이 문서는 유기 용매 혼합물에서 감마 변형 펩타이드 핵산 올리고머로부터 나노 구조의 설계 및 자체 조립을 위한 프로토콜을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
DNA 및 RNA 나노 기술의 현재 전략은 수성 또는 실질적으로 수화 된 매체에서 다양한 핵산 나노 구조의 자체 조립을 가능하게한다. 본 기사에서는 유일무이한 주소 지정, 단일 가닥, 감마 변형 펩타이드 핵산(γPNA) 타일의 자체 조립을 통해 유기 용매 혼합물에서 나노섬유 아키텍처를 시공할 수 있는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 각 단일 가닥 타일(SST)은 각각 6개의 베이스의 2개의 결합된 모듈형 도메인으로 구성된 12기 γPNA 올리고머이다. 각 도메인은 프로그래밍된 보완성을 사용하여 인접한 가닥에 존재하는 상호 무료 도메인에 결합하여 길이의 미크론으로 성장할 수 있는 나노 섬유를 형성할 수 있습니다. SST 모티프는 3-나선 나노 섬유의 형성을 가능하게하기 위해 9 총 올리고머로 만들어집니다. 직경 단분산 구조를 형성하는 유사한 DNA 나노 구조와 는 달리, 이러한 γPNA 시스템은 유기 용매 혼합물에서 자체 조립 중에 폭을 따라 번들되는 나노 섬유를 형성합니다. 따라서 여기에 설명된 자가 조립 프로토콜에는 번들 효과를 줄이기 위해 기존의 계면활성제인 도데실 설페이트 나트륨(SDS)도 포함됩니다.
서론
수많은 복잡한나노구조1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12의 수성 또는 실질적으로 수화된 세포의 성공적인 시공은 DNA1,2,3,4,5,
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프로토콜
1. γPNA 서열 설계
- Caltech23의 Winfree Lab에서 개발한 DNA 디자인 툴박스22를 시퀀스 설계를 위한 프로그래밍 스크립트가 포함된 폴더에 다운로드합니다.
- 해당 시퀀스 디자인 폴더 내에서 파일 확장 ".m"과 호환되는 4세대 프로그래밍 언어를 열고 다음 명령을 사용하여 이전에 다운로드한 "DNAdesign" 폴더를 경로에 추가합니다.
>> 애드패스 DNADESIGN - 그런 다음 다음 명령을 사용하여 "PNA3nanofiber.m"라는 다음 스크립트를 실행합니다(보충 도 1참조).
>> PNA3nanofiber - 이 스크립트를 실행하여 "thisSeqs"와 "thisScore"라는 변수를 만듭니다. 변수 "thisSeqs"는 설계된 올리고머의 시퀀스를 포함하고, "thisScore"는 페널티 점수입니다.
- 스크립트를 여러 번 실행하여 가장 최소한의 점수를 얻습니다. 이러한 실행 20개 샘플이 표 1에표시됩니다.
- 지정된 SST 구조 모티프에 대해 생성된 서열의 각 도메인의 원하는 왓슨 크릭 상호 보완성을 수동으로 확인합니....
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결과
위의 섹션에서 논의된 프로토콜은 다중, 뚜렷한 γPNA 올리고머를 사용하여 자체 조립 된 나노 섬유 구조의 견고한 생성을 위한 DNA 나노 섬유에서 적응된 SST 모티프의 디자인을 설명합니다. 이 섹션에서는 설명된 프로토콜의 성공적인 재현에서 얻은 데이터의 해석을 설명합니다.
75% DMSO에서 아닐래온 γPNA 올리고머의 TIRF 영상에 대한 제5항에 기재된 프로토콜에 따라:H2O(v/v) 가장 쉽게 도 4A에도시된 바와 같이 미세한 관측하에서 잘 조직된 아키텍처의 증거를 제공한다. 75% DMF: H2O(v/v) 용매 상태는 spicule 모양 또는 바늘 모양의 나노 구조(도4B)로생성되며, 우리의 경험에서 40% 1,4 디옥산: H2O(v/v) 상태는 TIRF 현미경 검사법을 사용하여 볼 때 필라멘트 나노 구조.......
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토론
이 문서는 기존 핵산 나노 기술 프로토콜을 유기 용매 혼합물에 적응하고 개선하는 데 중점을 둡니다. 여기에 설명된 방법은 선택극성 아프로틱 유기 용매의 정의된 실험 공간 내에서 수정 및 문제 해결에 중점을 둡니다. 다른 확립 된 핵산 나노 기술 프로토콜이 공간 내에서 적응 할 수있는 아직 미개척 잠재력이 있다. 이는 일반적으로 유사한 유기용매(25,26)에서수행되는 폴리머 및 펩티드 합성과 같은 다른 분야에서의 통합을 통해 잠재적인 응용 분야를 향상시킬 수 있다. 또한 위에서 언급한 프로토콜을 연습하는 동안 관찰해야 할 중요한 단계에 중점을 둡니다.
자체 조립을 위한 시료를 준비하는 동안 DMSO 및 DMF 조건에 대해 물의 부피 비율을 25%(v/v)로 유지하는 것이 중요합니다. 따라서 자체 조립에 사용되는 유기 용매도 무수주식으로부터 이어야 한다는 것을 인식하는 것이 중요.......
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공개 사항
저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 국립 과학 재단 보조금 1739308, NSF 경력 보조금 1944130 및 공군 과학 연구 보조금 번호 FA9550-18-1-0199에 의해 부분적으로 지원되었습니다. γPNA 서열은 트루코드 유전자 수리, Inc.의 투물 스리바스타바 박사로부터 받은 관대한 선물이었습니다. 우리는 DNA 디자인 툴박스 MATLAB 코드에 대한 그들의 유용한 대화에 대한 에릭 윈프리 박사와 리잘 하리아디 박사에게 감사드립니다. 우리는 또한 조셉 수한, 마라 설리반 과 생물학적 이미징 센터가 TEM 데이터 수집에 도움을 준 것에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| &감마; PNA 스트랜드/올리고머 | Trucode Gene Repair Inc. | 섹션 2.1 | |
| UV-Vis 분광 광도계 | Agilent | Varian Cary 300 | 섹션 3.1.2 |
| 석영 큐벳 | Starna | 29-Q-10 | 섹션 3.1.1 |
| Thermal cycler | Bio Rad | C1000 touch | 섹션 4.1 |
| 0.2 mL PCR 튜브 | VWR | 53509-304 | 섹션 4.5 |
| 무수 DMF | VWR | EM-DX1727-6 | 섹션 4.6 |
| 무수 DMSO | VWR | EM-MX1457-6 | 섹션 4.6 |
| 무수 1,4-다이옥산 | Fisher Scientific | AC615121000 | 섹션 4.6 |
| 10X 인산염 완충 식염수(PBS) | VWR | 75800-994 | 섹션 3.1.1 |
| 현미경 슬라이드 | VWR | 89085-399 | 섹션 5.2 |
| 유리 커버 슬립 | VWR | 48382-126 | 섹션 5.2 |
| 아밀 아세테이트 시 | 그마-알드리 | 9817 | 섹션 5.2 |
| 이소아밀 아세테이 | VWR | 200001-180 | 섹션 5.2 |
| 비오틴화 소 혈청 알부민(비오틴-BSA) | 시그마-알드리치 | A8549 | 섹션 5.3 |
| 소 혈청 알부민(BSA) | 시그마-알드리치 | A2153 | 섹션 5.4 |
| 스트렙타비딘 | 시그마-알드리치 | 189730 | Section 5.5 |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | Section 5.7 |
| 전반사 형광 현미경 | Nikon | Nikon Ti2-E | Section 5.8 |
| 투과전자현미경 | Joel | JEM 1011 | Section 6.6 |
| 핀셋 | Dumont | 0203-N5AC-PO | Section 6.3 |
| 우라닐 아세테이트 | 전자 현미경 과학 | 22400 | 섹션 6.1 |
| Formvar, 300 메쉬, 구리 그리드 | Ted Pella Inc. | 1701-F | 섹션 6.2 |
| Formvar-일산화규소 유형 A, 300 메쉬, 구리 그리드 | Ted Pella Inc. | 1829 | 섹션 6.2 |
| DNA 올리고머/가닥 | IDT | 섹션 7.1 | |
| 도데실황산나트륨(SDS) | VWR | 97064-860 | 섹션 8.1 |
참고문헌
- Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Shih, W., Quispe, J., Joyce, G.
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재인쇄 및 허가
