방법 논문

원발성 뼈 종양 및 뼈에 이식된 고형 종양을 통한 뼈 전이 모델링

DOI:

10.3791/61313

⸱

2020년 9월 9일

 ,  , 
1Department of Pathology and O'Neal Comprehensive Cancer Center, University of Alabama at Birmingham, 2Surgical Discovery Centre, Department of Veterinary Medicine, University of Cambridge

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

뼈 전이 모델은 균일하게 또는 100% 발생률로 전이가 발생하지 않습니다. 직접 골내 종양 세포 주사는 폐 색전술을 초래할 수 있습니다. 우리는 고형 종양 이식편을 뼈에 이식하여 원발성 뼈 종양 및 뼈 전이를 모델링하여 재현 가능한 생착 및 성장을 유도하는 기술을 제시합니다.

초록

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원발성 뼈 종양 또는 고형 종양의 뼈 전이는 고통스러운 골용해성, 조골세포 또는 혼합성 골용해성/조골아세포 병변을 초래합니다. 이러한 병변은 뼈 구조를 손상시키고 병적 골절의 위험을 증가시키며 환자에게 제한된 치료 옵션을 남깁니다. 원발성 뼈 종양은 먼 장기로 전이되며 일부 유형은 다른 골격 부위로 퍼질 수 있습니다. 그러나 최근의 증거에 따르면 많은 고형 종양에서 뼈로 퍼진 암세포가 궁극적으로 다른 장기 시스템으로 전이되는 세포의 주요 공급원이 될 수 있습니다. 원발성 골 종양의 대부분의 동계 또는 이종이식 마우스 모델은 종양 세포 현탁액의 골내(orthotopic) 주사를 수반합니다. 고형 종양에서 골격 전이의 일부 동물 모델은 직접 뼈 주입에 의존하는 반면, 다른 모델은 세포를 혈관 내 또는 원발성 종양의 기관에 주입하여 뼈 전이성 캐스케이드의 추가 단계를 요약하려고 시도합니다. 그러나 이러한 모델 중 어느 것도 안정적으로 또는 100%의 발생률로 뼈 전이를 진행하지 않습니다. 또한, 종양 세포의 직접적인 골내 주사는 폐의 잠재적인 종양 색전술과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 이러한 색전성 종양 세포는 생착되지만 전이성 캐스케이드를 재현하지는 않습니다. 우리는 최소 침습 수술 기술을 사용하여 신선하거나 냉동 보존된 종양 조각(종양 세포와 기질로 구성됨)을 근위 경골에 직접 이식하는 골육종의 마우스 모델을 보고했습니다. 이 동물들은 재현 가능한 생착, 성장, 그리고 시간이 지남에 따라 골용해 및 폐 전이를 일으켰습니다. 이 기술은 고형 종양 뼈 전이를 모델링하는 데 사용할 수 있는 다재다능함을 가지고 있으며 하나 또는 여러 세포 유형, 유전자 변형 세포, 환자 유래 이종 이식편 및/또는 광학 또는 고급 이미징으로 추적할 수 있는 표지된 세포로 구성된 이식편을 쉽게 사용할 수 있습니다. 여기에서는 뼈에 고형 종양 이식 이식을 사용하여 원발성 뼈 종양 및 뼈 전이를 모델링하는 이 기술을 시연합니다.

서론

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인간 및 동물 질병의 마우스 모델은 생물 의학 연구에서 점점 인기를 얻고 있습니다. 이러한 맥락에서 마우스를 사용하는 것의 유용성은 해부학과 생리학이 인간과 매우 유사하다는 것입니다. 이들은 출생 후 성숙기에 이르는 임신 기간과 기간이 상대적으로 짧으며, 개발 또는 구매 비용의 증가가 유전자 변형, 면역결핍 및/또는 인간화의 정도를 증가시키기는 하지만, 상대적으로 저렴한 비용과 주거 용이성과 크게 연관되어 있다1. 근친 교배 균주의 사용은 연구 포함 전에 대체로 균일한 동물 개체군을 초래합니다. 그들의 게놈에 대한 완전한 지식은 인간과 높은 수준의 유사성을 시사합니다. 많은 질병 과정에 대한 상동 분자 표적이 마우스 게놈에서 확인되었으며 현재 쉽게 얻을 수 있는 광범위한 마우스 특이적 시약 라이브러리가 있습니다. 따라서 더 큰 동물 모델과 비교할 때 더 빠르고 저렴한 방식으로 상대적으로 높은 처리량의 분석을 할 수 있는 기회를 제공합니다1. 또한, 특정 유전자를 전 세계적으로 또는 세포 유형 특이적 방식으로 및/또는 구성적으로 또는 유도 가능한 방식으로 과발현 또는 결실시킬 수 있는 유전자 편집 전략의 출현과 함께, 이는 인간 및 동물 질병 조사에 매우 생물학적으로 유용한 모델 시스템을 대표한다2.

암은 마우스 모델이 큰 유용성을 갖는 분야 중 하나입니다. 암의 유전자 마우스 모델은 세포가 발암성 형질전환을 겪기 위해 종양유전자 또는 종양 억제 유전자의 발현 조절에 단독으로 또는 조합하여 의존합니다. 마우스에 원발성 또는 확립 된 종양 세포주를 주입하는 것도 수행됩니다. 인간 또는 생쥐를 포함한 다른 동물 종의 세포주 또는 조직의 도입은 생체 내에서 가장 널리 사용되는 암 모델로 남아 있습니다. 면역이 저하된 마우스에서 이종 종(이종 이식편)의 세포 및 조직을 사용하는 것이 가장 일반적으로 시행된다2. 그러나, 숙주와 수용자가 모두 동일한 종인 동종이식 종양 세포 또는 조직의 사용은 동종 시스템에서 동일한 숙주 마우스 균주와 결합될 때 온전한 면역계와의 상호작용을 허용한다3.

원발성 골 종양 또는 고형 종양으로 인한 골 전이는 고통스러운 골용해성, 조골용해성 병변, 또는 혼합성 골용해성/조골아세포 병변을 초래한다 3,4. 이 종양은 뼈 구조를 손상시켜 병적 골절의 위험을 증가시키고 환자에게 제한된 치료 옵션을 남깁니다. 원발성 뼈 종양은 먼 장기로 전이되며 일부 유형은 다른 골격 부위로 퍼질 수 있습니다. 유방암 환자에서 뼈는 첫 번째 전이의 가장 흔한 부위이며 전이성 질환의 가장 빈번한 첫 번째 부위입니다 5,6. 또한, 파종성 종양세포(disseminated tumor cell, DTCs)는 다른 장기의 전이를 진단하기 전에 골수에 존재하며, 전이의 진행을 예측한다7. 따라서 뼈에 존재하는 암세포는 궁극적으로 다른 장기 시스템으로 전이되는 세포의 원천이라고 믿어집니다. 고형 종양 전이가 주로 폐와 림프절에서 전이가 발생하는 많은 마우스 모델이 존재하며, 종양 유형 및 주사 기술에 따라 잠재적으로 다른 장기 시스템이 발생할 수 있다3. 그러나, 뼈 전이의 마우스 모델은 마우스가 원발성 종양 부담 또는 다른 장기로의 전이로부터 조기 제거 기준에 도달하기 전에 신뢰할 수 있고 재현성 있게 부위 특이적 골격 전이를 생성하고 뼈 전이를 진행하는 것이 부족하다. 우리는 생쥐의 근위 경골에 고형 종양 동종이식편을 외과적으로 이식하는 원발성 골종양 골육종의 모델을 보고했다8. 뼈 종양은 생쥐의 100 %에서 형성되었고 88 %는 폐 전이를 일으켰습니다. 이 전이 발생률은 사람(~20-50%)에서 임상적으로 일반적으로 보고되는 것보다 높지만 폐가 골육종의 가장 흔한 전이 부위이기 때문에 큰 관심을 끌고 있습니다 9,10,11. 이 모델은 원발성 골 종양을 모델링하는 데 유리하지만 유방, 폐, 전립선, 갑상선, 간, 신장 및 위장관 종양과 같은 다른 골성 고형 종양의 뼈 전이를 모델링하는 데에도 큰 유용성을 가지고 있습니다.

이 모델 개발의 근거는 원발성 뼈 종양 또는 뼈 전이를 모델링하기 위해 일반적으로 근위 경골 또는 원위 대퇴골에 전통적인 골내 주사에 대한 대안을 개발하는 것이었다12. 우리의 주요 목표는 이 기술의 알려진 한계, 즉 폐의 종양 색전술을 완화하는 것이었습니다. 그 결과 이러한 색전성 종양 세포의 생착과 폐로 전이되는 확립된 원발성 골 종양으로부터 완전한 전이성 캐스케이드를 요약하지 않는 "인공성 전이"가 발생합니다 8,13. 이것은 또한 확립 된 뼈 전이가 먼 부위로 퍼지는 상황 일 것입니다. 또한, 이 기술은 동소 또는 혈관 내 주사 기술과 비교할 때 뼈와 균일한 부위에서 종양의 생착 및 성장의 더 큰 발생률을 보장하는 뼈 전이 모델을 생성하기 위해 개발되었습니다. 이 모델은 이러한 설명된 기술에 비해 뚜렷한 이점이 있습니다. 이 모델은 종양 세포를 뼈 내로 제어되고 일관되게 전달하는 것을 포함합니다. 또한 폐색전술 후 인공성 폐 전이를 방지하고 기준선 균일 연구 모집단을 설정합니다. 원발성 종양 또는 다른 장기로의 전이로 인한 조기 제거 기준의 위험 없이 이 모델을 사용하면 부위 특이적 종양의 이점이 있습니다. 마지막으로, 이 모델은 환자 유래 이종이식의 사용을 포함하여 수정에 큰 유용성을 가지고 있습니다.

제시된 모델은 외과적 접근 방식에 따라 뼈에 직접 세포 현탁액을 주입한 후 피질을 통해 주사하거나 피질에 작은 결함을 만든 후(수질을 빼내거나 빼지 않고) 골수강으로 전달하는 것과 유사합니다.8,14,15,16,17 . 그러나 종양 동종 이식편을 이식하면이 기술이 뚜렷하게 다릅니다. 따라서 이 보고서의 목적은 이전에 설명된 모델의 많은 한계를 극복하는 원발성 뼈 종양 및 고형 종양으로부터의 뼈 전이의 이 모델을 입증하는 것이었습니다. 세포 배양, 마우스 모델, 마우스 마취 및 수술, 마우스 해부학 경험이 있는 연구 그룹은 마우스의 원발성 뼈 종양 또는 뼈 전이를 모델링하는 기술을 재현할 수 있는 장비를 잘 갖추고 있습니다.

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프로토콜

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설명된 모든 동물 실험은 영국 케임브리지에 있는 케임브리지 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 세포주의 제조

  1. 전통적인 세포 배양 또는 생쥐 주입을 위한 실험실의 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 세포주를 성장시킵니다. 여기에 사용된 표준 프로토콜은 10% 소 태아 혈청(FBS), L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신(이하 완전 성장 배지로 알려짐)을 포함하는 Dulbecco의 변형 Eagle's 배지에서의 성장입니다.
    참고: 이 실험에서 Abrams 골육종 세포는 Balb/c Foxn1 nu/nu 마우스에 사용됩니다. 유방암 연구의 경우 Balb/c 마우스의 4T1 세포와 C57BL/6 마우스의 EO771 세포가 사용됩니다.
  2. 5%CO2 중 37°C에서 통기된 조직 배양 플라스크 또는 6-웰 조직 배양 플레이트에서 세포를 성장시킵니다.
  3. 관심있는 세포주를 계대배양하고, 세포가 마우스에 이들 세포를 주입하는 데 통상적으로 사용되는 컨밀도에 도달할 때 주입을 위해 세포를 준비한다.

2. 동물

  1. 피하 종양 발생을 위해 최소 6-8주령의 Balb/c Foxn1 nu/nu 마우스를 사용하여 동물이 급속한 성장 단계를 넘어 성체 및 골격 성숙을 달성했는지 확인합니다.
  2. 수컷 또는 암컷 마우스를 사용하십시오. 호르몬 반응성 세포주(예: 암컷 생쥐의 유방암 세포 및 수컷 생쥐의 전립선암 세포)를 선택할 때 예외를 만듭니다.
  3. 이종이식 실험의 경우, 정상적인 조건에서 온전한 마우스 면역 체계와 호환되지 않는 세포주를 기반으로 하는 면역결핍 무흉선 누드 마우스를 사용합니다.
  4. 쥐 세포주를 이용한 동종이식 실험의 경우, 이는 또한 이질적인 마우스 유전적 및 면역적 배경을 기반으로 하는 것이 좋습니다. 그러나 syngeneic 실험의 경우 관심 있는 세포주와 동일한 균주의 동물을 사용합니다.
  5. 기관의 축산 정책에 따라 표준 밀도의 가축을 사육합니다.

3. 피하 종양

  1. 트립신 처리에 의해 배양물로부터 세포주를 수확하고 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁합니다.
  2. 세포 생존율을 평가하고 트립판 블루 배제 방법으로 세포 밀도를 결정합니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 세십시오. 90%의 최소 세포 생존율은 피하 종양을 생성하기 위해 마우스에 주사하는 데 사용됩니다.
  3. 1-2 x 105 세포를 0.1 내지 0.15 mL (100 내지 150 μL)의 최종 부피로 멸균된 PBS에 주입하여 세포 밀도를 조정한다. 주사 할 때까지 세포를 얼음 위에 보관하십시오.
  4. 대안적으로, 펠렛 세포를 800 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고, 펠렛화된 세포를 희석되지 않은 멸균 기저막 매트릭스 배지에 재현탁하여 0.1 내지 0.15 mL (100 내지 150 μL)의 최종 부피로 1-2 x 105 세포를 수득한다. 더 사용할 때까지 세포를 얼음 위에 보관하십시오.
  5. 산소 마취에서 이소플루란으로 피하 종양 성장에 사용할 마우스를 마취합니다. 5L/min 산소에 2% 이소플루란의 유도 용량을 사용하고 2L/min 산소에 3-2% 이소플루란의 유지 용량을 사용하십시오. 계속 진행하기 전에 깜박임이나 페달 반사가 없는지 확인하십시오.
    참고: 이소플루란은 흡입 마취제입니다. 적절한 청소 및 무료 가스 수집 시스템이 있는 환기가 잘 되는 장소에서 이소플루란을 사용하십시오. 기관 수의사와 상의하여 마취 유도, 유지 관리 및 모니터링 계획을 개발하고 실험실 직원이 마취 모니터링 및 흡입 마취제 취급에 대한 적절한 교육을 받았는지 확인하십시오.
  6. 탈모 용액 또는 전기 클리퍼로 마취 된 생쥐의 흉부 또는 복부의 등쪽 부위에서 머리카락을 제거하십시오. 피부에 대한 잠재적인 외상을 최소화하기 위해 제모 용액이 선호됩니다. 무흉선 누드 마우스를 사용하는 경우 이 단계를 건너뜁니다.
  7. 세포 현탁액을 주입하기 전에 70% 에탄올 면봉으로 준비된 부위를 세척합니다.
  8. 27G 바늘이 있는 1mL 투베르쿨린 주사기를 사용하여 견갑골의 움직임에 영향을 받지 않도록 흉부 또는 복부의 등쪽 부위에 세포를 피하 주사합니다. 대안적으로, 시판되는 세포외 기질에 현탁액으로서 세포를 피하 주사한다.
    참고: 상업적으로 이용 가능한 세포외 기질에 주입하면 이러한 기질이 실온에서 응고되기 때문에 피하 공간에서 세포 현탁액의 이동이 제한됩니다.
  9. 보행이 가능할 때까지 개별 케이지의 가열 패드에서 마우스를 회수하십시오. 그런 다음 마우스를 깨끗하고 건조한 침구로 일반 케이지에 넣을 수 있습니다.
  10. 캘리퍼스로 등쪽 흉부 또는 복부 위에 있는 피하 종양의 크기를 모니터링하고 매주 체중을 측정하여 피하 종양이 궤양을 일으키지 않거나 마우스가 기관의 동물 관리 및 사용 위원회에서 설정한 조기 제거 기준을 충족하는지 확인합니다. 피부 궤양이나 중심 종양 괴사의 위험을 줄이기 위해 모든 치수에서 최대 15mm의 종양 크기를 권장합니다.
    참고: 현지 지침을 참조하여 최대 허용 종양 크기/부피를 결정하십시오.
  11. 3 내지 4주 후에 피하 종양을 갖는 마우스를CO2 흡입에 의한 후 자궁경부 탈구에 의해 안락사시킨다. 마우스 안락사에 대한 기관의 허용 가능한 정책을 따르십시오.
  12. 무균 수술 기술을 사용하여 피하 종양을 채취합니다. 모발을 제거한 후 70 % 에탄올로 종양 위에있는 피부를 이전과 같이 소독하십시오 (해당되는 경우). #15 메스 블레이드(메스 블레이드 핸들 유무에 관계없이)로 종양 위에 있는 피부를 절개합니다. 멸균 수술 용 가위로 주변의 부착 된 연조직에서 종양을 날카롭게 해부하십시오.
  13. 종양을 완전한 성장 배지가 들어 있는 6웰 조직 배양 플레이트에 넣고 미리 결정된 크기의 여러 개의 작은 조각(~ 0.6mm x 0.6mm x 0.6mm – 0.25mm3 에서 최대 1mm x 1mm x 1mm x 1mm – 1mm3) #15 메스 블레이드(메스 블레이드 핸들 포함 또는 제외).
  14. 종양 단편을 경골 내 이식 시점까지 실온에서 멸균 완전 성장 배지에 유지합니다. 루시페라아제 또는 형광 리포터 유전자를 운반하는 세포주의 경우, 생체 외 생체발광 또는 형광 이미징을 사용하여 마우스에 경골내 이식하기 전에 종양 생존력을 확인합니다.
  15. 냉동 보존을 위해 20% FBS 및 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)가 보충된 완전한 성장 배지에 동일한 극저온 혼합물에 여러 단편을 넣습니다. 상업용 냉동 보존 시스템을 사용하여 –80°C에서 점진적으로 동결하고 액체 질소에 장기간 보관합니다. 액체 질소 침지를 사용하여 급속 냉동하여 후속 분석을 위해 종양 단편을 보존하되 향후 이식을 위해 보존하지 마십시오. 이러한 냉동 종양 단편을 -80°C에서 장기간 보관하십시오.
    참고: 스냅 동결 종양은 생체 내에서 생착 및 성장하지 않는다는 것이 이전에 보고되었습니다8.

4. 피하 종양 조각의 외과 적 이식

  1. 외과적 이식 전에 완전한 성장 배지에서 피하 종양의 신선하거나 냉동보존된 단편을 실온으로 가져옵니다.
  2. 섹션 3에 설명된 바와 같이 산소 마취에서 이소플루란을 사용하여 관심 균주의 마우스를 마취합니다. 계속하기 전에 페달 반사가 부족한지 확인하십시오. 수술 전후 진통을 제공하기 위해 0.02-0.05 mg/kg의 용량으로 피하 부프레노르핀을 투여합니다. 필요한 경우 수술 후 6-8 시간마다 반복 할 수 있습니다.
  3. 오른쪽 무릎 관절과 뒷다리의 근위 경골의 털을 제모 용액으로 제거하여 피부에 대한 잠재적 외상을 최소화하십시오.
  4. 수술 용 방부제로 준비된 부위를 문지릅니다. 먼저 70% 에탄올 면봉으로 문지른 다음 클로르헥시딘과 식염수 스크럽을 번갈아 가며 문지릅니다.
  5. 근위 경골을 무릎 관절의 원위 부위로 시각화하고 관절을 구부리고 확장합니다.
  6. #3 메스 블레이드(메스 블레이드 핸들 유무에 관계없이)를 사용하여 사지 내측의 근위 경골 수준에서 4-15mm 절개를 만듭니다. 근위 경골의 내측 피질을 노출시키기 위해 피부와 피하 조직을 절개합니다.
  7. 25G 바늘 끝으로 부드러운 압력을 가하고 끝을 회전시켜 근위 경골의 내측 피질에 작은 구멍을 만듭니다. 이 구멍을 두개골과 꼬리 경골 피질 사이의 등거리 지점에서 무릎 관절 원위까지 약 2mm 만듭니다. 종양 조각의 크기에 따라 바늘 크기를 선택하십시오.
  8. 멸균 집게를 사용하여 종양 조각을 집어 근위 경골의 수질강에 삽입하십시오. 27-30G 바늘을 사용하여 종양 조각을 수질관으로 조작합니다. 종양 조각의 크기에 따라 각 경골에 최소 0.5mm3 의 총 종양 부피를 이식합니다. 이것은 생성 된 종양 조각의 크기에 따라 1 개 이상의 종양 조각의 이식이 필요할 수 있습니다.
    참고: 뼈 외부에서 이식편의 변위를 방지하거나 제한하기 위한 수정은 뼈 결손에 뼈 왁스 또는 뼈 시멘트를 배치하거나 뼈의 구멍 위에 젤 폼 또는 피하 지방 이식편을 배치하는 것입니다.
  9. 멸균 액체 조직 접착제 또는 단일 피부 봉합사로 피부 가장자리를 바르십시오. 이 부위에 상처 클립을 사용하지 마십시오. 수술 후 형광 이미징을 사용하는 경우 조직 접착제와 봉합사 모두 형광을 발할 가능성이 있으므로 주의하십시오.
  10. 보행이 가능할 때까지 개별 케이지의 가열 패드에서 마우스를 회수하십시오.

5. 시리얼 및 엔드포인트 평가

  1. 이전에 설명한 바와 같이 산소 마취에서 isoflurane을 사용하여 마우스를 마취시킵니다.
  2. 매주 디지털 방사선 촬영, 생물발광 또는 형광 이미징(루시페라아제 또는 형광 리포터 유전자를 발현하는 세포를 사용하는 경우)을 통해 비침습적으로 경골 종양 성장을 평가합니다. 이식 부위의 사지의 캘리퍼스 측정은 깨어있는 마우스에서도 수행 할 수 있습니다.
  3. 종양이 있는 마우스(체중, 활동 수준, 호흡수, 몸단장, 자세, 정신 및 행동)에 대한 전통적인 모니터링 외에도 뒷다리 파행, 부기 및 수술 부위 감염의 징후에 대해 매주 마우스를 모니터링합니다.
  4. 피부 상처가 치유될 때까지 처음 10-14일 동안 피부 수술 상처에 과도한 발적, 부기, 배액 및 상처 열개에 대해 모니터링합니다. 4-5주 후, 연구 결과 평가에 따라 마우스를 살아 있거나 안락사 후에 평가합니다.

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결과

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양성 결과는 시간 경과에 따른 종양 생착 및 진행성 종양 성장과 관련이 있습니다. 종양 유형에 따라 골내 종양 성장은 진행성 뒷다리 파행과 관련이 있을 수 있지만 많은 종양은 수반되는 뼈 질환의 징후에도 불구하고 파행을 유발하지 않습니다. 성공적인 생착은 고급 영상으로 문서화되었으며, 이에 따라 관심 세포주의 뼈 표현형(골용해성, 조골세포 또는 혼합 골용해성/조골아세포 전이)과 관련된 근위 경골에 진행성 방사선사진, μCT 또는 μMRI 변화가 있을 것입니다(그림 1)8. 이전 보고서에서 종양 이식 이식을 위해 생성된 피질 결손은 이식 1주일 후 근위 경골에서 볼 수 있었습니다(그림 1A). 2주차까지 피질 결손에 인접한 눈에 띄는 골용해 및 뼈 리모델링이 있었습니다. 2주에서 5주까지 종양 생착 및 성장과 관련된 점진적인 뼈 파괴 및 새로운 뼈 형성이 있었습니다(

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토론

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이 보고서는 종양 동종이식편의 경골내 이식 후 원발성 뼈 종양 또는 뼈 전이를 생성하기 위한 우리의 모델을 문서화합니다. 우리는 이 과정에서 몇 가지 중요한 단계가 있다고 믿습니다. 종양 세포 현탁액의 피하 주사와 결과 종양 조각의 경골 내 배치 모두에 대해 안전한 마취 평면이 설정되어야합니다. 피하 동종 이식편 제거와 동종 이식편의 경골 내 배치를 위해 수술 부위를 멸균 준비해야합니다. 종양 동종 이식편 단편은 후속 경골 내 이식을 위해 균일하게 생성되어야합니다. 종양 조각의 이식을 위해 근위 경골에 적절한 크기의 결손을 만들어야합니다. 수술 후 상처 합병증의 위험을 줄이기 위해 수술 피부 상처를 완전히 봉합해야 합니다. 마지막으로 중요한 단계는 세포외 기질이 피하 주사를 위한 종양 세포 현탁액의 일부로 사용되는 경우 주사 전에 현탁액이 응고되는 것을 방지하기 위해 제조업체에서 권장하는 취급 지침을 사용해야 한다는 것입니다. 사지의 적절한 멸균 준비, 멸균 수술 중 기술 및 완전한 상처 봉합은 수술 후 수술 상처 합병증의 가능...

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공개 사항

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Hildreth 박사는 수상 번호 K01OD026527로 NIH의 자금 지원을 받았습니다.  내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이 기술의 개발에 대한 Dr. Beth Chaffee, DVM, PhD, DACVP의 중요한 공헌을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
#15 메스 블레이드Henry Schein Ltd.75614없음
6웰 조직 배양 플레이트Thermo Fisher Scientific10578911종양 조각을 다지는 데 사용됩니다. 세포 배양에도 사용할 수 있습니다
Abrams 골육종 세포주해당 없음해당 없음 이
소플루란 기화기 및 산소 탱크가 있는 마취기VetEquip901805없음
동물 체중계Kent ScientificSCL- 1015없음
BALB/c 누드 마우스(nu/nu)Charles River Ltd.NA6-8주령. 수컷 또는 암컷 마우스
뼈 시멘트Depuy Synthes160504뼈 왁스 대신 선택적 사용
뼈 왁스EthiconW31G옵션
BuprenorphineAnimalcare Ltd.N/ABuprecare 0.3 mg/ml 개와 고양이를 위한 주사용 용액
이산화탄소 안락사 스테이션해당 사항 없음해당 사항 없음동물 시설 내에 제공되어야 함
세포 배양 인큐베이터는 37°C로 설정됩니다. C 및 5% 이산화탄소Heraeus다양한없음
클로르헥시딘 수술용 스크럽베토퀴놀411412없음
Cryovials(2ml)Thermo Scientific Nalgene5000-0020동결 보존하는 경우 선택 사항
D-루시페린(반딧불이), 칼륨 염Perkin Elmer122799관심 세포주에 생물 발광 리포터 유전자가 있는 경우 선택 사항
디지털 캘리퍼스Mitutoyo500-181-30수동 가능
디지털 현미경 촬영 캐비닛Faxitron Bioptics, LLCMX-20종양 성장에 대한 뼈 반응을 평가하기 위한 선택 사항
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma Aldrich1371171000종양 단편 Dulbecco를 동결 보존하는 경우 선택 사항
s 변형 된 독수리' s 매체Thermo Fisher Scientific11965092없음
에탄올 (70%)Sigma Aldrich2483없음
소 태아 혈청Thermo Fisher Scientific26140079없음
겸자, DumontFine Science Tools, Inc.11200-33없음
냉동고 (– 80 ° C)SanyoMDF-794C종양 조각을 동결 보존하거나 스냅 동결하는 경우 선택
적혈구 측정기Thermo Fisher Scientific11704939가능한 경우 자동 세포 계수기를 사용할 수도 있습니다
피하 주사 바늘 (27 게이지)Henry Schein Ltd.DIS5551025G(DIS55509) 및 30G(카탈로그 DIS599) 바늘을 사용할 수도 있습니다.
얼음N/AN/A 주사기 및 세포 현탁액 보관용 용기에 이상적으로 작은 조각
홍채 가위 FineScience Tools, Inc.14084-08없음
IsofluraneHenry Schein Ltd.1182098없음
IVIS Lumina III 생물 발광/형광 이미징 시스템Perkin ElmerCLS136334관심 세포주에 생물 발광 또는 형광 리포터 유전자가 있는 경우 선택 사항
L-글루타민Thermofisher scientifc25030081없음
액체 질소British Oxygen CorporationNA종양 단편을 동결 보존 또는 스냅 동결하는 경우 선택 사항
액체 질소 듀어, 5리터Thermo Fisher ScientificTY509X1동결 보존하는 경우 선택 사항입니다
. Matrix GFR, LDEV-Free, 5mlCorning Life Sciences356230옵션. 10ml 크기로도 사용 가능(354230),
마이크로 원심분리기Thermo Fisher Scientific75002549펠릿 셀, 1200rpm에서 5-6분 동안
. Frosty 냉동 격납기, Fisher Scientific10110051종양 조각을 동결 보존하는 경우 선택 사항,
NAIR, 제모 로션/오일Thermo Fisher ScientificNC0132811미세한 칼날이 있는 전기 클리퍼를 대안적으로 사용할 수 있습니다.
페니실린/스트렙토마이신시그마-알드리치P4333없음
메스 손잡이, #7 ShortFine Science Tools, Inc.10007-12사용자 선호 #15 메스 블레이드
소형 동물 가열 패드VetTechHE006없음
실체 현미경GT Vision Ltd.H600BV1없음
멸균 인산염 완충 식염수(PBS)Thermo Fisher Scientific10010023주사용 및 수술용 스크럽의 일부로 사용, 클로르헥시딘과 교대로
조직 접착제(멸균)3M Corporation84-1469SB비흡수성 피부 봉합사(6-0 size)를 대안적으로 사용할 수 있음Trypan
blueThermo Fisher Scientific5250061없음
Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific253000540.05%-0.25%
투베르큘린 주사기(0.1ml 그라데이션 포함 1ml)를 사용하는 Becton Dickinson309659Luer
Vented 조직 배양 플라스크보다 선호되는 슬립 팁, T-75Corning Life SciencesCLS3290필요에 따라 더 작거나 큰 플라스크를 사용할 수도 있습니다.
종양 절편 Matrigel®를 , , Mr, ,

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