뼈 전이 모델은 균일하게 또는 100% 발생률로 전이가 발생하지 않습니다. 직접 골내 종양 세포 주사는 폐 색전술을 초래할 수 있습니다. 우리는 고형 종양 이식편을 뼈에 이식하여 원발성 뼈 종양 및 뼈 전이를 모델링하여 재현 가능한 생착 및 성장을 유도하는 기술을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
원발성 뼈 종양 또는 고형 종양의 뼈 전이는 고통스러운 골용해성, 조골세포 또는 혼합성 골용해성/조골아세포 병변을 초래합니다. 이러한 병변은 뼈 구조를 손상시키고 병적 골절의 위험을 증가시키며 환자에게 제한된 치료 옵션을 남깁니다. 원발성 뼈 종양은 먼 장기로 전이되며 일부 유형은 다른 골격 부위로 퍼질 수 있습니다. 그러나 최근의 증거에 따르면 많은 고형 종양에서 뼈로 퍼진 암세포가 궁극적으로 다른 장기 시스템으로 전이되는 세포의 주요 공급원이 될 수 있습니다. 원발성 골 종양의 대부분의 동계 또는 이종이식 마우스 모델은 종양 세포 현탁액의 골내(orthotopic) 주사를 수반합니다. 고형 종양에서 골격 전이의 일부 동물 모델은 직접 뼈 주입에 의존하는 반면, 다른 모델은 세포를 혈관 내 또는 원발성 종양의 기관에 주입하여 뼈 전이성 캐스케이드의 추가 단계를 요약하려고 시도합니다. 그러나 이러한 모델 중 어느 것도 안정적으로 또는 100%의 발생률로 뼈 전이를 진행하지 않습니다. 또한, 종양 세포의 직접적인 골내 주사는 폐의 잠재적인 종양 색전술과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 이러한 색전성 종양 세포는 생착되지만 전이성 캐스케이드를 재현하지는 않습니다. 우리는 최소 침습 수술 기술을 사용하여 신선하거나 냉동 보존된 종양 조각(종양 세포와 기질로 구성됨)을 근위 경골에 직접 이식하는 골육종의 마우스 모델을 보고했습니다. 이 동물들은 재현 가능한 생착, 성장, 그리고 시간이 지남에 따라 골용해 및 폐 전이를 일으켰습니다. 이 기술은 고형 종양 뼈 전이를 모델링하는 데 사용할 수 있는 다재다능함을 가지고 있으며 하나 또는 여러 세포 유형, 유전자 변형 세포, 환자 유래 이종 이식편 및/또는 광학 또는 고급 이미징으로 추적할 수 있는 표지된 세포로 구성된 이식편을 쉽게 사용할 수 있습니다. 여기에서는 뼈에 고형 종양 이식 이식을 사용하여 원발성 뼈 종양 및 뼈 전이를 모델링하는 이 기술을 시연합니다.
서론
인간 및 동물 질병의 마우스 모델은 생물 의학 연구에서 점점 인기를 얻고 있습니다. 이러한 맥락에서 마우스를 사용하는 것의 유용성은 해부학과 생리학이 인간과 매우 유사하다는 것입니다. 이들은 출생 후 성숙기에 이르는 임신 기간과 기간이 상대적으로 짧으며, 개발 또는 구매 비용의 증가가 유전자 변형, 면역결핍 및/또는 인간화의 정도를 증가시키기는 하지만, 상대적으로 저렴한 비용과 주거 용이성과 크게 연관되어 있다1. 근친 교배 균주의 사용은 연구 포함 전에 대체로 균일한 동물 개체군을 초래합니다. 그들의 게놈에 대한 완전한 지식은 인간과 높은 수준의 유사성을 시사합니다. 많은 질병 과정에 대한 상동 분자 표적이 마우스 게놈에서 확인되었으며 현재 쉽게 얻을 수 있는 광범위한 마우스 특이적 시약 라이브러리가 있습니다. 따라서 더 큰 동물 모델과 비교할 때 더 빠르고 저렴한 방식으로 상대적으로 높은 처리량의 분석을 할 수 있는 기회를 제공합니다1. 또한, 특정 유전자를 전 세계적으로 또는 세포 유형 특이적 방식으로 및/또는 구성적으로 또는 유도 가능한 방식으로 과발현 또는 결실시킬 수 있는 유전자 편집 전략의 출현과 함께, 이는 인간 및 동물 질병 조사에 매우 생물학적으로 유용한 모델 시스템을 대표한다
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프로토콜
설명된 모든 동물 실험은 영국 케임브리지에 있는 케임브리지 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 세포주의 제조
- 전통적인 세포 배양 또는 생쥐 주입을 위한 실험실의 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 세포주를 성장시킵니다. 여기에 사용된 표준 프로토콜은 10% 소 태아 혈청(FBS), L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신(이하 완전 성장 배지로 알려짐)을 포함하는 Dulbecco의 변형 Eagle's 배지에서의 성장입니다.
참고: 이 실험에서 Abrams 골육종 세포는 Balb/c Foxn1 nu/nu 마우스에 사용됩니다. 유방암 연구의 경우 Balb/c 마우스의 4T1 세포와 C57BL/6 마우스의 EO771 세포가 사용됩니다. - 5%CO2 중 37°C에서 통기된 조직 배양 플라스크 또는 6-웰 조직 배양 플레이트에서 세포를 성장시킵니다.
- 관심있는 세포주를 계대배양하고, 세포가 마우스에 이들 세포를 주입하는 데 통상적으로 사용되는 컨밀도에 도달할 때 주입을 위해 세포를 준비한다.
2. 동물
- 피하 종양 발생을 위해 최소 6-8주령의 Balb/c
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결과
양성 결과는 시간 경과에 따른 종양 생착 및 진행성 종양 성장과 관련이 있습니다. 종양 유형에 따라 골내 종양 성장은 진행성 뒷다리 파행과 관련이 있을 수 있지만 많은 종양은 수반되는 뼈 질환의 징후에도 불구하고 파행을 유발하지 않습니다. 성공적인 생착은 고급 영상으로 문서화되었으며, 이에 따라 관심 세포주의 뼈 표현형(골용해성, 조골세포 또는 혼합 골용해성/조골아세포 전이)과 관련된 근위 경골에 진행성 방사선사진, μCT 또는 μMRI 변화가 있을 것입니다(그림 1)8. 이전 보고서에서 종양 이식 이식을 위해 생성된 피질 결손은 이식 1주일 후 근위 경골에서 볼 수 있었습니다(그림 1A). 2주차까지 피질 결손에 인접한 눈에 띄는 골용해 및 뼈 리모델링이 있었습니다. 2주에서 5주까지 종양 생착 및 성장과 관련된 점진적인 뼈 파괴 및 새로운 뼈 형성이 있었습니다(
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토론
이 보고서는 종양 동종이식편의 경골내 이식 후 원발성 뼈 종양 또는 뼈 전이를 생성하기 위한 우리의 모델을 문서화합니다. 우리는 이 과정에서 몇 가지 중요한 단계가 있다고 믿습니다. 종양 세포 현탁액의 피하 주사와 결과 종양 조각의 경골 내 배치 모두에 대해 안전한 마취 평면이 설정되어야합니다. 피하 동종 이식편 제거와 동종 이식편의 경골 내 배치를 위해 수술 부위를 멸균 준비해야합니다. 종양 동종 이식편 단편은 후속 경골 내 이식을 위해 균일하게 생성되어야합니다. 종양 조각의 이식을 위해 근위 경골에 적절한 크기의 결손을 만들어야합니다. 수술 후 상처 합병증의 위험을 줄이기 위해 수술 피부 상처를 완전히 봉합해야 합니다. 마지막으로 중요한 단계는 세포외 기질이 피하 주사를 위한 종양 세포 현탁액의 일부로 사용되는 경우 주사 전에 현탁액이 응고되는 것을 방지하기 위해 제조업체에서 권장하는 취급 지침을 사용해야 한다는 것입니다. 사지의 적절한 멸균 준비, 멸균 수술 중 기술 및 완전한 상처 봉합은 수술 후 수술 상처 합병증의 가능.......
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공개 사항
Hildreth 박사는 수상 번호 K01OD026527로 NIH의 자금 지원을 받았습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
감사의 글
저자는 이 기술의 개발에 대한 Dr. Beth Chaffee, DVM, PhD, DACVP의 중요한 공헌을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| #15 메스 블레이드 | Henry Schein Ltd. | 75614 | 없음 |
| 6웰 조직 배양 플레이트 | Thermo Fisher Scientific | 10578911 | 종양 조각을 다지는 데 사용됩니다. 세포 배양에도 사용할 수 있습니다 |
| Abrams 골육종 세포주 | 해당 없음 | 해당 없음 이 | |
| 소플루란 기화기 및 산소 탱크가 있는 마취기VetEquip | 901805 | 없음 | |
| 동물 체중계 | Kent Scientific | SCL- 1015 | 없음 |
| BALB/c 누드 마우스(nu/nu) | Charles River Ltd. | NA | 6-8주령. 수컷 또는 암컷 마우스 |
| 뼈 시멘트 | Depuy Synthes | 160504 | 뼈 왁스 대신 선택적 사용 |
| 뼈 왁스 | Ethicon | W31G | 옵션 |
| Buprenorphine | Animalcare Ltd. | N/A | Buprecare 0.3 mg/ml 개와 고양이를 위한 주사용 용액 |
| 이산화탄소 안락사 스테이션 | 해당 사항 없음 | 해당 사항 없음 | 동물 시설 내에 제공되어야 함 |
| 세포 배양 인큐베이터는 37°C로 설정됩니다. C 및 5% 이산화탄소 | Heraeus | 다양한 | 없음 |
| 클로르헥시딘 수술용 스크럽 | 베토퀴놀 | 411412 | 없음 |
| Cryovials(2ml) | Thermo Scientific Nalgene | 5000-0020 | 동결 보존하는 경우 선택 사항 |
| D-루시페린(반딧불이), 칼륨 염 | Perkin Elmer | 122799 | 관심 세포주에 생물 발광 리포터 유전자가 있는 경우 선택 사항 |
| 디지털 캘리퍼스 | Mitutoyo | 500-181-30 | 수동 가능 |
| 디지털 현미경 촬영 캐비닛 | Faxitron Bioptics, LLC | MX-20 | 종양 성장에 대한 뼈 반응을 평가하기 위한 선택 사항 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 1371171000 | 종양 단편 Dulbecco를 동결 보존하는 경우 선택 사항 |
| s 변형 된 독수리' s 매체 | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | 없음 |
| 에탄올 (70%) | Sigma Aldrich | 2483 | 없음 |
| 소 태아 혈청 | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | 없음 |
| 겸자, Dumont | Fine Science Tools, Inc. | 11200-33 | 없음 |
| 냉동고 (– 80 ° C) | Sanyo | MDF-794C | 종양 조각을 동결 보존하거나 스냅 동결하는 경우 선택 |
| 적혈구 측정기 | Thermo Fisher Scientific | 11704939 | 가능한 경우 자동 세포 계수기를 사용할 수도 있습니다 |
| 피하 주사 바늘 (27 게이지) | Henry Schein Ltd. | DIS55510 | 25G(DIS55509) 및 30G(카탈로그 DIS599) 바늘을 사용할 수도 있습니다. |
| 얼음 | N/A | N/ | A 주사기 및 세포 현탁액 보관용 용기에 이상적으로 작은 조각 |
| 홍채 가위 Fine | Science Tools, Inc. | 14084-08 | 없음 |
| Isoflurane | Henry Schein Ltd. | 1182098 | 없음 |
| IVIS Lumina III 생물 발광/형광 이미징 시스템 | Perkin Elmer | CLS136334 | 관심 세포주에 생물 발광 또는 형광 리포터 유전자가 있는 경우 선택 사항 |
| L-글루타민 | Thermofisher scientifc | 25030081 | 없음 |
| 액체 질소 | British Oxygen Corporation | NA | 종양 단편을 동결 보존 또는 스냅 동결하는 경우 선택 사항 |
| 액체 질소 듀어, 5리터 | Thermo Fisher Scientific | TY509X1 | 동결 보존하는 경우 선택 사항입니다 |
| . Matrix GFR, LDEV-Free, 5ml | Corning Life Sciences | 356230 | 옵션. 10ml 크기로도 사용 가능(354230), |
| 마이크로 원심분리기 | Thermo Fisher Scientific | 75002549 | 펠릿 셀, 1200rpm에서 5-6분 동안 |
| . Frosty 냉동 격납기 | , Fisher Scientific | 10110051 | 종양 조각을 동결 보존하는 경우 선택 사항, |
| NAIR, 제모 로션/오일 | Thermo Fisher Scientific | NC0132811 | 미세한 칼날이 있는 전기 클리퍼를 대안적으로 사용할 수 있습니다. |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 시그마-알드리치 | P4333 | 없음 |
| 메스 손잡이, #7 Short | Fine Science Tools, Inc. | 10007-12 | 사용자 선호 #15 메스 블레이드 |
| 소형 동물 가열 패드 | VetTech | HE006 | 없음 |
| 실체 현미경 | GT Vision Ltd. | H600BV1 | 없음 |
| 멸균 인산염 완충 식염수(PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | 주사용 및 수술용 스크럽의 일부로 사용, 클로르헥시딘과 교대로 |
| 조직 접착제(멸균) | 3M Corporation | 84-1469SB | 비흡수성 피부 봉합사(6-0 size)를 대안적으로 사용할 수 있음Trypan |
| blue | Thermo Fisher Scientific | 5250061 | 없음 |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05%-0.25% |
| 투베르큘린 주사기(0.1ml 그라데이션 포함 1ml) | 를 사용하는 Becton Dickinson | 309659 | Luer |
| Vented 조직 배양 플라스크보다 선호되는 슬립 팁, T-75 | Corning Life Sciences | CLS3290 | 필요에 따라 더 작거나 큰 플라스크를 사용할 수도 있습니다. |
참고문헌
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6
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