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방법 논문

신경 근육 분석을위한 쥐 보컬 폴드의 준비

3.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/61327

⸱

2020년 5월 15일

 ,  , 
1NYU Voice Center, Department of Otolaryngology-Head & Neck Surgery, New York University School of Medicine, 2Communicative Sciences and Disorders, New York University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 조직 화학 신경 근육 연구에 대 한 쥐 보컬 주름을 준비 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다.

초록

이 튜토리얼의 목적은 조직화학 신경 근육 연구에 대한 쥐 보컬 접기의 준비를 설명하는 것입니다. 이 프로토콜은 쥐 후두 해부, 플래시 동결 및 보컬 주름의 저온 절제에 대한 절차를 간략하게 설명합니다. 이 연구는 세로 및 단면 평면 모두에서 저온 절 보컬 주름을 하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 참신은 내성 후두 근육의 정확한 식별을 보장하고 조직 손실의 기회를 감소 극저온 절제 하는 동안 후두 추적. 수치는 두 평면에서 점진적 극저온절을 보여줍니다. 29마리의 쥐 헤미 후두는 갑상선 연골의 출현에서 전체 보컬 접이를 포함하는 첫 번째 섹션의 출현까지 극저고 를 추적했다. 전체 보컬 폴드는 두 평면의 모든 동물을 위해 시각화되었습니다. 갑상선 연골의 출현에서 두 평면에서 전체 보컬 폴드의 출현까지 의 거리에서 높은 가변성이 있었다. 무게는 후두 랜드 마크의 깊이와 상관 관계가 없었다, 개별 가변성 및 조직 준비와 관련된 다른 요인은 단면 동안 랜드 마크의 출현에 높은 가변성에 대한 책임이있을 수 있음을 시사. 이 연구는 방법론을 자세히 설명하고 조직 화학 신경 근육 조사를위한 쥐 보컬 접이를 준비하기위한 형태학적 데이터를 제시합니다. 높은 개별 가변성 때문에, 후두 랜드 마크는 조직과 조직 손실을 과분하는 것을 방지하기 위하여 극저온 절제 도중 밀접하게 추적되어야 합니다. 쥐 후두 내의 랜드 마크의 적절 한 조직 준비 및 인식을 포함 하 여 일관 된 방법론의 사용, 연구 전반에 걸쳐 일관 된 결과 지원 하 고 후두 신경 근육 메커니즘을 조사 하는 모델로 쥐 보컬 접을 사용 하 여 관심 있는 새로운 연구원을 원조.

서론

쥐 후두는 발달, 노화, 질병 및 약리학 에이전트에 구조적이고 기능적인 신경 근육 후두 적응을 조사하는 잘 확립 된 모델입니다1,2,3,4,5. 조직학적 방법의 일관성은 후두 연골 내에서 캡슐화 된 근육의 후두 크기, 모양 및 지형과 관련된 도전뿐만 아니라 근육 준비 및 분석에 관련된 여러 가지 복잡성이 있기 때문에이 작업 라인에 중요합니다1,6,7,8,9,10,11 . 쥐 내성 후두 근육의 작은 크기로 인해 체계적인 포함, 동결 및 냉동 절개는 일관되고 정확한 결과를 달성하는 데 중요합니다. 예를 들어, 관상 평면에서 쥐 보컬 접을 분리할 때, 내래 후두 근육 4개 중 4개의 신경근육 접합부(NMJs)는 조직 깊이11의 1.8mm 미만 내에 위치한다. 따라서, 동결 절제 동안 후두 근육 해부학의 정밀한 모니터링은 정확하게 관심의 섹션을 식별하고 조직의 과부를 방지하는 것이 필수적이다. 대상 근육의 과분은 NMJs11의 수와 지형을 부정확하게 식별할 수 있거나 랜드마크 방향 혼동으로 인해 대상 근육이 버려지면 시료 크기가 전반적으로 감소될 수 있다12. 후두 근육과 각각의 적응에 대한 새로운 모델이 개발됨에 따라 연구 전반에 걸쳐 결과가 정확하고 신뢰할 수 있으며 재현가능한지 확인하는 표준 수술 절차가 필수적입니다.

이 문서의 목적은 최적의 세로 및 단면 분석을 위해 쥐 보컬 폴드의 세부 준비입니다. 우리의 실험실에서 정기적으로 사용되는 상세한 방법은 냉동 절제 동안 대상 근육 랜드 마크를 식별하기 위해 설명된다. 유사한 방법은 여러 실험실에서 사용되지만 초보 조사관이 구현할 때 신뢰할 수 있고 정확한 복제를 보장하기 위해 문헌보다 더 자세한 정보가 여기에 제공됩니다. 이 튜토리얼의 목표는 실험실 및 조사 전반에 걸쳐 일관성을 개선하기 위해 쥐 보컬 접이의 면역 조직화학 (IHC) 평가를위한 표준 방법론을 제공하는 것입니다.

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프로토콜

이 연구는 뉴욕 대학 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 따라 수행되었습니다.

1. 해부 쥐 후두

  1. 제도적으로 승인된 프로토콜에 따라 쥐를 안락사시합니다. 하악에서 마누브리움으로 복부 목을 면도하고 술로 면봉하여 조직 표본의 모피 오염을 방지합니다.
  2. 10배배율을 가진 해부 범위에서 기관체가 노출될 때까지 메스로 중간선 목 절개를 만들어 후두 전체를 소비한다.
  3. 중간선에서 복부 외두 근육을 분리하여 포셉을 사용하여 후두를 노출하고 가위 또는 메스를 해부합니다.
  4. 기관가 를 제3 기관 고리로 분리하고 해부 가위를 사용하여 전체 후두를 소비하기 위해 효이드 뼈에 절개 로스트랄을 만듭니다.
  5. 배율하에서 미세 절도구(핀셋, 핀, 미세시)를 사용하여 후두에서 외두 조직(식도, 갑상선 및 외두 근육)을 제거합니다.
  6. 미세 한 부와 함께, 후위 cricotenoid 근육 사이 중간 라인을 사용 하 여 아리티노이드 사이 후두를 이중으로. 후두의 측면 벽을 핀으로 표시하여 보컬 주름을 노출한 다음 갑상선 연골의 중간선을 통해 미세 시저로 보컬 주름의 전방 분리(도 1)를 통해 양분하게 선회한다.
    참고: 이 단계는 선택 사항일 수 있습니다. 후두전체를 유지하기 위해 건너뛸 수 있습니다. 후두의 양절은 동일한 후두의 오른쪽과 왼쪽을 별도로 사용하여 다중 면역 염색 기술을 허용합니다.
  7. 인산완충액(PBS)에서 각각 헤미후두를 헹구고, 동결 시 얼음 결정 형성을 줄이기 위해 작업 와이퍼로 섬세하게 건조시킵니다.

2. 후두 조직을 수정 및/또는 플래시 동결

참고: 고정은 모든 면역 염색 프로토콜에 적합하지 않을 수 있습니다. 종종 후두 조직은 해부 직후 에새로 얼어 붙습니다. 단계 2.1을 건너뛰고 후두 조직을 고정하지 않고 플래시 동결시합니다.

  1. 헤미 후두를 해결하기 위해 70 rpm의 궤도 셰이커에서 실온에서 1 시간 동안 PBS에서 4 % 포름 알데히드로 채워진 원심 분리기 튜브에 조직을 배치합니다. 깨끗한 원심분리기 튜브로 조직을 옮기고 PBS에서 20분 동안 3배 헹구십시오. 그런 다음 깨끗한 원심분리기 튜브로 옮기고 4°C에서 20% 자당/5% 글리세롤 용액(~18h 또는 조직이 가라앉을 때까지)에 침수한다.
    주의: 포름알데히드는 위험하며 적절한 개인 보호 장비와 함께 연기 후드에 사용해야합니다.
  2. 모든 헤미 후두를 균일한 위치에 배치하여 최적의 절삭 온도(OCT) 화합물로 채워진 냉동 금형에 넣습니다. hemilarynx의 경우, 극저온의 바닥을 향한 보컬 폴드의 내측 표면과 극저온 개구부의 하부 가장자리에 평행하게 보컬 접힌의 세로 측면을 가진 조직을 배치한다. 전체 후두의 경우, 극저온의 바닥을 향한 후방 리코리테노이드와 극저온 개구부의 하부 가장자리에 평행하게 보컬 접힌 종방향 측면을 가진 조직을 놓습니다.
    참고: OCT 화합물 내에서 일관된 후두 방향은 쥐 보컬 폴드의 극저분균에 매우 중요합니다. 헤밀리엔스가 내장되고 얼어 붙으면 방향을 바꾸기 위해 해동하여 여러 해동 동결 주기로 인한 조직 손상의 위험을 소개해야 합니다.
  3. 액체 질소로 둘러싸인 강철 비커로 냉각된 isopentane(2-메틸부탄)를 사용한 플래시 동결 조직.
    참고: isopentane는 백색 침전이 비커13의 측면과 바닥에 형성하기 시작할 때 조직 동결을 위한 최적 온도에 도달합니다. 이스펜탄은 액체 질소보다 열 전도도가 높기 때문에 사용되며, 이는 급속한 동결 시 조직 블록의 균열을 방지하는 데 도움이 됩니다. OTC에서 조직을 동결에 대한 자세한 설명은 쿠마르 외.13을 참조하십시오.
  4. 각 금형을 라벨이 붙은 호일로 감싸고 개별 냉동고 가방에 넣어 탈수방지하고 -80°C 냉동고에 보관할 때까지 드라이 아이스에 즉시 보관하십시오.

3. 단면 평면의 극저부 헤밀리엔스

  1. 냉동저온을 -20°C로 설정하여 제조업체 매뉴얼에 의한 근육 조직 단면에 권장되는 온도 범위(15-25°C)의 중간에 있습니다.
  2. 10 μm 두께의 섹션으로 저온 분면 두께를 설정합니다.
    참고: 근육 섬유 단면 분석의 경우, 10 μm 두께의 단면은 섬유 타이핑 분석을 위한 라벨이 부착된 근육 섬유의 완전한 염색 및 견고한 이미징 강도를 허용하는 것이 최적입니다14,15,16. 일부 프로토콜신경 근육 대상에 따라 다른 단면도 두께 를 요구할 수 있습니다.
  3. 극저온 챔버로 조직을 옮기고, 저온 시편 디스크(chuck)에 OCT 화합물의 균일한 층을 추가하고, 임베디드 조직 블록을 표본 디스크 위에 놓습니다. 흉선(TA) 근육 섬유 분석을 위한 보컬 접이식의 단면을 얻으려면, 척에 표본을 부착하여 복부 갑상선 연골이 극저온 블레이드를 마주하고 아리티노이드 연골이 표본 디스크에 직면하도록 한다.
    참고: 동결시 OCT 화합물이 흰색과 불투명해짐에 따라 이러한 랜드마크가 이 단계에서 표시되지 않습니다. 이러한 가시성 부족은 플래시 동결 단계에서 헤밀리엔스의 방향을 주목하는 것이 중요한 이유입니다.
  4. 갑상선 연골의 복부 부분이 나타날 때까지 표본 머리를 100 μm로 전진시킴으로써 OCT 화합물을 트림합니다.
  5. 그런 다음 갑상선 연골발병부터 라미나 프로프리아, 내측 TA 근육 및 측면 TA 근육이 노출될 때까지 30 μm 섹션을 손질하고 추적합니다.
    참고: 후두 랜드마크는 단면각도가 비스듬히 되지 않도록 100μm마다 갑상선 연골이 발병하여 추적하여 주목해야 합니다. 도 2 는 10배배율의 단면 평면에서 두 개의 후두 랜드마크 세트를 나타냅니다.
  6. 대상 TA 근육에 도달하면 10 μm에서 양전하 슬라이드의 섹션을 수집합니다.
  7. PBS에 섹션을 4°C로 저장하여 염색할 준비가 될 때까지 수분을 유지합니다.
    참고: 고정 된 조직은 IHC 표적에 따라 최대 1 주일까지 PBS에 저장 될 수 있지만 고정되지 않은 조직은 즉시 처리되어야합니다.

4. 경도 평면의 극저부 헤밀리엔스

  1. 저온 챔버가 다시 -20°C로 설정되면 단면 두께를 30 μm로 변경합니다.
    참고: NMJ 분석의 경우, 30-60 μm 사이의 조직 두께는 신경 단자 또는 모터 엔드플레이트11,12,17의 단편화 없이 후두 근육 내의 몇 가지 완전한 NMJ를 캡처하는 데 사용할 수 있습니다.
  2. TA 근육의 NMJ 분석을 위한 세로 성보컬 접이식 부분을 얻으려면, 후면이 극저온 블레이드를 향하도록 척에 표본을 부착하고 기관 루멘은 시편 디스크쪽으로 아래로 향합니다.
  3. 갑상선 연골이 나타날 때까지 표본 머리를 100 μm로 전진시켜 OCT 화합물을 다듬습니다.
  4. TA 근육의 라미나 프로프리아및 내측 및 측면 분열이 드러날 때까지 갑상선 발병으로부터 30 μm의 섹션을 손질하고 추적합니다.
    참고: 세로 평면의 후두 랜드마크 5세트는 표적 TA 근육을 향한 조직 깊이 진행을 추적하는 것이 좋습니다. 도 3 은 10배배율로 세로 평면의 후두 랜드마크를 나타낸다.
  5. 표적 TA 근육에 도달하면 30 μm에서 양전하 슬라이드에 대한 섹션을 수집합니다.
  6. PBS에 섹션을 4°C로 저장하여 염색할 준비가 될 때까지 수분을 유지합니다.

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결과

대표적인 결과는 후두 신경 근육 시스템에 음성 운동의 효력의 지속적인 조사의 일부였습니다. 29 남성 피셔 344/갈색 노르웨이 쥐 (12 9 개월, 17 24 개월)는 CO2 흡입으로 무게와 안락사 되었다 양측 thoracotomy.

절차는 NMJs와 측면 및 내측 TA 근육의 섬유 크기를 표시하는 설명 된 프로토콜을 따랐다. 후두 랜드 마크 사이의 거리는 후두 근육과 주변 연골을 사용하여 경도 및 단면 평면 모두에서 추적되어 극저온 절제 (표 1)에서 진행을 결정했습니다. 추적은 두 방향 평면에서 갑상선 연골의 첫 등장에서 시작되었습니다. 도 2는 내측 TA 근육과 라미나 프로프리아(도 2c,d)에 나타나는 갑상선(도 2a,...

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토론

신경 근육 분석을 위한 쥐 보컬 주름을 준비하는 것은 각종 도전으로 제시할 수 있습니다. 후두 근육은 작고 연골에 둘러싸여 있어 표적 근육을 직접 추출하기가 어려워질 뿐만 아니라 후두 해부학 적 랜드 마크의 깊이에서 동물 들 사이에서 높은 가변성을 발견했습니다. 근육의 경우, 전체 보컬 접이식 섹션은 NMJ 분석 프로토콜(표 1)에 대한 종로 평면에서 63-126 단면(섹션당 35 μm)보다 약간 적은 복부 갑상선 연골의 초기 출현 후 21-85 섹션(섹션당 10 μm) 사이에 나타났다.

가변성은 균일한 포함, 지향성 및 각 프로토콜 유형에 대한 조직의 단면에도 불구하고 후두 랜드 마크 사이의 거리에서 지적되었습니다. 또한, 체중의 차이는 후두 랜드 마크의 한 세트에서 다음에 조직 깊이의 넓은 범위에서 가변성을 고려하지 않았다. 후두 랜드 마크 사이의 거리의 이 가변성은 동물에 걸쳐 후두 해부학의 개별 차이, 해부 시 OCT 화합물 내에서 극저온에서...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 보조금 F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) 및 K23DC014517 (존슨, PI) 청각 장애및 건강의 국립 연구소의 다른 통신 장애에 대한 국립 연구소에서 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-메틸부탄 인증피셔 케미컬35514
알루미늄 호일Fisherbrand1213101
Cryo Tongs SSThermo Scientific11679123
저온 유지 장치Leica BiosystemsCM3050
저온 유지 블레이드C.L. Sturkey D554X5022-210-045
일회용 베이스 몰드 15mm x 15mmThermo Scientific41-741
일회용 언더패드Medline23-666-062
해부 키트Thermo Scientific9996969
DPBS - Dulbecco의 인산염 완충 식염수Gibco14190136
냉동 섹션 MediumFisher Healthcare23-730-571
아이스 버킷Bel-Art
Immunostain 수분 챔버Ted Pella IncNC9425474
바늘 홀더AssiASSI. B148
부직포 스폰지, 4 플라이퀵 메디컬9023
오비탈 셰이커Troemner02-217-987
Pap 펜
파라포름알데히드, 16% w/v aq. soln., 메탄올 프리Alfa Aesar50-00-0
프리미엄 마이크로 원심분리기 튜브Fisherbrand5408129
표본 보관 가방Fisherbrand19240093
스테인리스 스틸 졸업 측정 32 oz/100 mLPolar Ware114231B
Superfrost Plus 현미경 슬라이드Fisherbrand12-550-15
작업 와이퍼Kimberly-Clark Professional™ 3415506666A
타이머Fisherbrand2261840
Vannas 패턴 가위AssiASSI.
참고: 모든 소모품에 대해 다음은 전amp구매할 장비의 파일. 방법을 완료하는 데 정확한 모델이 필요한 것은 아닙니다.
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참고문헌

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  15. McMullen, C. A., et al. Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).
  16. Lenell, C., Johnson, A. M. Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat. Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).
  17. Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).
  18. Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats. Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).

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