여기에 설명된 프로토콜은 다른 다량 영양소 품질의 식단에 노출된 Drosophila 멜라노가스터 애벌레에 의해 정의된 시간 간격 내에 섭취되는 음식의 양을 정량화할 수 있도록 하는 프로토콜이다. 이 소는 신경 열유전학 스크린의 맥락에서 행해질 것입니다.
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방법 논문
드로소필라 애벌레를 사용하여 열유전학 신경 화면에서 다량 영양소 섭취의 정량화
* These authors contributed equally
이 논문에서
정오 공지
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요약
초록
먹이를 주고 먹이를 주는 행동을 통해 동물은 개발, 건강 및 피트니스에 필수적인 에너지와 영양소의 원천에 접근할 수 있습니다. 이러한 행동의 신경 조절을 조사하는 것은 영양 항상성의 근본적인 생리적 및 분자 메커니즘의 이해를 위해 필수적입니다. 벌레, 파리 및 물고기와 같은 유전적 인 동물 모델의 사용은 이러한 유형의 연구를 크게 용이하게합니다. 지난 10 년 동안, 과일 플라이 Drosophila 멜라노가스터는 먹이와 위조 행동의 신경 제어를 조사하는 신경 생물학자에 의해 강력한 동물 모델로 사용되었습니다. 의심 할 여지없이 가치가 있지만, 대부분의 연구는 성인 파리를 검사합니다. 여기서, 우리는 애벌레가 그들의 단백질과 탄수화물 함량이 다른 규정식에 드러날 때 먹이 행동을 통제하는 신경 기질을 조사하기 위하여 간단한 애벌레 신경계를 이용하는 프로토콜을 기술합니다. 우리의 방법은 뉴런 열유전학 활성화 스크린의 맥락에서 수행되는 정량적 색색 무선택 공급 분석법을 기반으로 합니다. 판독으로, 1 시간 간격을 통해 애벌레에 의해 먹는 음식의 양은 탄수화물 (P:C) 비율에 그들의 단백질에서 다른 3개의 염료 표지 규정식 의 한에 드러낼 때 이용되었습니다. 이 프로토콜의 효능은 다른 다량 영양소 품질의 식단에서 먹는 음식의 양을 조절하는 후보 신경 인구를 식별함으로써, 애벌레 Drosophila에서신경 유전학 화면의 맥락에서 입증된다. 우리는 또한 표현형으로 시험된 유전자형을 분류하고 그룹화할 수 있었습니다. 문헌에서 현재 사용 가능한 방법에 대한 간략한 검토 외에도 이러한 방법의 장점과 제한 사항이 논의되고 이 프로토콜이 다른 특정 실험에 어떻게 적응할 수 있는지에 대한 몇 가지 제안이 제공됩니다.
서론
모든 동물은 생존, 성장 및번식을위해 필요한 양의 영양소를 얻기 위해 균형 잡힌 식단에 의존합니다. 무엇을 얼마나 먹을지의 선택은 포만 수준과 같은 동물의 내부 상태와 관련된 다양한 상호 작용 요인및 식품 품질2,3,4,5와같은 환경 조건에 의해 영향을 받습니다. 단백질과 탄수화물은 두 가지 주요 다량 영양소이며 균형 잡힌 섭취는 동물의 생리적 과정을 유지하는 데 필수적입니다. 따라서, 먹이 행동을 통제하고 이러한 다량 영양소의 균형 잡힌 섭취를 유지하는 신경 메커니즘의 이해는 매우 관련이 있다. 이는 수명, 대변, 대사 건강 과 같은 생명력 특성이단백질 섭취량6,7,8,9,10의수준에 직접적으로 영향을 받고 있기 때문이다.
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프로토콜
1. 자당 효모 (SY) 다이어트의 준비
- 다량 영양소 균형과 L3 양육 다이어트에 대한 모든 건조 성분 (한천, 효모, 자당)의 무게. 1L의 식품을 준비하는 데 필요한 각 성분에 대한 그램의 양은 도 1B로표시됩니다.
참고: 60mm 페트리 접시를 채우기 위해서는 약 13mL의 음식이 필요하다는 점을 고려하십시오. - 모든 성분을 멸균 증류수(식품 준비에 필요한 총 물량의 약 50%를 사용)에 녹여 5-10분 동안 배지를 저어줍니다.
- 50 분 동안 자동 클라브.
- 매체가 식히는 것을 허용한 후에, 규정식에 니파진 과 선전 산 용액을, 3%와 0.3%의 최종 농도 (v/v)에 각각 추가하십시오. 다량 영양소 균형 식단에 1 %의 최종 농도 (v /v)에 파란색 식품 염료를 추가하십시오. 증류수로 총 볼륨을 완성합니다.
- 60mm 페트리 접시에 음식 식단을 조심스럽게 붓기 때문에 부어 넣은 음식의 양은 각 접시에 거의 동일합니다. 식단의 P:C 비율로 접시에 라벨을 붙입니다.
참고: 수유 분석 당일 다량 영양소 균형 식단을 준비합니다. 가능하지 않은 경우, 준비된 식단을 밀봉 된 용기에 4 °C에서 최대 3 일 동안 보관하십시오. 저장 기간이 길수록....
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결과
Drosophila 애벌레는 과잉 탄수화물을 섭취하는 비용으로 단백질 섭취량을 조절23 (그림 2E의회로도 플롯). 실제로, 단백질 섭취량의 이러한 우선 순위는 다른 많은 동물에서 관찰되었으며24,25를활용하는 단백질이라고 불린다.
이 강력한 먹이 행동 반응을 활용, 행동 기반 화면 다량 영양소 균형에 관련 된 신경 인구를 식별 하기 위해 설계 되었습니다. DTRPA1을 이용한 L3(그룹당 10명)의 그룹이 광고 리비도를 1시간 동안, dTRPA1을 이용한 뉴런 열유전학 활성화 조건 하에서 특정 P:C 비율(1:1, 1:4및 1:4)을함유한 식품 염색 식단 3.......
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토론
이 프로토콜을 사용하면 특정 신경 인구의 열유전학 활성화하에서 유충의 능력을 테스트하여 단백질과 탄수화물의 섭취 수준을 조절할 수 있으며, 두 가지 주요 다량 영양소가 다른 P:C 조성물의 식단에 노출될 수 있습니다. 이 방법은 다른 다량 영양소 품질의 다이어트에 걸쳐 음식 섭취량의 제어와 관련된 신경 인구를 식별하는 것을 목표로 애벌레 예비 검진의 맥락에서 테스트되었다. 이 작품은 또한 Drosophila 애벌레가 영양 항상성에 관련 되 었던 먹이 행동의 신경 기초를 조사하기위한 귀중한 동물 모델임을 입증하는 데 기여합니다.
프로토콜의 메모로 제공되는 정보 외에도 몇 가지 중요한 측면에 대해 더 논의하고자 합니다. 모든 행동 분석에서와 마찬가지로, 동물 행동과 관련된 변이를 최소화하기 위해 실험자가 조치를 취해야 합니다. 하나는 염두에 두어야 할 매우 중요한 측면은 발달 동기화 된 동물을 얻는 것의 중요성과 관련이 있습니다. 발달 단계에서 잘 동기화되는 초기 L.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 프로토콜에 설명된 실험 장비의 일부에 대한 액세스를 제공한 Instituto Gulbenkian de Ciência (IGC)에 감사드립니다. 이 작품은 포르투갈 과학기술재단(FCT), 리스보아-01-0145-FEDER-007660에 의해 지원되었다. PTDC/NEU-NMC/2459/2014, IF/00697/2014, 라 카이사 HR17-00595 ~ PMD, 호주 연구위원회 미래 펠로우십(FT170100259)이 CKM에 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 마이크로튜브 | Sarstedt AG & Co. | 72.690.001 | |
| 10xPBS | Nytech | MB18201 | |
| 2.0mL 마이크로튜브 | Sarstedt AG & Co. | 72.695.500 | |
| 60mm 페트리 접시 | Greiner Bio-one, 오스트리아 | 628161 | |
| 96웰 마이크로플레이트 | Santa Cruz Biotechnology | SC-204453 | |
| Agar | Pró-vida, 포르투갈 | ||
| 벤치 쿨러 | Nalgene, USA | Labtop Cooler 5115-0032 | |
| Blue food dye | Rayner, Billingshurst, UK | ||
| 세포 파괴 매체 | Scientific Industries, Inc. | 888-850-6208 | (0.5 mm 유리 구슬) |
| 접시 무게 보트 | 산타 크루즈 생명 공학 | SC-201606 | |
| 60mm 페트리 접시 용 배아 수집 케이지 | 플라이 스터프, 과학 실험실 용품, 영국 | FLY1212 (59-100) | |
| 페더급 집게 | BioQuip 제품, 미국 | 4750 | |
| 재고 유지 보수 | 를위한 플라이 식품1L 식품 내용물: 한천 10g, 효모 추출물 100g, 자당 50g, 니파진 30mL, 프로피온산 | ||
| 겸자 3mL #5 | Dumont | 0108-5-PS | 표준 팁, INOX, 11cm |
| 인큐베이터 | LMS Ltd, UK | Series 2, Model 230 | 열유전학적 섭식 분석용(30? C) |
| Incubator | Percival Scientific, 미국 | DR36NL | 유충 (19? C) |
| Janelia lines | Janelia Research Campus | 표 2의 상세 정보 | |
| 다량 영양소 균형 다이어트 | 구성 및 영양 정보 그림 1 | ||
| 메탄올 | VWR | CAS 번호 : 67-56-1 | |
| 니파진 (메틸 4- 하이드 록시 벤조 에이트) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| 니트릴 장갑 | VWR, USA | ||
| 냉장 원심분리기 | Eppendorf, Germany | 5804 R / 일련 번호: 5805CI364293 | |
| Rubin Gal4 ines | Janelia Research Campus | Bloomington Drosophila Stock Center에서 사용 가능 | |
| ShibireTS UAS 라인 | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC 번호: 66600 | Carlos Ribeiro Group |
| Soft brushes | 제공마취된 초파리 분류용 | ||
| 분광광도계 플레이트 리더 | Thermo Fisher Scientific | Multiskan Go 51119300 | |
| 실체 현미경 | Nikon | 1016625 | |
| Sucrose | Sidul, 포르투갈 | ||
| 세 번째 instar 유충(L3) 사육 다이어트 | 그림 1의 구성 및 영양 정보 | ||
| 타이머 | |||
| Tissue lyzer / bead beater | MP Biomedicals, USA | FastPrep-24 6004500 | |
| TRPA1 UAS 라인 | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC 번호: 26264 | UAS 제어 하에 TrpA1을 표현합니다. 25에서 실험적으로 뉴런을 활성화하는 데 사용할 수 있습니까? C |
| 수조 | Sheldon Manufacturing Inc., 미국 | W20M-2 / 03068308 / 9021195 | |
| 효모 추출물 | Pró-vida, 포르투갈 | 51% 단백질, 15% 탄수화물 |
참고문헌
- Raubenheimer, D. Nature of nutrition - a unifying framework from animal adaptation to human. , (2012).
- Carvahlo, M. J. a, Mirth, C. K. Coordinating morphology with behavior during development: an integrative approach from a fly perspective....
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae
Posted by JoVE Editors on 10/06/2020. Citeable Link.
An erratum was issued for: Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae. A figure was updated.
Figure 1 was updated from:
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. Please click here to view a larger version of this figure.
