인간 신장 조직에서 지역 전사학을 밝히기 위해 레이저 미세 절제술의 응용 프로그램

Summary

우리는 사구체, 근위 관, 두꺼운 상승 사지, 수집 덕트 및 간질염을 포함하여 인간 신장의 하위 세그먼트의 레이저 미세 절제에 대한 프로토콜을 설명합니다. RNA는 얻어진 구획및 RNA 시퀀싱으로부터 분리되어 각 하위 세그먼트 내의 전사 서명의 변화를 결정한다.

Abstract

인간 신장 조직의 유전자 발현 분석은 항상성 및 질병 병리학을 이해하는 중요한 도구입니다. 이 기술의 해상도와 깊이를 증가시키고 조직 내의 세포 수준으로 확장하는 것이 필요합니다. 단일 핵 및 단일 세포 RNA 염기서열 분석의 사용이 널리 퍼져 있지만, 조직 해리로부터 얻은 세포의 발현 서명은 공간 맥락을 유지하지 못한다. 레이저 미세 절제 (LMD)는 특정 형광 마커에 기초하여 알려진 국소화와 관심의 특정 구조 및 세포 그룹의 격리를 허용하여 신장 조직에서 공간적으로 고정 된 전사 적 서명을 획득 할 수 있게합니다. 우리는 빠른 형광 계 얼룩에 의해 유도LMD 방법론을 최적화했습니다, 인간 신장 내의 5개의 별개의 구획을 격리하고 귀중한 인간 신장 조직 견본에서 후속 RNA 순서를 실시하기 위하여. 우리는 또한 수집 된 표본의 적합성 평가를 가능하게하는 품질 관리 매개 변수를 제시합니다. 이 원고에 설명된 워크플로우는 이 접근 방식의 타당성을 보여 주며, 높은 확신을 가지고 하위 세그먼트 전사 서명을 분리합니다. 여기에 제시된 방법론적 접근법은 또한 관련 항체 마커의 대체를 가진 그밖 조직 모형에 적용될 수 있습니다.

Introduction

조직 표본을 연구하는 기술 발전은 다양한 장기에서 건강과 질병의 상태에 대한 이해를 향상했습니다. 그 같은 어드밴스는 병리학이 제한된 지역 또는 특정 세포 모형에서 시작할 수 있다는 것을 강조했습니다, 그러나 전체 기관에 중요한 연루가 있습니다. 따라서, 현재 개인화된 의학의 시대에, 세포와 지역 적 수준 모두에서 생물학을 이해하는 것이 중요하고 전 세계적으로^1. 이것은 다양 한 전문된 세포와 병리학적 스트레스에 분화 및/또는 반응 하는 구조로 구성 되는 신장에서 특히 사실이다. 인간 신장 병의 각종 모형의 병신은 아직도 잘 이해되지 않습니다. 특정 관 세그먼트에서 유전자 발현의 변화를 연구하는 방법론을 생성, 구조 또는 인간의 신장에 있는 interstitium의 지역은 질병의 병인에 통보할 수 있는 지역 특정 변경을 밝히는 기능을 향상할 것입니다.

인간의 신장 생검 표본은 제한적이고 귀중한 자원입니다. 따라서 신장 조직에서 전사학을 심문하는 기술은 조직을 경제화하도록 최적화되어야 합니다. 세포 및 지역 수준에서 전사학을 연구하는 이용 가능한 방법은 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNaseq), 단일 핵 RNaseq(snRNaseq), 현장에서 공간 혼성화 및 레이저 미세 절(LMD)을 포함한다. 후자는 다운스트림 RNA 시퀀싱 및분석^2,3,4,5에대한 조직 섹션 내의 관심 영역 또는 구조의 정확한 격리에 적합합니다. LMD는 해부 도중 형광 기지를 둔 화상 진찰을 사용하여 검증된 마커를 기반으로 특정 세포 모형 또는 구조물의 식별에 의지하기 위하여 채택될 수 있습니다.

레이저 미세 절 보조 지역 전사학의 독특한 특징은 다음과 같습니다 : 1) 세포와 구조의 공간 컨텍스트의 보존, 이는 세포가 조직학적으로 보다는 발현에 의해 식별되는 단하나 세포 기술을 보완; 2) 항체 마커가 발현 서명을 정의하기 때문에 기술은 다른 이미징 기술에 의해 통보되고 통보된다. 3) 마커가 질병에서 변경되는 경우에도 구조를 식별하는 능력; 4) 대략 20,000의 유전자에 있는 낮은 발현된 전사체의 검출; 그리고 5) 놀라운 조직 경제. 이 기술은 충분한 RNA 획득에 필요한 코어의 100 μm 두께 미만의 신장 생검으로 확장가능하며, 대형 저장소 또는 학술 센터^6에서일반적으로 제공되는 보관된 냉동 조직의 사용을 가능하게 한다.

후속 작업에서, 우리는 인간 신장 조직과 함께 사용하기위한 새로운 빠른 형광 염색 프로토콜에 최적화 된 지역 및 대량 전사 기술을 자세히 설명합니다. 이 방법은 고전적인 LMD 탐색을 개선하는데, 이는 골재 튜튜인터테리아식과는 달리 간질 및 신장계 하위 세그먼트에 대한 별도의 식 데이터를 제공하기 때문입니다. 엄격하고 재현성을 보장하기 위해 구현된 품질 보증 및 제어 조치가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 세포와 관심 영역의 시각화를 가능하게 하여 이러한 고립된 영역에서 RNA를 만족스러운 획득하여 다운스트림 RNA 시퀀싱을 허용합니다.

Protocol

이 연구는 인디애나 대학의 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 사용을 위해 승인되었습니다.

참고: 신장 신장 절제술 조직(X 및 Y 치수 모두에서 최대 2cm)을 사용하여 최적의 절삭 온도(OCT) 화합물에 보존되어 -80°C에 저장됩니다. RNA 오염을 제한하고 깨끗한 일회용 장갑과 얼굴 마스크를 사용하는 방식으로 모든 작업을 수행하십시오. 모든 표면의 청결을 보장합니다. 이 프로토콜을 최적화한 장비는 펄스 UV 레이저를 특징으로 하는 레이저 마이크로디섹션 시스템입니다.

1. 냉동 절제

1. 1.2 μm LMD PPS-멤브레인(폴리(p-phenylene 황화물)을 자외선(조직 배양 라미나르 플로우 후드)에 30분 간 미끄러져 냉동절부전을 노출한다. 최적의 조직 준수를 위해 실온에서 슬라이드를 저장합니다.
2. 저온을 -20°C로 식힙니다. 작업 표면을 청소하고 새로운 절단 블레이드를 설치합니다.
3. 냉동실 내부에 작은 슬라이드 박스(RNase 표면 오염 제거 용액으로 세척)를 배치하여 갓 자른 조직으로 슬라이드를 보관합니다.
4. 10월에 시편을 조직 홀더에 부착하고 챔버 온도에 도달하고 OCT 블록과 홀더 사이의 접착력을 강화하기 위해 몇 분 동안 평형화할 수 있도록 한다. 열 추출기사용으로 공정을 지원합니다.
5. 시편을 12 μm 두께로 자르고 슬라이드 어댑터를 사용하여 전문 LMD 슬라이드에 부착합니다. 각 슬라이드는 슬라이드 당 또는 슬라이드 당 최대 2 개의 신장 생검 섹션을 보유합니다. 슬라이드를 -80°C에 건조카트리지와 단단히 닫힌 비닐 봉지 안에 저장하여 과도한 수분이 슬라이드 박스 내부에 축적되는 것을 방지합니다.
6. 각 슬라이드에 표본 ID, 날짜 및 슬라이드 번호로 레이블을 지정합니다.
7. 극저온 절제의 초기 날짜로부터 10 일 이내에 표본이있는 슬라이드를 사용합니다.

2. 레이저 마이크로 디스섹션

1. 염색 직전, FITC-Phalloidin의 4 μL을 추가하여 RNase-free PBS에서 항체 믹스(Ab-Mix)를 10% BSA로 준비합니다. DAPI의 1.5 μL, 탐-호르스폴 단백질(THP)의 2μL, 알렉사 플루어 546, RNase 억제제의 3.3 μL, PBS에서 10% BSA의 89.2 μL(100 μL의 부피에 도달)에 직접 공주된다.
   참고: 대체 항체는 THP 항체 대신 사용될 수 있다. 예를 들어, 알렉사 플루어(568)에 직접 컨쥬게이트된 메가린/LRP2 항체의 2μL은 근위 튜블러를 라벨에 부착하는 데 사용될 수 있다. Ab-Mix에는 LRP2 또는 THP 항체가 포함되어 있습니다(근위 튜벌레 또는 두꺼운 오름팔다리를 각각 시각화합니다). 다른 항체는 사용자 요구에 따라 검증될 수 있다.
2. 차가운 얼음 (-20 °C)에서 슬라이드를 1 분 동안 100 % 아세톤으로 씻고 습도 챔버로 이동합니다.
3. 30 s. 반복에 대 한 RNase 무료 PBS와 슬라이드의 상단을 세척.
4. 30 s. 반복에 대 한 RNase 무료 PBS에서 10% BSA와 슬라이드의 상단을 세척.
5. Ab-Mix를 5분 간 적용합니다.
6. 30 s. 반복에 대 한 RNase 무료 PBS에서 10% BSA와 슬라이드의 상단을 세척.
7. 공기는 5 분 동안 슬라이드를 건조하고 레이저 미세 절삭 플랫폼에로드합니다.
8. RNA 격리 키트로부터 추출 버퍼 50μL을 포함하는 PCR 작업에 적합한 수집 튜브(자동 0.5mL 마이크로센심분리기 튜브)를 설치합니다.
9. LMD를 진행합니다. 대부분의 2시간 이내에 각 LMD 세션을 완료합니다.
   1. 현미경 카메라를 사용하여 전·후 LMD 면역형광 이미지를 수집하여 작업자 간 가변성뿐만 아니라 수행된 프로토콜의 보관 목적, 교육 및 품질 평가를 검증합니다. RNA의 0.5 - 1 ng를 얻기 위해서는 최소 500,000 μm² 영역이 필요합니다. 이것은 종종 관심의 모든 하위 세그먼트에 대한 재료의 충분한 양을 얻기 위해 최대 8 x12 μm 두께의 섹션의 사용을 필요로한다.
   2. 스테인딩, 형태 및 위치로 관심 영역을 식별하고 40보다 큰 레이저 전력을 사용하여 이를 소비합니다.
      참고: 해부 기준은 다음과 같습니다. 근위 관은 FITC-Phalloidin 및 LRP2 라벨링에 의해 정의됩니다. 두꺼운 오름차순 사지는 THP 라벨링에 의해 정의됩니다. 수집 덕트는 핵 형태학(DAPI) 및 기타 염색의 부재에 의해 정의됩니다. 사구체는 FITC-판로이드 및 형태에 의해 정의됩니다. 간질은 스테인드 튜블러 사이의 영역으로 정의됩니다.
10. 두 개의 12 μm 단면을 LMD 슬라이드에 부착하고 전체 섹션을 추출 버퍼로 해부하여 벌크 단면 식 서명을 가져옵니다.
11. LMD 프로세스가 완료되면 수집 마이크로 센심 분리기 튜브를 닫고 적극적으로 움직여 내용이 캡에서 튜브 바닥으로 이동하도록 합니다.
12. 30 s에 대 한 3,000 x g에서 튜브원심 분리.
13. 튜브를 42°C의 수조에서 30분 동안 배양합니다.
14. 2 분 동안 3,000 x g에서 튜브를 원심 분리합니다.
15. 새로운 0.5 mL 튜브로 상체를 전송하고 -80 °C에 저장합니다.

3. RNA 절연

참고 : 이 RNA 격리 프로토콜의 경우 상용 RNA 격리 키트의 프로토콜을 적용했습니다. 제조업체의 프로토콜은 프로젝트에 대해 설정된 품질 관리 요구 사항을 충족하도록 수정되었습니다.

1. 각 RNA 정제 컬럼(PC)에 250 μL의 컨디셔닝 버퍼(CB)를 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
2. 원심 분리기 모든 PC는 16,000 x g에서1 분 동안 .
3. 조직 샘플이 있는 튜브에 70%의 에탄올(키트제공)의 50μL을 추가합니다. 위아래로 파이프를 사용하여 샘플을 잘 섞는다. 소용돌이하지 마십시오. 원심 분리하지 마십시오.
4. 혼합물을 100 x g에서 2 분 동안 조건부 PC및 원심분리기로 옮기십시오 (RNA를 결합하려면), 신속하게 16,000 x g에서 30 s에 대한 원심 분리 (통해 흐름을 제거하기 위해)에 따라. 조직 샘플이 있는 1개 이상의 튜브가 지정된 하위 세그먼트에 사용할 수 있는 경우 이 단계를 반복하십시오.
5. 8,000 x g에서 1분 동안 PC와 원심분리기에 100 μL의 워시 버퍼 1(WB1)을 넣습니다.
6. 각 샘플당 40 μL의 DNase를 준비하십시오(RDD 버퍼의 35 μL에 DNase 5 μL 추가). 그런 다음 PC의 멤브레인에 직접 혼합물의 40 μL을 추가하고 실온에서 15 분 동안 배양합니다.
7. PC의 멤브레인에 WB1의 40 μL을 추가하고 원심분리기를 8,000 x g에서 15s에 추가합니다.
8. PC 멤브레인에 워시 버퍼 2(WB2)의 100 μL을 추가하고 원심분리기는 8,000 x g에서 1분 동안 추가합니다.
9. PC의 멤브레인에 WB2의 100 μL을 추가, 16,000 x g에서2 분 원심 분리기, 즉시 16,000 x g에서1 분 원심 분리에 의해 다음.
10. PC를 새로운 0.5mL 튜브로 전송합니다.
11. 12 μL의 용출 버퍼(EB)를 멤브레인에 넣고 실온에서 7분 동안 배양합니다. 따라서, 풀로 풀화된 모든 해부된 조직 샘플의 최종 부피는 하위 세그먼트당 12 μL이다.
12. 원심 분리는 1,000 x g에서 1 분 동안 샘플을 원심분리한 다음 16,000 x g에서2 분 동안.
13. 2 μL을 생체 분석기 분석을 위한 신선한 튜브로 전송합니다(동결 해동 이벤트를 방지하기 위해).
14. 추가 처리를 위해 준비될 때까지 모든 튜브를 -80°C에 보관하십시오.

4. RNA 염기서열 분석

1. 상용 Bioanalyzer및 소량의 RNA를 측정하는 데 전념하는 칩을 사용하여 품질을 위해 시퀀싱을 위한 각 샘플을 평가합니다.
2. 라이브러리 준비 및 시퀀싱 전에 품질 관리(QC) 매개 변수에 따라 필요한: 대량에 대해 4ng보다 큰 RNA의 수량과 각 하위 세그먼트에 대해 0.5 – 1 ng보다 큰; 200개의 뉴클레오티드(DV200)를 초과하는 녹취록의 퍼센트는 LMD 표본(최적 > 75%)의 경우 25% 이상이어야 합니다.
3. 소량의 저하된 RNA를 위한 상업용 cDNA 라이브러리 준비 키트로 라이브러리 준비를 수행합니다. 보충교재에 기재된 상용 키트의 경우 옵션 2를 사용하는 것이 좋습니다. 일부 시퀀싱 기술은 30%^7과같은 더 높은 최소 DV200 임계값을 요구할 수 있습니다.
4. cDNA 어댑터 및 인덱스를 추가합니다.
5. 마그네틱 비드 기술을 사용하여 RNAseq 라이브러리를 정화합니다.
6. RNAeq 라이브러리 증폭 단계 전에 상업용 rRNA 제거 키트를 사용하여 리보소말 cDNA를 고갈시다.
7. 2 ng/μL cDNA 라이브러리 농도에서 자기 비드 기술을 사용하여 최종 RNAseq 라이브러리를 정화합니다.
8. 상용 시퀀싱 시스템에서 75bp 의 RNA 시퀀싱을 수행하여 3천만 개의 읽기/샘플을 대량으로, 하위 세그먼트 섹션의 경우 1억 개의 읽기/샘플을 제공합니다.
9. 모든 시퀀싱 실행과 함께 참조 RNA(25 μg)를 사용하여 배치 효과를 제어할 수 있습니다. 우리의 참조 RNA의 초기 농도는 1 μg/μL이고, 시퀀싱에 활용되는 최종 농도는 25 ng/μL입니다. 라이브러리 준비 중에 별도의 샘플로 참조 RNA를 실행하고 매번 모든 LMD 시편과 함께 실행한다.
10. FastQC 응용 프로그램을 활용하여 시퀀싱, 간질 및 미토콘드리아 판독의 품질을 평가하고 유전자에 기인하는 읽기를 결정하는 데이터 분석을 수행합니다.
11. 통합 유전체학 뷰어(IGV)를 사용하여 정렬 및 edgeR/rbamtools를 사용하여 성적증명서 발현 측정을 제공합니다.
12. 100,000개 미만의 읽기로 샘플을 제거합니다. 정량적 사용자 정의 임계값에서 낮은 발현 유전자를 필터링 한 후 데이터 세트에서 원시 판독을 정규화합니다.
13. 다른 모든 하위 세그먼트 및 log2 변환의 평균에 대한 관심 하위 세그먼트의 비율로 식을 정량화합니다. 동일한 유전자의 상대적 발현은 하위 세그먼트 및 샘플에 걸쳐 비교될 수 있습니다. 그러나, 유전자와 RNA 종에 걸친 저하의 잠재적 인 차이로 인해 두 개의 다른 유전자 사이의 상대적 발현을 비교하는 것은 이상적이지 않다.
14. 참조 RNA 샘플은 배치 전반에 걸쳐 비교되는 동안, 각 nephron 하위 세그먼트에 특정 제조 업체의 집합에 대한 유전자 발현을 비교하는 농축 분석을 수행. R 값 > 0.9를 사용하는 평균 식의 1표준 편차 내에서 일괄 처리 효과가 허용되는 것으로 간주됩니다. 더 높은 배치 효과 점수에는 추가 정규화가 필요합니다. 허용된 일괄 처리 효과에서 벗어난 모든 실행은 플래그를 지정할 수 있습니다. Q30은 각 시퀀싱 실행에 대해 >90%보다 커야 합니다.

Results

샘플

우리는 신장 신장 신장 세그먼트 및 간질 지역을 격리하기 위하여 급속한 형광 염색 프로토콜을 활용하여 9개의 참조 신장 절제술 (인디애나 대학에서 얻은 3개의 견본 및 신장 정밀 의학 프로젝트를 통해 얻은 6개의 견본)에서 데이터를 제시합니다. 이 과정에서 활용된 단면은 죽은 신장 기증자 또는 영향을 받지 않는 종양 신장 절제술에서 얻어졌습니다. 이들 샘플은 인접한 섹션에서 채취한 H&E얼룩(도 1A)에서가시화된 질병의 병리학적 증거를 갖지 못했다.

레이저 미세 절 품질 관리

신장에 있는 관 하위 세그먼트의 식별은 독특한 관 마커의 항체 염색뿐만 아니라 형태학 및 구조적인 랜드 마크를 통해 달성됩니다. 도 1

Discussion

LMD 기반 전사학은 조직 내의 특정 영역에 유전자 발현을 고정시키는 유용한 기술이다. 이 기술의 기초와 신장에 그것의 잠재적인 응용은 이전에 기술되었습니다⁸. 그러나, 특히 다운스트림 RNA 시퀀싱을 위한 고정밀 해부를 겨냥한 형광 계 해분의 최적화, 현대화 및 합리화는 덜 유비쿼터스이다. 이 방법론은 조직 내 공간적으로 접지되기 때문에 조직 구조에서 새로운 또는 과소 평가 된 마커를 드러낼 가능성이 있습니다. 사실, 세포의 많은 일반적인 마커는 질병으로 변경될 수 있습니다, 따라서 공간 맥락없이 정체성 판결에 대한 세포 RNA 발현 마커에 만 의존하는 것은 질병 상태에서 도전적 일 수있다. 따라서, 공간적으로 고정된 LMD 접근법은 유전자 발현 프로파일^9에의해 주로 세포를 정의하는 단일 세포 및 단일 핵 RNA 시퀀싱과 같은 많은 다른 전사 기술에 대한 지상 진실 플랫폼을 보완하고 제공할 가능성이 높다. 더욱이, LMD(샘플당 최대 20,0...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
아세톤	시그마-알드리치	270725-1L
AMPure 비즈	벡크만 쿨터	A63880
바이오분석기	애질런트	2100
BSA	VWR	0332-100G
DAPI	ThermoFisher	62248
건조제 카트리지	Bel-Art	F42046-0000
DNAse	Qiagen	79254	RDD 버퍼는 pakage
레이저 미세해부 현미경	Leica	LMD6500
Megalin/LRP2 항체	Abcam	ab76969	Alexa Fluor 568
Microcentrifuge tubes	ThermoFisher	AB-0350
현미경 카메라	Leica	DFC700T
PBS ( RNAse Free)	VWR	K812-500ML
Phalloidin (Oregon Green 488)	ThermoFisher	O7466
PicoPure RNA 분리 키트	Applied Biosystems	KIT0204
PPS-membrane slides	Leica	11505268
qPCR Human Reference Total RNA 25 µ g	Takara Clontech	636690
RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip	Agilent	5067-1513
RNAse Away	ThermoFisher	7000
RNAse Inhibitor	ThermoFisher	AM2696
Sequencer (HiSeq 또는 NovaSeq)	Illumina	NA
SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2	Takara Clontech
Tamm-Horsfall 단백질 항체	R& D Systems	AF5144	Alexa Fluor 546
Tissue-Tek® O.C.T. 컴파운드	Sakura	4583