시간 경과 현미경 검사를 사용하여 대장균에서 생물학적 소음의 지속적인 측정

Einel A. Chaimovitz; Evgeniy Reznik; Mouna Habib; Netanel Korin; Ramez Daniel

doi:10.3791/61290

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방법 논문

시간 경과 현미경 검사를 사용하여 대장균에서 생물학적 소음의 지속적인 측정

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DOI:

10.3791/61290

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2021년 4월 27일

Einel A. Chaimovitz^*¹ , Evgeniy Reznik^*¹ , Mouna Habib¹ , Netanel Korin¹ , Ramez Daniel¹

¹Department of Biomedical Engineering, Technion - Israel Institute of Technology

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 연구는 합성 유전자 회로의 스토카시 거동을 분석하고 정량화하기 위해 대장균의 단일 세포의 라이브 이미징을 허용하는 현미경 방법을 제시합니다.

초록

여기에서 개발된 프로토콜은 몇 시간 동안 에샤리치아 대장균 분열 및 형광 농도의 컴퓨터 추적을 가능하게 하는 도구를 제공합니다. 이 과정은 최소한의 미디어에서 살아남은 식민지를 선별하여 시작되며, 정확한 플라스미드를 품고 있는 대장균만이 특정 조건에서 번창할 수 있을 것이라고 가정합니다. 많은 DNA 부품의 조립을 요구하는 대형 유전 회로를 구축하는 과정이 어렵기 때문에 회로 구성 요소는 종종 여러 항생제의 사용을 요구하는 다른 복사 번호로 여러 플라스미드 사이에 분포됩니다. 플라스미드의 돌연변이는 항생제 내성 유전자의 전사를 파괴하고 괴사로 이어지는 세포내 자원 관리와 교차할 수 있다. 선택한 식민지는 유리 바닥 페트리 접시에 설정되며 밝은 필드와 형광 도메인 모두에서 현미경 추적을 위해 몇 가지 초점 평면이 선택됩니다. 이 프로토콜은 규제할 수 없는 초기 조건에서 12시간 이상 이미지 포커스를 유지하여 몇 가지 어려움을 초래합니다. 예를 들어, 죽은 세포는 몇 시간 동안 이미징을 한 후 렌즈의 초점 분야에 축적되기 시작하여 독소가 축적되고 신호가 흐리고 부패합니다. 영양소의 고갈은 새로운 신진 대사 과정을 소개하고 회로의 원하는 반응을 방해합니다. 실험의 온도는 유도제와 항생제의 효과성을 낮춥니다, 이는 신호의 신뢰성을 더욱 손상시킬 수 있습니다. 최소한의 미디어 젤은 수축되고 건조되며, 그 결과 시간이 지남에 따라 광학 초점이 변경됩니다. 우리는 다른 미생물을 위한 유사한 방법을 개발하는 이전 작품과 유사한 대장균에있는 이 도전을 극복하기 위하여 이 방법을 개발했습니다. 또한, 이 방법은 변경되지 않은 변경되지 않은 세포에서 총 금세 노이즈를 정량화하는 알고리즘을 제공하여, 결과가 유사한 변동 계수(CV)에 의해 도시된 바와 같이 유량 분석기 예측과 일치한다는 것을 발견한다.

서론

합성 생물학은 지난 10년 동안 등장한 다분야 분야로, 기초과학^4,^5,진단, 치료 및 생명공학적 응용 분야^6,^7,^8,^9,^10을이해하기 위해 살아있는 세포에서 다중 신호 통합 및 처리를 달성하기 위한 노력의 일환으로 엔지니어링 설계 원리를 합리적 생물학적 설계^1,^2,^3으로변환하는 것을 목표로 하고 있다. 합성 유전자 회로의 입력 출력 반응을 정량화하는 당사의 능력은 자동화된 시간 경과 현미경^{검사법(11)을}이용한 유량 분석기 및 라이브 세포 이미징을 포함한 단일 세포 기술의 최근 발전에 의해 혁명을 일으켰습니다. 유량 분석기는 종종 정상 상태^1,^....