이혈증에서 신경 신경-Glia 상호 작용의 역할을 공부 하기 위한 세포 배양 모델

요약

여기서, 우리는 높은 수율과 재현성을 가진 배아 피질에서 뉴런 및 성상세포 농축 배양, 또는 뉴런 glia 배양을 확립할 수 있는 특정 배양 매체를 사용하여 간단한 접근법을 제시합니다.

초록

허혈성 뇌졸중은 뇌 조직의 저혈당을 특징으로하는 임상 상태이며 산소와 포도당 부족으로 이어지며 결과적으로 뉴런 손실이 있습니다. 수많은 증거는 신경 교교와 신경 세포 사이 상호 작용 허 혈 이벤트 후 유익한 효과 발휘 제안. 따라서 잠재적인 보호 메커니즘을 탐구하려면 허혈성 환경에서 신경 신경 교상호 작용을 연구 할 수있는 모델을 개발하는 것이 중요합니다. 여기서 우리는 쥐 배아 피질로부터 성상세포와 뉴런을 분리하는 간단한 접근법을 제시하며, 특정 배양 매체를 사용하여, 높은 수율과 재현성을 가진 뉴런 또는 성상세포 농축 배양 또는 뉴런 glia 배양을 확립할 수 있도록 한다.

성상 세포와 뉴런 사이의 교차 토크를 연구하기 위해, 우리는 커버립에서 배양 된 뉴런이 다중 웰 플레이트에 도금 된 성상 세포의 단층과 접촉하여 유지되는 공동 배양 시스템을 기반으로 한 접근 방식을 제안합니다. 두 문화권은 작은 파라핀 구체에 의해 떨어져 유지된다. 이 접근은 많은 연구 결과에서 이점을 나타내는 각 세포 모형에 독립적인 조작 및 특정 처리의 적용을 허용합니다.

허혈성 뇌졸중 중에 발생하는 것을 시뮬레이션하기 위해 배양은 산소 및 포도당 박탈 프로토콜을 받습니다. 이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중에서 신경 신경 교상호작용의 역할을 연구하는 유용한 도구를 나타냅니다.

서론

세계보건기구(WHO)의 자료에 따르면 매년 약 550만 명이 허혈성 뇌졸중^1로사망합니다. 이러한 상태는 특정 뇌 영역으로의 혈류의 중단을 특징으로 하며, 조직기능 변경 및 미토콘드리아 기능 장애, 칼슘 장애, 글루타민절 절제, 염증 및 세포 손실^2,,3로이어지는 조직에 산소및 영양소의 공급에 가역적 또는 돌이킬 수 없는 손실이 발생한다.

혈관 세포 외에도, 신경 세포와 신경교 세포는 허혈성 뇌졸중^4의병리생리학에 관여한다. 특히, 성상세포는 뉴런의 유지에 필수적이며 최근에는 허혈성 병변^5에대한 반응에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 이러한 유형의 신경교 세포는 구조적 지지, 산화 스트레스에 대한 방어, 신경 전달 물질의 합성, 세포 세포 통신의 안정화 등의 기능을 수행^6. 뉴런과 함께, 성상세포는 시냅스 전달에 직접적인 역할을 하며, 아데노신 삼위산염, 감마-아미노부티산 및 글루타메이트^7과같은 분자의 방출을 조절한다. 허혈....

프로토콜

사용된 모든 동물은 동물 연구에 대한 국가 윤리적 요구 사항과 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 척추 동물 보호를위한 유럽 협약에 따라 CICS-UBI 건강 과학 연구 센터에서 사육되었습니다 (지침 2010/63 /EU).

1. 쥐 배아 피질 1 차 세포 배양

1. 문화 매체 준비
   1. 다음 보충제를 추가하여 신경물질 배지(NBM)를 준비하십시오: 2% B27, 0.5 mM 글루타민, 25 μM 글루타민및 120 μg/mL 젠타미신. 균질화, 7.2로 pH를 조정하고 0.22 μm 필터를 사용하여 진공 여과 단계로 매체를 살균한다. 뉴런-글리아 세포 배양의 경우, 열활성화 태아 소 혈청(HI-FBS)의 10%를 가진 NBM 세포 배양 배지를 보완한다.
   2. 다음 보충제로 최소 필수 중간 독수리(MEM) 배지를 준비: 나트륨 탄산나트륨 2.2 g/L, 소 췌장에서 인슐린 5 mg/L, D-포도당 무수3.4 g/L, 페니실린(12 U/mL) /연쇄상 절제술(12 μg/mL) 및 10% HI-FBSS. 균질화, 7.2로 pH를 조정하고 여과 단계로 매체를 살균한다.
2. 자재 및 장비 준비
   1. 1mL 플라스틱 마이크로피펫 팁의 단부 부분을 좌우로 천자하여 특정 직....

결과

배양을 특성화하기 위해, GFAP 또는 MAP2를 발현한 세포의 수를 평가하기 위한 면역세포화학, 성상세포 및 뉴런의 널리 사용되는마커(도 2)는각 유형의 피질 배양에서 수행되었다. 이 분석은 성상세포 농축 배양이 GFAP(도 2A)를표현하는 세포의 97 %를 제시한 것으로 나타났다. 신경농축배양에 관해서는 MAP2를 발현한 세포의 78%, 세포의 4%가 GFAP를 발현했으며, 세포의 18%는 GFAP와 MAP2-음성(도2B)이었다. 뉴런-글리아 피질 배양과 관련하여, 세포의 49%는 MAP2 양성, 31%는 GFAP 양성, 20%는 두마커(그림 2C)에대해 부정적이었다.

피질 배양을 확립한 지 7일 후, 뉴런-글리아 배양과 뉴런농축 배양은 OGD 절차를 4h 또는 6.......

토론

여기서 설명된 방법은 쥐 배아 피질 조직에서 성상세포 및 뉴런 절연으로 이루어져 뉴런 또는 천상세포 농축 배양 또는 뉴런-글리아 배양의 확립을 허용한다. 그것은 우리 그룹^5의이전 연구에서 적응 되었다, 어디 피 질 뉴런-glia와 뉴런 농축 배아 배아 문화 격리 설명 하 고 두 문화 특징. 이러한 배양식을 사용하여, Roque 외. 성상 세포가 허혈성 손상에 반응하는 데 중요한 역할을한다는 것을 발견하고 성상 세포와 뉴런 사이의 통신이 신경 보호^5에필수적임을 시사한다. 본 프로토콜에서, 신경-glia 및 신경 농축 문화의 준비 이외에, 우리는 또한 우리가 고립된 뉴런과 성상세포에 허혈환경의 효력을 연구할 수 있는 성상세포 풍부한 문화를 얻을 수 있습니다.

면역 세포화학 데이터의 분석은 뉴런 농축 배양에 있는 세포의 18%와 신경 신경glia 배양에서 20%가 MAP2와 GFAP 둘 다를 위해 부.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
24웰 배양 플레이트	Thermo Fischer Scientific	142475
95% N2/5% CO2 가스 실린더	ArLí quido
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001	1/1000 희석
Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11010	1/1000 희석에 항토끼 결합; 배양 기간 - 실온에서 1시간
B27 보충제 (50x)	Gibco	17504-044
Dako 형광 장착 매체	Dako	S3023
D-glucose 무수	Fisher Scientific	G/0450/60	3.4 g/L
에피형광 현미경	Zeiss	AxioObserver Z1x	63x 객관적인
소 태아 혈청(FBS)	Biochrom	S0615	10%
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1272	120 µ g/mL
글루타메이트	시그마-알드리치	G8415	25&마이크로; M
글루타민	시그마-알드리치	G3126	0.5 mM
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	2 &마이크로; M; 잠복기 - 실온에서 10분
저산소증 배양 챔버	Stemcell Technologies	27310	챔버 OGD 유도에 사용
소 췌장에서 인슐린	Sigma-Aldrich	I5500	5 mg/L
케타민	Sigma-Aldrich	K-002	87.5 mg/Kg
최소 필수 매체 독수리 매체	Sigma-Aldrich	M0268	37°C까지 예열; C 사용 전
마우스 Anti-MAP2	Santa Cruz Biotechnology	Sc-74421	1/500 희석; 잠복기 4 °C에서 하룻밤; C
Neurobasal 매체	Gibco	21103-049	37까지 워밍업;
C 조직학을 위한 사용 전 파라핀 파스틸,	시그마-알드리치	1.07164	응고 점 56-58° C
파라포름알데히드	시그마 - PBS		P6148
			; g/mL)
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P1024
Rabbit Anti-GFAP	DAKO	Z0334	1/2000 희석;4°C에서 하룻밤 동안 잠복기; C
탄산수소나트륨	Fisher Scientific	S/4240/60	2.2g/L
자일라진	시그마-알드리치	X1126	12 mg/kg

에 활용된 안티-마우스 - 실온에서 1시간 페니실린/스트렙토마이신 바이오크롬 A 2213 페니실린(12U/mL)/스트렙토마이신(12&마이크로)에서 Aldrich 4%