방법 논문

동종 유전자 이식편으로 재구성된 화상 상처의 뮤린 모델

12.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/61339

⸱

2020년 8월 8일

 ,  ,  ,  , 
1Laboratoire de Physique des Plasmas, École Polytechnique, Sorbonne Université, CNRS, 2Institut de Recherche Biomédicale des Armées, Clamart, INSERM UMRS-MD

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 연구의 목적은 화상 상처 치유의 뮤린 모델을 개발하는 것이었습니다. 예열된 황동 템플릿을 사용하여 마우스의 등불 피부에 열 화상이 유도되었다. 연소된 조직은 유전적으로 유사한 기증자 마우스의 꼬리에서 수확한 피부 이식으로 파괴되고 겹쳐졌습니다.

초록

사소한 피상적 상처는 1 차적인 의도에 의하여 합병증 없이 치유됩니다. 전체 두께 화상과 같은 깊은 상처는 보조 의도로 치유되며 외과 적 신부및 피부 이식이 필요합니다. 기증자 이식편을 수령인 상처 침대에 성공적으로 통합하는 것은 면역 세포의 적시 모집, 견고한 혈관신생 반응 및 새로운 세포외 매트릭스 형성에 달려 있습니다. 상처 치유와 관련된 몇 가지 주요 프로세스를 대상으로 하는 새로운 치료제의 개발은 상처 폐쇄에 대한 최적화된 객관적 평가와 함께 신뢰할 수 있는 전임상 모델의 부재에 의해 방해를 받습니다. 여기서는 동종 피부 이식편으로 재구성된 실험적인 전체 두께 화상 상처의 저렴하고 재현 가능한 모델을 설명합니다. 상처는 BALB/C 및 SKH1-Hrhr 배경에서 마취된 근친야생형 마우스의 도섬 표면에 유도된다. 화상은 직경 10mm를 측정하는 황동 템플릿을 사용하여 생산되며, 이는 80°C로 예열되고 20s. Burn eschar는 부상 후 24시간 절제되고 유전적으로 유사한 기증자 마우스의 꼬리에서 수확된 전체 두께 이식편으로 대체된다. 수술에 특화된 장비가 필요하지 않으며 수술 기술은 따르기 간단합니다. 이 방법은 대부분의 연구 환경에서 쉽게 구현되고 재현될 수 있습니다. 특정 제한 사항은 모델과 연결됩니다. 기술적 어려움으로 인해 얇은 분할 두께 피부 이식편의 수확은 불가능합니다. 우리가 여기에서 설명하는 외과 방법은 전체 두께 피부 이식편을 사용하여 화상 상처의 재구성을 허용합니다. 그것은 전임상 치료 테스트를 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다.

서론

외과적 신부및 피부 이식은 만성 상처1,화상 상처2,외상성 상처 등 급성 상처 의 관리에 사용되는 일반적인 임상관행이다 3. 피부 이식은 신체의 한 부분에서 건강한 피부를 제거하고 다른 부분으로 옮기는 외과 적 절차를 말합니다. 기증자 이식편은 잃어버린 조직을 대체하고 세포 이동 및 성장을 위한 구조적인 발판을 제공합니다. 수용자 부위에 통합된 후, 피부 이식편은 미생물 침입으로부터 보호, 외부 환경의 유해한 영향 및 수분4의과도한 손실로부터 보호함으로써 손실된 피부 장벽을 대체한다. 성공적인 피부 이식 통합은 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 이들은 미생물 감염의 존재에 있는 적당한 면역 반응 및 염증의 적시 해결, 상처 부위에 강한 혈관 신생 및 수령인 침대와 기증자이식5사이 혈관 진모의 설치를 포함합니다. 이식편이 저하되기 시작하면 상주 진피 세포는 새로운 세포 외 매트릭스를 생성할 수 있는 세포로 대체되어야 합니다. 동시에 표피 각질 세포는 새로 생성된 매트릭스를 기어 기어 서 신표피를 형성하고 상처를 다시 상피해야합니다. 그러므로, 기증자 접목으로 수용자 침대에서 세포의 능률적인 이주가 성공적인 접목 통합에 영향을 미치는 또 다른 결정적인 요인이다는 것을 명백히. 상처 치유에 관여하는 요인의 광대 한 수를 감안할 때6,윤리적 한계로 인해 인체 실험에서 제어 할 수 없을 수 있습니다, 전 임상 실험 피부 이식의 모델이 필요합니다. 화상 상처 치유 및 관련 피부 이식의 전 임상 모델의 개발은 피부 조직 수리에 관여하는 복잡한 메커니즘을 이해하는 데 중요하고 새로운 치료제의 테스트에 필수적입니다. 상처 치유의 체외 모델은 피부 조직의 복잡성을 정확하게 모방 할 수 없습니다. 생체 내 동물 모델은 조직 수리에 관련된 메커니즘을 이해하는 데 필수적인 조사 도구입니다.

여러 가지 피부 이식 기술은 설치류에서 수술 절제 및 화상 상처 재건7,,8,,9를모방하여 개발되었다. 그러나, 이전에 설명된 절차의 대부분은 피부 이식 전에 열 화상 상해를 유도하는 데 실패했습니다. 화상 상처 대신, 전체 두께 절제 된 상처가 유도되었고, 그 후 전체 두께7피부 로 재구성7. 귀, 꼬리 및 등과 같은 다양한 해부학적 랜드마크가 설치류7,,8에서기증자 피부를 수확하는 데 사용되어 왔다. 상이한 접목 고정 및 안정화 기술은 "봉합기술 없음"9,봉합사7 및 외과접착제(10,,11,12)를포함하는 것으로 보고되었다.,

이 연구의 목적은 불실행 가능한 조직 절제 및 피부 이식을 수반하는 화상 처리에 있는 현재 금 표준 접근을 재구성할 전체 두께 화상 상처의 murine 모형을 개발하는 것이었습니다. 예열된 황동 템플릿을 사용하여 마우스의 도섬 표면에 열 화상이 유도되었다. 번 에샤는 절제되고 기증자 마우스의 꼬리에서 수확 된 전체 두께 이식편으로 대체되었습니다. 이 실험 모델에는 세 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 하나 이상의 화상 상처는 받는 사람 마우스의 뒷면에 유도될 수 있고, 4개의 기증자 피부 이식편은 기증자 마우스의 단일 꼬리에서 수확될 수 있다. 즉, 여러 실험 및 제어 치료는 잠재적으로 동일한 받는 사람과 기증자 동물을 사용하여 비교 될 수있다. 바람직한 투여 경로에 따라, 제어 처리는 차량 또는 위약 제어의 국소 또는 전신 투여를 포함할 수 있다(예를 들어, 연고의 국소 적용, 피하, 복종의 정맥 주입). 둘째, 실험의 치료 및 종점의 타이밍이 조절될 수 있다. 셋째, 본 모델은 꼬리로부터 수확한 전체 두께 이식편을 사용하여 상처의 재구성에 의존하며, 이는 백13에서수확한 피부에 비해 기증자 부위에 성공적으로 통합될 확률이 높은 것으로 알려져 있다. 이는 피부 면역생물학에서 중요한 역할을 하고 피부 이식거부(14)와연관되는 표피 랑거한스 세포의 수가 적기 때문일 수 있다.

상처 치유 및 접목 통합의 제안된 모형은 잘 형질전환 및 녹아웃 마우스에 적용될 수 있습니다. 유전자 변형 마우스의 사용은 특정 유전자가 상처 복구 도중 재생할 수 있는 역할을 해명하는 것을 도울 것입니다. 상해 부위에 치료 항체의 국소 상처 제제 또는 피하 투여의 외인적 적용도 고려될 수 있다.

기술적 어려움으로 인해 표피와 진피의 일부로 구성된 분할 두께 피부 이식편은 마우스에서 구하기 어렵다. 표피와 전체 두께 진피로 구성된 전체 두께 피부 이식편은 성공적인 통합을 위해 잘 혈관화된 상처 침대를 필요로 하는 것으로 알려져 있다. 마우스에서 분할 두께 피부 이식편을 수확하는 무능력은 이 모형의 한계로 간주될 수 있다. 수용자 상처 침대에 피부 이식의 고정은 조직 고정의 다른 수단에 비해 적은 외상과 급속한 저하와 관련된 수술 접착제 접착제의 적용을 통해달성되었다(15) 이전 연구는 봉합이 수술 후 24 시간 에서 수술 접착제보다 더 강한 조직 고정과 연관되어 있음을 보여 주었다15,이는 절차의 불이익으로 간주 될 수있다. 그러나, 나중에 시점에서, 외과 접착제로 치료 상처의 생체 역학 강도봉합부(15)에 필적하고 스테이플 고정(16)보다더 나은된다. 수술 접착제로 조직 고정 후 상처는 상처 드레싱으로 덮여 있어야합니다. 마우스의 등쪽 표면에 상처가 닿기 는 어렵지만, 상처 드레싱은 동물이 조작하고 제거하기 쉽습니다. 빈번한 상처 드레싱 변경이 보증될 수 있습니다.

작은 설치류에서 마취 유도 저체온증은 잘 문서화 된 현상(17)이다. 저체온증은 합병증을 일으키고 잠재적으로 동물의 건강과 데이터 품질을 모두 손상시키는이 절차의 부작용입니다. 따라서 이 방법은 특히 털이 없는 SKH1-Hrhr이 사용되는 경우 온도 관리 전략의 구현을 보증합니다.

인간의 상처 폐쇄를 모방하기 위해 마우스를 사용하는 가장 중요한 한계는 피부 해부학과 생리학의 차이입니다. 마우스 상처는 수축을 통해 주로 치유되는 반면, 인간의 상처는 과립 조직 형성및상피화(18)를통해 치유됩니다. 이러한 불일치를 고려하기 위해, 현재 모델은 피부 수축을 방지하기 위해 상처 주위에 단단히 부착된 부목링링과 함께 변형및 사용될 수있다(19) 생체 프로토콜에서 이것의 몇몇 장점 그리고 단점을 감안할 때, 이 모형은 시험관에서 공부하는 것은 불가능한 상처 치유에 관련되었던 특정 프로세스를 공부하는 공구역할을 할 수 있었습니다.

프로토콜

모든 실험은 고등 교육 및 연구의 프랑스 부에 의해 승인되었다 (연구 번호: 12216201711616176770v2 및 DAP180012). 모든 마우스는 플라스틱 케이지에 도착하면 단독 으로 보관되었으며 연구 전에 7 일 적응 기간이 허용되었습니다. 동물실은 12/12h 의 빛/어두운 주기(07:00에 켜진 조명)로 유지되었습니다. 음식과 수돗물은 광고 리비툼을 제공했다. BALB/c와 SKH1-Hrhr 마우스는 전통적인 밀/콩 기반 식단을 공급받았습니다. 톱밥 침구는 중첩 재료와 함께 제공되었습니다.

1. 장비 준비

  1. 시술에 대한 연소 장치를 준비하고 온도 컨트롤러(도 1A)를사용하여 80 °C로 설정합니다. 적외선 열 화상 카메라를 사용하여 황동 템플릿(도 1B, C)의온도를 확인합니다.
  2. 디지털 기마계가 올바르게 작동하고 있는지 확인합니다.
  3. 수술 커튼으로 무대를 커버하고 테이블의 높이를 조정(도 1A).

2. 수술 전 및 수술 중 동물 관리

  1. BALB/c 및 SKH1-Hrhr 마우스, 6-8주 나이 획득.
  2. 3 mg/mL에서 파라세타몰 현탁액을 식수에 추가하고 시술 후 최대 72시간 전과 최대 72시간 동안 공급하십시오.
  3. 1mL 주사기와 26G 바늘을 사용하여, 부프레노르핀을 시술 전 0.05 μg/g 30분, 시술 후 처음 72시간 동안 6시간마다 피하시 투여한다.
  4. 1 mL 주사기와 26 G 바늘을 사용하여, 마우스의 dorsum에 리도카인을 투여하고 화상 상처 부위에 2-3 mm 해선을 투여한다. 화상 상처의 유도 전에 0.05 μg/g 피하 15분에서 리도카인을 주입하십시오.
  5. 10 mg/kg및 케타민 100 mg/kg에서 자일라진의 관면 주사를 사용하여 마우스를 마취합니다. 주사를 투여하기 위해 1mL 주사기와 26 G 바늘을 사용한다.
  6. 중요 단계: 마취를 유도한 후 처음 30분 동안 저체온증을 방지하고 마취에서 회복한 후 최소 15분 동안 저체온증을 방지하기 위해 마취된 마우스를 따뜻하게 유지합니다. 가열 패드 이외에, 열 램프를포함한 다른 양식, 따뜻한 액체 또는 공기를 순환, 사전 따뜻하게 열 저수지는 체온을 조절하는 데 사용될 수있다.
  7. 각막의 탈수를 방지하기 위해 마우스의 눈에 윤활 젤을 적용합니다.
  8. 발가락 핀치 철수 반사를 사용하여 마취의 깊이를 평가하십시오.
  9. 1mL 주사기와 26G 바늘을 사용하여 5% 덱스트로스트로 보충된 Lactated 링거 용액의 200 μL을 투여합니다. 마취를 유도한 직후와 탈수를 방지하기 위한 시술 후 6시간 후에 유체 교체 피하를 투여한다.

3. 전체 두께 화상 상처 유도

  1. 마취 된 마우스를 헤어 클리퍼로 면도하십시오.
  2. 마우스의 도섬 표면에 1분간 디필 크림을 발라주세요. 멸균 거즈를 사용하여 크림을 닦고 축축한 거즈 조각으로 부위를 청소하십시오. 건조 할 때까지 약간의 거즈와 피부를 블롯.
  3. 수술 커튼으로 덮인 스테이지에 마우스를 놓고 스테이지를 예열된 황동 템플릿에 가깝게 이동합니다.
  4. 0.15N(도 2)의일정한 압력을 사용하여 마우스 뒷면에 원형 황동 템플릿(20s80°C)을 적용합니다.
  5. 중요한 단계: 화상 유도 직후, 마취된 동물을 가열 패드에 놓고 저체온증을 방지하고 시술 중 및 수술 후 마우스를 따뜻하게 유지합니다. 마취에서 회복되면 마우스를 다시 케이지로 돌려놓습니다.
  6. 중요한 단계: 수술 후 처음 72시간 동안 케이지 바닥에 으깬 식단을 제공합니다. 마우스는 때때로 화상 상처 부상 후 물을 마시는 sipper 튜브까지 도달하는 것을 꺼려한다.

4. 기증자 접목의 수확

  1. 기증자 마우스의 꼬리 의 상부에 메스와 세로 절개를하고 부드럽게 수술 집게를 사용하여 피부를 제거합니다.
  2. 꼬리 껍질을 멸균 페트리 접시에 넣고 멸균 0.9% 식염수 용액 10mL로 채워진 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 눈금자를 사용하여 개별 이식편을 측정하고 꼬리 피부를 각각 15mm의 조각으로 잘라메스를 사용하십시오.
  3. 일단 준비되면, 최대 2 시간 동안 4 °C에서 0.9 % 식염수 용액으로 피부 이식편을 유지합니다.

5. 외과 적 절제 및 피부 이식

  1. 화상 유도 후 24 시간, 이소플루란의 흡입에 의해 마취를 위해 마우스를 준비합니다. 마우스를 유도 챔버에 넣고 5% 이소플루란을 사용하여 마취를 유도하여 100% 산소를 4 L/min의 유속으로 유도한다. 수술 중 마취를 유지하려면 2 L /min에서 2 %의 이소플루란을 사용하십시오.
  2. 마우스에 외과 커튼을 놓고 수술장을 노출하는 창을 잘라냅니다. 무균 기술을 사용하여 먼저 포비도네 요오드로 상처를 면봉한 다음 70 %의 알코올로 상처를 면봉하십시오.
  3. 수술 핀셋 한 쌍으로 불에 탄 조직을 부드럽게 집어 들고 멸균 수술 가위와 핀셋으로 모든 괴사 및 비생존 조직을 소비합니다. 안정적인 수신자 침대를 만들기 위해 피하의 판니큘러스 카노서스 층을 제거합니다.
  4. 갓 준비된 상처 침대에 피부 이식편을 놓습니다. 수술 핀셋을 사용하여 주변 피부를 피부 이식쪽으로 부드럽게 당깁니다. 일부 수술 접착제를 적용하여 접목을 상처 침대에 부착하고 부드럽게 눌러 피부 가장자리를 정렬합니다. 중요 단계: 상처 침대의 크기는 성공적인 이식을 보장하기 위해 피부 이식의 크기보다 약간 커야합니다.
  5. 마우스가 마취에서 회복되도록 허용합니다. 중요 단계: 가열 된 패드에 마우스를 놓습니다. 저체온증을 방지하기 위해 절차 중 및 절차 후 마우스를 따뜻하게 유지하십시오.
  6. 불활성 파라핀 거즈 드레싱과 접목된 상처 위에 접착 보조 드레싱을 발라주세요.
  7. 마우스를 개별 케이지에 넣습니다. 중요한 단계: 수술 후 처음 72시간 동안 케이지 바닥에 으깬 식단을 제공하고 매일 모니터링합니다.
  8. 장난감을 제공하고 환경을 풍요롭게 하십시오.

6. 디지털 이미징 및 사후 상처 수집

  1. 상처 옆에 통치자를 배치하여 디지털 카메라로 상처를 촬영(그림 3).
  2. 실험의 끝에서, 이산화탄소와 자궁 경부 탈구에 노출하여 동물을 안락사. 중요 단계: 자궁 경부 탈구 중 피부의 과도한 당김 작용은 접목을 손상시킬 수 있습니다.
  3. 사후 에서, 외과 가위를 사용하여 근막에 등불 화상 상처를 소비. 상처를 양분. 10% 완충 된 포르말린및 히스토로지 및 면역 학적 화학에 대한 공정의 절반을 수정합니다. RNA 추출 및 단백질 양을 위해 액체 질소의 나머지 절반을 빠르게 동결하고 -80 °C로 유지하십시오.

7. 피부 히스토로지, 면역 화학 및 콜라겐 시각화

  1. 피부 샘플을 파라핀에 넣고 4 μm 섹션으로 자르고 양전하 슬라이드에 배치합니다.
  2. 헤마톡슬린과 에오신으로 얼룩진 슬라이드를 사용하여 재상화 속도(원래 상처의 %)를 평가합니다. 신표피로 덮인 상처 부위는 전체 상처의 백분율로 표현될 수있다(도 4). 디지털 현미경 응용 프로그램 및 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 섹션의 현미경 분석을 수행합니다.
  3. 포르말린 고정 및 파라핀 임베디드 조직에서 제조된 조직학적 섹션(4 μm 두께)을 사용하고 면역 조직화학을 적용한다.
  4. 상처에서 콜라겐 I및 fibronectin 발현을 평가하기 위하여는, 1 시간 동안 1 차적인 항체및 인큐베이터를 적용합니다. 검출은 종 특정 고추냉이 과산화제 (HRP) 또는 알칼리인포스파타제 (AP)-컨쥬게이트이있는 이차 항체에 의해 수행될 수 있다.
  5. (i) HRP,3'-diaminobenzidine (DAB) 또는 (ii) AP, 본드 폴리머 정제 레드 (재료의 표), 밝은 붉은 색(그림 5)을산출. 계측기를 사용하여 섹션을 스캔하고 디지털 현미경 응용 프로그램 및 ImageJ로 분석합니다.
  6. 콜라겐 증착에 대한 조직학적 평가를 가능하게 하려면 상업용 키트를 사용하여 조직학적 섹션에서 트리크롬 염색을 수행합니다.
  7. 콜라겐 섬유 시각화를 위해 다광현미경 및 제2 고조파 생성기술(도 5)을사용한다. 이전에 설명된20과같이 조직 화상 진찰을 위한 다광 현미경을 사용하십시오. Ti:Sapphire 레이저를 810 nm의 중앙 파장을 사용하여 두 번째 고조파 및 2광흥분형 형광 신호(TPEF)를 생성하기 위한 레이저 소스로 사용하십시오.
  8. 25x/0.95 W 목표를 갖춘 레이저 빔을 사용하여 두 번째 고조파 생성(SHG) 및 TPEF를 수집하고 흥분시킵니다. NDD PMT 검출기에 의해 이전에설명된 바와 같이 신호를 감지합니다. 레이저 스캐닝 제어 및 이미지 수집을 위한 소프트웨어를 사용합니다.

결과

결과는 개발된 프로토콜이 마우스에 있는 전체 두께 화상 상처의 유도를 허용하는 간단한 방법이다는 것을 보여줍니다. 화상은 예열된 황동템플릿(도 1A-C)을사용하여 유도됩니다. 연소 된 지역은 흰색 에샤와 혈전 영역이있는 원형 상처로 나타납니다. 화상 상처의 크기는 화상 부상 후 24 시간에서 약간 더 큰 화상 부상 진행으로 알려진 잘 설명 된 현상의 결과로, 이는 아마도 급성 염증(22)에기인한다. 절제 후, 화상 상처는 동종 피부 이식편(도3)을사용하여 재구성됩니다. 화상 부상 후 7 일째에 상처가5혈관5가 되어 성공적인 이식의 징후입니다. 표피 각질 각질은 상처를 닫고 상처의 두 가장자리 사이의 간격을 다리하기 위한 노력의 일환으로 인접한 받는 사람 피부에서 이동합니다. 상처의 H 및 E 염색 부위의 현미경 분석은 신표피의 길이가 화상 부상 후 3일째에 비해 화상 부상 후 7일째에 상당히 길어진것으로나타났다(도 4B). 대규모 연구를 수행하기 전에, 연구원은 새로운 개입의 탐구, 타당성 평가, 재현성을 보장하기 위해 방법에 대한 수정의 식별을 가능하게 파일럿 연구를 완료하는 것이 좋습니다. 통계적으로 유의한 효과는 더 작은 샘플에서 검출하기 어려운 반면, 샘플 크기를 늘리는 것은 시험의 통계적 힘을 향상시키는 한 가지 방법입니다. 예를 들어, 그룹 간의 상처 재상화(도4)의비율에서 통계적으로 유의한 차이(p&05)를 검출하기 위해, 샘플 크기는 그룹당 6~8개의 마우스 사이여야 한다. (p 모든 실험은 적어도 두 번 반복되어야 합니다. 섬유아세포와 같은 매트릭스 생성 세포로서, 수신자 조직에서 이식으로 이동함에 따라, 콜라겐 I 및 fibronectin을 포함한 세포외 매트릭스의 주요 성분은 새로 형성된 매트릭스에서 높게 발현된다(도5).

figure-results-1
그림 1: 굽기 장치 설정. (A)굽기 장치의 배치 및 설정. 연소 장치는 온도 컨트롤러에 연결되어 압력 모니터링을 가능하게 하기 위해 디지털 모노미터에 부착됩니다. 굽기 장치는 조정 가능한 단계 위에 일시 중단됩니다 - 화상 유도를 위해 마우스가 배치되는 평평한 표면에. (B-C) 상처 화상을 유도하는 데 사용되는 황동 템플릿의 클로즈업 이미지입니다. (C)황동 템플릿의 직경은 1cm입니다. Please click here to view a larger version of this figure.

figure-results-2
그림 2: 이 문서에 설명된 실험 모델을 재현하는 데 필요한 다양한 단계의 회로도 그림입니다. 절차에세 가지 주요 단계가 있습니다 : (i) 예열 된 황동 템플릿을 사용하여 화상 상처의 유도; (ii) 화상 부상 후 24시간 에서 비생존 괴사 조직의 외과 적절; (iii) 기증자 마우스에서 수확한 전체 두께 동종 피부 이식편을 사용하여 외과 상처 재구성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 재구성된 마우스 화상 상처의 거시적 보기입니다. 화상 부상 후 0, 1, 3 및 7 일에 동종 피부 이식으로 재구성 된 화상 상처의 대표적인 디지털 이미지. 이미지의 눈금자 밀리미터입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 화상 부상 후 3 일과 7 일 상처의 현미경 모습. 화상 부상 후 3 일과 7 일 상처의 H & E 염색 섹션. 신표피(점선)의 길이는(A)3일째(B)7일째 상처에 비해 크게 증가한다. (A)및(B)스케일 바는 100 μm.(C)재상화의 비율의 그래픽 표현이다. 이는 3일째및 7일째에 신표피의 길이를 측정하여 평가되었으며 전체 상처 길이의 백분율로 표현되었다. 결과는 평균 ±S.E.M. (n = 6일 3군에서 마우스 6개, 7일째 에 6마우스, *p< 0.05; 학생의 t-테스트). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: 세포외 매트릭스 및 콜라겐 I 시각화의 평가. (A)콜라겐 및(B)섬유네틴에 대한 염색 7 일째 마우스 상처에 대한 면역 히스트토화학 분석의 대표적인 이미지. 길쭉한 스핀들 모양의 콜라겐 I 양성 세포에 강렬한 붉은 염색을 주목하십시오. 7일째 상처의 진피에 섬유네틴 양성 세포에 갈색 염색을 주목하십시오. 스케일 바 = 모든 이미지에서 50 μm. (A)및(B) 및 (B)전자는 표피를 나타내고 d는 진피를 나타낸다. (C)콜라겐 섬유의 시각화 및 콜라겐 증착의 조직학적 평가. (D)대표 TPEF/SHG 콜라겐 이미지 7 일째 마우스상처. 원형 편광 및 SHG 신호를 이용한 동시 TPEF/SHG 획득은 임계값을 적용한 후 SHG의 이진 분포를 얻기 위해 선택적으로 처리되었다. TPEF 이미지(녹색) 및 SHG 이미지(흰색)는 의사 색상과 오버레이되었습니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

화상상해(23)의두께 분류에 따르면, 전체 두께 화상은 피부의 전체 두께와 피하 조직의 특정 부분의 명백한 참여를 특징으로 한다. 상처의이 유형은 수축 또는 피부 접목2로만치유 할 수 있습니다. 본 문서에 설명된 방법의 내재된 한계는 임상 설정에서 흔히 사용되는 분할 두께 이식편과 는 달리 전체 두께 이식편만 마우스의 꼬리에서 수확되었다는 것입니다. 이것은 마우스 피부가 너무 얇아서 분할 두께 이식편을 얻기 때문에 기술적 어려움 때문이었습니다. 전체 두께 이식편은 혈관이 잘 혈관화된 상처 침대가 필요한 반면, 분할 두께 피부 이식편은 혈관이 적은 기증자 부위에서 살아남을 수 있는반면, 혈관(24)이적다는 점을 지적해야 한다. 이전 연구는 마우스의 뒷면에 유도 된 화상 상처가 새로운 혈관 의 강력한 형성과 연관된 것으로 나타났다5. 이것은 마우스의 dorsum과 같은 잘 혈관화 된 지역이 화상 상처유도를위한 해부학적 랜드 마크로 간주 될 수 있음을 시사한다.

화상 상처 깊이는 고려해야 할 중요한 요소입니다. 화상 상처의 깊이는 개별 마우스 사이에서 일치해야 합니다. 화상 상처 깊이의 재현성은 황동 템플릿의 온도, 열 노출의 압력 및 지속 기간에 따라 달라집니다. 화상 상처 깊이는 조직학적으로 확인되어야 합니다. 과도 한 압력 또는 예열 된 황동 템플릿에 피부의 장기간 노출 기본 조직을 손상 시킬 수 있습니다 명심 하는 것이 중요 하다. 중추 및 말초 신경계의 구성 요소를 포함한 척추 컬럼을 둘러싼 조직은 열에 민감하며 손상된 경우 뒷다리 마비가 발생할 수 있습니다.

수술 후 사망률은 수술과 직접 관련이 없었지만, 감기에 특히 민감한 소수의 털이 없는 SKH1-Hrhr 마우스는 저체온증을 개발하고 전신 마취 후 회복하지 못했습니다. 따라서 마우스가 마취되는 동안 모든 미적 이벤트 중에 추가 열을 제공해야 하며 지속적인 감시가 필요합니다.

이 연구에서 설명된 방법은 수술 부위 감염과 관련이 없었다. 그러나, 무균 기술은 복막 기간 동안 수술 상처로 미생물의 전송을 방지하기 위해 사용되어야한다. 생물 발광 또는 형광 미생물을 가진 상처의 접종은 절차에 통합될 수 있다. 이 기술은 전염성 유기체 및 그들의 병기 발생(25)를공부에 유용 할 수 있습니다. 예를 들어, 생물발광성 박테리아의 외인성 첨가 또는 주사는, 생체 내 전체 동물영상(25)을이용하여 미생물 부담의 모니터링을 허용할 수 있다. 마우스 털이 생체 내 전체 동물 형광 및 생물 발광 이미징을 방해하는 것으로 알려져 있다는 점을 감안할 때, 털이 없는 SKH1-Hrhr 마우스는 형광 또는 생물 발광 기자와 관련된 연구에 이상적인 호스트입니다.

상처 조직 샘플은 다른 시점에서 수집되고 조직학적 및 면역 조직학적 분석을 위해 처리될 수 있다. 단백질 과 RNA는 피부 생검 및 분자 생물학 기술으로부터 분리될 수 있고 상처 치유에 관여하는 주요 분자의 발현을 평가하는 데 사용될 수 있다.

본 연구에서는 화상 상처 치유와 동종 피부 이식의 실험 모델을 설명했습니다. 이 절차는 수정될 수 있고 전임상 연구를 위한 모형으로 봉사할 수 있습니다.

공개 사항

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 라 디렉션 제네랄 드 라메멘트, l'Agence 드 l'Innovation 드 데팡스, 에콜 폴리 테크닉에 의해 지원되었다. 비디오 파일 제작에 크게 도움이 되는 통찰력과 전문 지식을 제공한 에콜 폴리테크닉대학의 동료 얀 플랑티에씨에게 감사드립니다. 저자들은 INSERM Lavoisier (SEIVIL) US 33, 호피탈 폴 브루스, 빌주이프에서 이 프로젝트의 과정에서 제공되는 동물의 웰빙과 치료 전문 지식에 대해 베노이트 푸테만 씨와 샬럿 아우우 씨에게 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1ml 주사기TerumoSS + 01T1
26G 바늘Terumo AganiNN-2613R1/2'' - 0,45 X 12mm
96X21 mm 페트리 접시Dutscher193199
동물 저울KernEMB 5.2K5
BALB/c 마우스Janvier labsBALB/cAnNRj6주 된
생검 폼 패드 30.2X25.4X2mmSimportM476-1
본드 폴리머 정제 레드라이카 바이오 시스템DS9390
황동 블록BVG맞춤 설계원형 직경 10mm
부프레노르핀 (BUPRECARE)AxienceFR/V/6328396 3/20110.05 &mu의 투여량으로 피하 투여; g/ g
연소 장치 Kausistar 400Traç aMatrix34010
CaseViewer3DHISTECH Ltd.3Dhistech, 부다페스트, 헝가리
콜라겐 I 항체Abcamab34710권장 농도 1:50; 1:200
D-(+)- 포도당 (포도당)Sigma AldrichG-8769-100 ml
DAB Leica BiosystemsAR9432
디지털 카메라NIKOND3400대물 렌즈 : SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45
제모 크림Veet
일회용 메스Swann Morton6601
DPBSPAN biotechP04-36300
에탄올 절대VWR 화학 물질20821.310
피브로넥틴 항체Abcamab23750권장 희석 1:1000
필터 0.22umSartorius16532
파인 가위F.S.T.14094-11
겸자 DumontF.S.T.11295-10
이발기AESCULAPB00VAQ4KUY (ISIS)
가열 패드Petelevage120070
이소 플루오란피라말 헬스케어FR/V/03248850/2011
케타민이말진FR/V/0167433 4/1992외과 마취제, 100mg/kg 젖산 링거 용액의 용량으로 복강 내 투여
Flee-Flex1506443
Lamina multilabel 슬라이드 스캐너Perkin Elmer
LAS 소프트웨어Leica버전 2.7.3
Leica Bond IIILeica Biosystem1757
Leukosilk dressingBSN medical72669-01
LidocaineAguettantN01BB02국소 진통제, 0.05 &mu의 용량으로 피하 투여; g / g
압력계KernHDB-5K5
Masson Trichrome 염색 키트Sigma-AldrichHT15-1KT
Micromesh 생검 카세트SimportM507
Multiphoton 반전 스탠드 Leica SP5 현미경Leica microsystemsDM500스캐너 8000Hz NDD PMT 검출기
비 접착 드레싱 AdapticSystagenixA622212.7cm X 22.9cm
OcrygelTvm France###Paracetamol
300mgDollipraneLiquiz
Paraformaldheyde 4%VWR 화학 물질1169945
1:2
SKH1-Hrhr 마우스Charles river686SKH1-HR6주 된
슬라이드ThermoscientificAGAA000080
수술용 접착제BSN medical9927
멸균 거즈Hartmann418545/910 X 10 cm
멸균수Versylene FreseniusB230521
수술용 드레이프Hartmann2775161
Ti:Sapphire ChameleonUltraCoherentDS 16-02-16 F690-1040 nm
열 이미징 카메라TestoTesto 868
자일라진(Rompum 2%)BayerFR/V/ 8146715 2/1980외과 마취제, 10mg/kg의 용량으로 복강 내 투여
포비돈-요오드 MEDA 제약 D08AG02

참고문헌

  1. Shakir, S., et al. Indications and Limitations of Bilayer Wound Matrix-Based Lower Extremity Reconstruction: A Multidisciplinary Case-Control Study of 191 Wounds. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2019).
  2. Greenhalgh, D. G. Management of Burns. New England Journal of Medicine. 380 (24), 2349-2359 (2019).
  3. Bosse, M. J., et al. An analysis of outcomes of reconstruction or amputation after leg-threatening injuries. New England Journal of Medicine. 347 (24), 1924-1931 (2002).
  4. Braza, M. E., Fahrenkopf, M. P. StatPearls. , (2019).
  5. Duchesne, C., Banzet, S., Lataillade, J. J., Rousseau, A., Frescaline, N. Cold atmospheric plasma modulates endothelial nitric oxide synthase signalling and enhances burn wound neovascularisation. Journal of Pathology. 249 (3), 368-380 (2019).
  6. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), 266(2014).
  7. Pakyari, M., et al. Local Expression of Indoleamine 2,3, Dioxygenase Prolongs Allogenic Skin Graft Take in a Mouse Model. Advances in Wound Care. 8 (2), New Rochelle. 58-70 (2019).
  8. Pakyari, M., et al. A new method for skin grafting in murine model. Wound Repair and Regeneration. 24 (4), 695-704 (2016).
  9. McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Current Protocols in Immunology. , Chapter 4, Unit 4 4 (2009).
  10. Cristobal, L., et al. Local Growth Hormone Therapy for Pressure Ulcer Healing on a Human Skin Mouse Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), (2019).
  11. Melican, K., Aubey, F., Dumenil, G. Humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
  12. Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
  13. Larsen, C. P., et al. Migration and maturation of Langerhans cells in skin transplants and explants. Journal of Experimental Medicine. 172 (5), 1483-1493 (1990).
  14. Leonard, D. A., Kurtz, J. M., Cetrulo, C. L. Vascularized composite allotransplantation: towards tolerance and the importance of skin-specific immunobiology. Current Opinion in Organ Transplantationt. 18 (6), 645-651 (2013).
  15. Stoikes, N., et al. Biomechanical evaluation of fixation properties of fibrin glue for ventral incisional hernia repair. Hernia: The Journal of Hernias and Abdominal Wall Surgery. 19 (1), 161-166 (2015).
  16. Foster, K., et al. Efficacy and safety of a fibrin sealant for adherence of autologous skin grafts to burn wounds: results of a phase 3 clinical study. Journal of Burn Care & Research. 29 (2), 293-303 (2008).
  17. Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (5), 577-583 (2013).
  18. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models of Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
  19. Wang, X., Ge, J., Tredget, E. E., Wu, Y. The mouse excisional wound splinting model, including applications for stem cell transplantation. Nature Protocols. 8 (2), 302-309 (2013).
  20. Ruzehaji, N., et al. Pan PPAR agonist IVA337 is effective in prevention and treatment of experimental skin fibrosis. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (12), 2175-2183 (2016).
  21. Ruzehaji, N., et al. Combined effect of genetic background and gender in a mouse model of bleomycin-induced skin fibrosis. Arthritis Research & Therapy. 17, 145(2015).
  22. Singer, A. J., Burn Boyce, S. T. Wound Healing and Tissue Engineering. Journal of Burn Care & Research. 38 (3), 605-613 (2017).
  23. Shakespeare, P. Burn wound healing and skin substitutes. Burns. 27 (5), 517-522 (2001).
  24. Sun, B. K., Siprashvili, Z., Khavari, P. A. Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds. Science. 346 (6212), 941-945 (2014).
  25. Miller, R. J., et al. Development of a Staphylococcus aureus reporter strain with click beetle red luciferase for enhanced in vivo imaging of experimental bacteremia and mixed infections. Scientific Reports. 9 (1), 16663(2019).

재인쇄 및 허가

태그

동종 유전자 이식편으로 재구성된 화상 상처의 뮤린 모델
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.