Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neura....
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재인쇄 및 허가
