방법 논문

이혈증에서 신경 신경-Glia 상호 작용의 역할을 공부 하기 위한 세포 배양 모델

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DOI:

10.3791/61388

⸱

2020년 11월 14일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Investigação em Ciências da Saúde (CICS-UBI), Universidade da Beira Interior, 2Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade da Beira Interior

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기서, 우리는 높은 수율과 재현성을 가진 배아 피질에서 뉴런 및 성상세포 농축 배양, 또는 뉴런 glia 배양을 확립할 수 있는 특정 배양 매체를 사용하여 간단한 접근법을 제시합니다.

초록

허혈성 뇌졸중은 뇌 조직의 저혈당을 특징으로하는 임상 상태이며 산소와 포도당 부족으로 이어지며 결과적으로 뉴런 손실이 있습니다. 수많은 증거는 신경 교교와 신경 세포 사이 상호 작용 허 혈 이벤트 후 유익한 효과 발휘 제안. 따라서 잠재적인 보호 메커니즘을 탐구하려면 허혈성 환경에서 신경 신경 교상호 작용을 연구 할 수있는 모델을 개발하는 것이 중요합니다. 여기서 우리는 쥐 배아 피질로부터 성상세포와 뉴런을 분리하는 간단한 접근법을 제시하며, 특정 배양 매체를 사용하여, 높은 수율과 재현성을 가진 뉴런 또는 성상세포 농축 배양 또는 뉴런 glia 배양을 확립할 수 있도록 한다.

성상 세포와 뉴런 사이의 교차 토크를 연구하기 위해, 우리는 커버립에서 배양 된 뉴런이 다중 웰 플레이트에 도금 된 성상 세포의 단층과 접촉하여 유지되는 공동 배양 시스템을 기반으로 한 접근 방식을 제안합니다. 두 문화권은 작은 파라핀 구체에 의해 떨어져 유지된다. 이 접근은 많은 연구 결과에서 이점을 나타내는 각 세포 모형에 독립적인 조작 및 특정 처리의 적용을 허용합니다.

허혈성 뇌졸중 중에 발생하는 것을 시뮬레이션하기 위해 배양은 산소 및 포도당 박탈 프로토콜을 받습니다. 이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중에서 신경 신경 교상호작용의 역할을 연구하는 유용한 도구를 나타냅니다.

서론

세계보건기구(WHO)의 자료에 따르면 매년 약 550만 명이 허혈성 뇌졸중1로사망합니다. 이러한 상태는 특정 뇌 영역으로의 혈류의 중단을 특징으로 하며, 조직기능 변경 및 미토콘드리아 기능 장애, 칼슘 장애, 글루타민절 절제, 염증 및 세포 손실2,,3로이어지는 조직에 산소및 영양소의 공급에 가역적 또는 돌이킬 수 없는 손실이 발생한다.

혈관 세포 외에도, 신경 세포와 신경교 세포는 허혈성 뇌졸중4의병리생리학에 관여한다. 특히, 성상세포는 뉴런의 유지에 필수적이며 최근에는 허혈성 병변5에대한 반응에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 이러한 유형의 신경교 세포는 구조적 지지, 산화 스트레스에 대한 방어, 신경 전달 물질의 합성, 세포 세포 통신의 안정화 등의 기능을 수행6. 뉴런과 함께, 성상세포는 시냅스 전달에 직접적인 역할을 하며, 아데노신 삼위산염, 감마-아미노부티산 및 글루타메이트7과같은 분자의 방출을 조절한다. 허혈증에 의해 유도된 상해의 일부는 글루타민의 과도한 방출과 시냅스 갈라짐에 축적되어 N-메틸-D-아스파르타테 수용체의 과잉 활성화로 이어지며, 다운스트림 신호 캐스케이드를 활성화하여 궁극적으로흥분독성 8을초래한다. 성상 세포는 시 냅 스 갈라 진 에서 글루타민을 제거 하 고 글루타민으로 변환 할 수 있기 때문에, 그들은 흥분 독성에 대 한 방어에 중요 한, 그로 인하여 허혈에 신경 보호 효과 발휘. 이 세포는 또한 허혈 유도 신경 염증에 있는 역할을 합니다. 허혈성 모욕 후, 활성화된 성상세포는 형태학적 변화(비대) 증식, 증식, 신경교 세동산성 단백질(GFAP) 발현의 증가를 보여준다. 그(것)들은 반응성이 될 수 있습니다 (천체 글리오증), 종양 괴사 인자-α, 인터류킨 -1α 및 인터류킨-1β와 같은 프로 염증성 사이토카인을 방출하고, 차례로 신경 죽음을 유도 할 수있는 산화 질소 및 초산화질소를 포함한 자유 라디칼을 생산9,,10. 대조적으로, 반응성 성상세포는 또한 신경 보호 효과를 재생할 수 있습니다, 그들은 뇌졸중 후 상승 조절되는 성장 인자 β 변환과 같은 항 염증 성 사이토카인을 방출하기 때문에11. 더욱이, 그들은 축 사 발아를 억제 하 여 조직 재생을 제한할 수 있는 신경 교 반을 생성할 수 있습니다.; 그러나, 이러한 신경교 흉터는 부상 부위를 실행 가능한 조직으로부터 분리하여 통제되지 않는 조직손상(12,,13)의계단식 파를 방지할 수 있다.

따라서 허혈성 상해의 영향을 제한하거나 되돌리는 치료 전략을 찾기 위해서는 허혈성 상해하에서 뉴런-glia 상호 작용을 연구할 수 있는 모델을 확립하는 것이 필수적입니다. 허혈성 상해를 연구하는 데 사용되는 다른 모델과 비교하여, 즉 생체 내 모델(14,15,,16),조직형 배양17,,18,,19 및 급성 뇌 슬라이스,20,,21,,22,1차 세포 배양은 덜 복잡하여 각 세포 유형의 병리학적 인 뇌졸중 및 각 세포 표적에 대한 개별 기여도에 대한 연구가 가능하도록 합니다. 전형적으로, 뉴런 농축 배양과 성상세포 농축 배양 사이의 상호작용을 연구하기 위해, 산후 기원의 뉴런 및 신경교 세포는23,,24,또는 산후 신경교세포 및 배아 뉴런(25,2526)을26사용한다. 본명에서 동일한 조직에서 뉴런 또는 성상세포농축 배양 및 뉴런-글리아 배양을 확립하는 간단한 접근법이 제안된다. 이들 1차 세포는 쥐 배아 피질로부터 얻어지며, 뇌졸중27,,28에의해 자주 영향을 받는 부위이다. 더욱이, 조직의 해리는 기계적 절차에 의해서만 수행됩니다. 따라서 이 프로토콜은 동일한 개발 단계, 빠르고 저렴한 방법으로, 고성능 및 재현성을 통해 세포를 격리할 수 있습니다.

성상 세포와 뉴런 사이의 크로스토크는 다중웰 플레이트에 시드된 성상세포의 단층과 접촉하여 커버립으로 배양된 뉴런이 유지되는 공동 배양 시스템을 사용하여 탐구할 수 있습니다. 작은 파라핀 구체는 두 세포 배양의 분리를 보장하기 위해 사용될 수 있다. 이 접근은 접촉하기 전에 각 세포 모형의 독립적인 조작을 허용합니다. 예를 들어, 성상세포에서 특정 유전자를 침묵시키고 허혈성으로 인한 손상에 대한 신경 취약성 또는 보호에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 확인할 수 있다. 시험관 내 허혈성 과 같은 조건을 유도하는 확립된 방법은 산소 및 포도당 박탈(OGD)3이며,이는 무산소 대기(95% N2 및 5% CO2)에 의해 일반 대기(95% 공기 및 5%CO2)를대체하는 것으로 구성된다.2

설명된 방법은 허혈성 뇌졸중의 맥락에서 뉴런과 성상세포 사이의 상호 작용을 간단하고 빠르며 재현 가능하며 저렴한 방식으로 연구하는 데 적합합니다.

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프로토콜

사용된 모든 동물은 동물 연구에 대한 국가 윤리적 요구 사항과 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 척추 동물 보호를위한 유럽 협약에 따라 CICS-UBI 건강 과학 연구 센터에서 사육되었습니다 (지침 2010/63 /EU).

1. 쥐 배아 피질 1 차 세포 배양

  1. 문화 매체 준비
    1. 다음 보충제를 추가하여 신경물질 배지(NBM)를 준비하십시오: 2% B27, 0.5 mM 글루타민, 25 μM 글루타민및 120 μg/mL 젠타미신. 균질화, 7.2로 pH를 조정하고 0.22 μm 필터를 사용하여 진공 여과 단계로 매체를 살균한다. 뉴런-글리아 세포 배양의 경우, 열활성화 태아 소 혈청(HI-FBS)의 10%를 가진 NBM 세포 배양 배지를 보완한다.
    2. 다음 보충제로 최소 필수 중간 독수리(MEM) 배지를 준비: 나트륨 탄산나트륨 2.2 g/L, 소 췌장에서 인슐린 5 mg/L, D-포도당 무수3.4 g/L, 페니실린(12 U/mL) /연쇄상 절제술(12 μg/mL) 및 10% HI-FBSS. 균질화, 7.2로 pH를 조정하고 여과 단계로 매체를 살균한다.
  2. 자재 및 장비 준비
    1. 1mL 플라스틱 마이크로피펫 팁의 단부 부분을 좌우로 천자하여 특정 직경(S용 0.5mm, M용 0.6mm, L용 0.8mm)을 사용하는 바늘을 사용하여 불꽃을 사용하여 팁의 개구부를 밀봉한다.
    2. 모든 유리 제품을 살균합니다. 해부 전반에 걸쳐 사용되는 도구 (예 : 가위, 핀셋, 메스)를 70 % 에탄올에 담근 유지합니다. 라미나르 유량 챔버에 들어가기 전에 70% 에탄올로 재료를 분무하십시오.
    3. 수조 온도를 37°C로 설정하고 수조에 세포 배양 배지를 놓는 후 시술을 시작합니다.
      참고: 면역 세포화학 분석의 경우 폴리-D-리신 코팅은 커버립을 포함하는 다중웰 플레이트에서 수행해야 합니다.
  3. 쥐 배아 피질 배양
    1. 임신 15-16 일 여성 Wistar 쥐에서 쥐 배아를 제거 (결합의 끝, 이는 지속되어야 24 시간, 배아 발달의 1st 날 간주됩니다). 그 목적을 위해, 케타민 (87.5 mg/kg) 및 자일라진 (12 mg/kg)로 여성을 마취하고 배아를 제거합니다. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 자궁 경부 탈구로 여성 쥐를 안락사시합니다.
    2. 배아를 50mL 멸균 튜브에 넣고 배아를 덮을 때까지 인산염 완충식 염수(PBS)를 추가하여 배양실로 신속하게 이동합니다.
    3. 여전히 노른자 낭 안에, 차가운 PBS의 25 mL를 포함하는 페트리 접시에 배아를 배치합니다. 가위와 핀셋의 도움으로 노른자 주머니를 부수고 배아를 제거하고 차가운 PBS가 함유 된 다른 페트리 접시로 옮춥습니다. 페트리 접시의 PBS는 전체 배아를 커버하기에 충분해야합니다.
      참고 : 배아를 손상시키지 않도록 노른자 주머니를 열 때주의하십시오. 1.3.3및 1.3.4에서 우리는 PBS를 저온에서 유지하기 위해 흡수 성 종이로 덮인 얼음 팩 위에 90mm 직경의 페트리 요리를 사용했습니다.
    4. 배아의 해부를 위해, 감기 PBS의 30 mL를 포함하는 다른 페트리 접시로 전송. 배아는 해부 현미경으로 놓고 트위저를 사용하여 고정합니다. 피질에 평행하게 초기 절개를 하고, 안구 구멍에서 총구의 끝으로 가서 동물을 참수하지 않도록주의하십시오.
    5. 피질 뇌 조직을 손상시키지 않기 위해 핀셋을 사용하여 두피와 수막을 조심스럽게 제거하십시오. 피질을 분리하기 위해 다음 절개를 합니다. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 PBS의 5mL를 포함하는 15 mL 튜브로 피질 조직을 전송합니다.
    6. 1.2.1에서 제조된 1mL 플라스틱 팁을 사용하여 피질 뇌 조직의 기계적 소화를 수행한다. 일반 파이펫으로 10번 트리투레이하고 청크가 무너질 때까지 점진적으로 작은 구멍(L, M 및 S)이 있는 파이펫을 사용하여 프로세스를 반복합니다.
    7. 기계적 소화 후, 원심 분리는 3 분 동안 400 x g에서 서스펜션을 분리합니다. 상체를 버리고 이전에 37 °C에서 따뜻하게 한 적절한 세포 배양 배지로 퇴적물을 다시 중단하십시오.
    8. Neubauer 챔버를 사용하여 세포 현탁액(cell density)에 존재하는 세포의 총 수를 결정하고, 적절한 희석을 하고 세포를 플레이트한다. 초기 세포 밀도는 이전 연구5를기반으로 정의되었다.
      1. 뉴런 농축 배양의 경우 0.21 x 106 세포/cm2를 초기 세포 밀도로 사용하고 HI-FBS 없이 NBM 배양 배지에서 세포를 유지한다.
      2. 뉴런-글리아 배양의 경우 0.14 x 106 세포/cm2를 초기 세포 밀도로 사용하고 10% HI-FBS로 보충된 NBM 배양 배지에서 세포를 유지한다.
      3. 성상세포농축 배양의 경우, 0.26 x 106 세포/cm2를 초기 세포 밀도로 사용하고 이전에 표시된 대로 MEM에서 세포를 유지한다.2
      4. 세포를 37°C, 95% O2 및 5% CO2로설정된 인큐베이터에 놓습니다.
        참고: 더 긴 배양 기간 동안, 세포 성장을 억제하기 위해 68 μM uridine을 가진 27 μM 5-플루오로-2′-deoxyuridine와 같은 항 미토Tic를 추가해야 합니다.

2. 공동 문화 시스템

  1. 재료의 준비
    1. 파라핀을 가열 블록에서 150°C에서 약 7분 동안 가열합니다. 절차를 완료 할 때까지 150 °C에서 유지합니다. 그런 다음 직경 1mm의 멸균 유리 파스퇴르 파이펫의 도움으로 멸균 및 PDL 코팅 커버립에 작은 방울을 추가합니다. 파라핀 구체는 불규칙하지만 직경은 약 2mm입니다. 구체는 두 배양을 약 1.25mm로 분리할 수 있도록 합니다.
    2. 파라핀은 멸균되지 않기 때문에, 15 분 동안 자외선 아래 파라핀 구체와 멀티웰을 놓습니다.
    3. 공동 배양을 확립하기 위해, 이전에 15 분 동안 70 % 에탄올에 침지 된 트위저를 사용하여 파라핀 구체로 커버 슬립을 전송합니다.
  2. 공동 문화
    1. 두 배양물(즉, 단계 1.3.8에서 언급된 조건 하에서 문화권에서 7일 후)을 사용할 준비가 되면, 파라핀 구체로 커버립에 시드된 뉴런을 성상세포를 포함하는 우물로 옮는다.
    2. 24 h는 두 배양자가 접촉하기 전에, 실험의 목적에 따라 HI-FBS로 보충된 뉴런 및 성상세포의 배양 배지를 NBM으로 변경한다.
    3. 두 세포 유형을 접촉한 후, 다른 자극및 절차를 시작하기 전에 8-12h를 기다립니다.
      참고: 공동 배양 시스템의 회로도 표현은 도 1에표시됩니다.

3. 산소 및 포도당 박탈

  1. 문화 중형 제제
    1. OGD 실험의 경우 행크의 균형 잡힌 소금 솔루션(HBSS)을 사용합니다. 다음 시약으로 HBSS 배지를 준비: 1.26 mM CaCl2,5.36 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4,0.49 mM MgCl2,139.9 mM NaCl, 4.17 mM NaHCO 3, 3.38 mMNaHCO3,3.38 mM Na2 HPO4. pH를 균질화하고 7.2로 조정합니다. 여과에 의해 매체를 살균.
      참고: 적절한 경우 5.56mM의 포도당을 추가하여 포도당(HBSSglu+)으로 HBSS 용액을 보완하십시오. OGD에 제출 된 문화의 경우 포도당 (HBSSglu-)으로 HBSS 배지를 보충하지 않습니다.
  2. OGD 프로시저
    1. 세포를 파종한 후 7일 후, 배양 배지를 제거하고 HBSSglu-로 두 번 세척한다. 세척 후 HBSSglu-세포 배양 배지를 추가하고 저산소증 챔버에 멀티웰을 배치합니다.
    2. 저산소챔버를 밀봉하고 챔버 내부에 존재하는 산소를 제거하기 위해 20 L/min의 흐름으로 4 분 동안 95 % N2/5 % CO2를 포함하는 가스 믹스를 추가하십시오. 그 후, 유동을 멈추고, 의도된 허혈의 정도에 따라 37°C에서 37°C에서 37°C로 저산소챔버를 배치한다.
    3. OGD 기간 이후에 HBSSglu-배지를 나머지 절차에 적합한 배양 매체로 교체하십시오.
      참고: OGD 실험은 허혈성 이벤트 중에 세포가 겪는 체외 조건을 시뮬레이션하는 것을 목표로 하므로 이전에 사용한 모든 미디어가 제거됨을 증명하는 것이 중요합니다.

4. 면역 세포 화학 분석

참고: 이전에설명된5와 같이 면역 세포화학 분석기를 수행한다.

  1. 간략하게, 상이한 피질 배양을 특성화하기 위하여는, 토끼 항 GFAP (1:2000) 및 마우스 반대로 microtubule 관련 단백질 2 (MAP2; 1:500)와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 세포를 배양; 그리고 다음 이차 항체와 실온에서 1 시간: 알렉사 플루어에 공주 된 안티 토끼 546 및 안티 마우스 에 공주 488, 둘 다에서 1:1000 희석.
  2. 실온에서 10분 동안 2μM Hoechst 33342로 세포 핵을 인큐베이션하여 라벨을 부착합니다.
  3. 마운트는 형광 장착 매체의 입술을 커버하고 63배 배율로 피광 현미경으로 이미지를 획득합니다.

5. 통계 분석

  1. 데이터를 총 셀 수의 백분율로 표현하거나 제어의 백분율로 표현하고 삼중에서 수행된 최소 3개의 독립적인 실험중 평균 ± 표준 오차(SEM)로 제시된다.
  2. 페어링되지 않은 학생의 테스트없이 소프트웨어 (GraphPad Software Inc., 샌디에고, 캘리포니아)로 통계 분석을 수행합니다. 결과는 p< 0.05의 값이 중요할 때 중요한 것으로 간주되었습니다.

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결과

배양을 특성화하기 위해, GFAP 또는 MAP2를 발현한 세포의 수를 평가하기 위한 면역세포화학, 성상세포 및 뉴런의 널리 사용되는마커(도 2)는각 유형의 피질 배양에서 수행되었다. 이 분석은 성상세포 농축 배양이 GFAP(도 2A)를표현하는 세포의 97 %를 제시한 것으로 나타났다. 신경농축배양에 관해서는 MAP2를 발현한 세포의 78%, 세포의 4%가 GFAP를 발현했으며, 세포의 18%는 GFAP와 MAP2-음성(도2B)이었다. 뉴런-글리아 피질 배양과 관련하여, 세포의 49%는 MAP2 양성, 31%는 GFAP 양성, 20%는 두마커(그림 2C)에대해 부정적이었다.

피질 배양을 확립한 지 7일 후, 뉴런-글리아 배양과 뉴런농축 배양은 OGD 절차를 4h 또는 6...

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토론

여기서 설명된 방법은 쥐 배아 피질 조직에서 성상세포 및 뉴런 절연으로 이루어져 뉴런 또는 천상세포 농축 배양 또는 뉴런-글리아 배양의 확립을 허용한다. 그것은 우리 그룹5의이전 연구에서 적응 되었다, 어디 피 질 뉴런-glia와 뉴런 농축 배아 배아 문화 격리 설명 하 고 두 문화 특징. 이러한 배양식을 사용하여, Roque 외. 성상 세포가 허혈성 손상에 반응하는 데 중요한 역할을한다는 것을 발견하고 성상 세포와 뉴런 사이의 통신이 신경 보호5에필수적임을 시사한다. 본 프로토콜에서, 신경-glia 및 신경 농축 문화의 준비 이외에, 우리는 또한 우리가 고립된 뉴런과 성상세포에 허혈환경의 효력을 연구할 수 있는 성상세포 풍부한 문화를 얻을 수 있습니다.

면역 세포화학 데이터의 분석은 뉴런 농축 배양에 있는 세포의 18%와 신경 신경glia 배양에서 20%가 MAP2와 GFAP 둘 다를 위해 부...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 글

저자는 Fundação 파라 프로젝트 UIDB /00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 및 펠로우십 SFRH/BD/135936/2018을 통해 Tecnologia를 통해 자금 지원을 인정합니다. 프로젝트 CENTRO-01-0145-FEDER-000013을 통해 ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020'에 의해 프로젝트 POCI-01-0145-FEDER-022122를 통해 바이오 이미징의 PPBI-포르투갈 플랫폼에 자금을 지원합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
24웰 배양 플레이트Thermo Fischer Scientific142475
95% N2/5% CO2 가스 실린더ArLí quido
Alexa Fluor 488InvitrogenA110011/1000 희석
Alexa Fluor 546InvitrogenA110101/1000 희석에 항토끼 결합; 배양 기간 - 실온에서 1시간
B27 보충제 (50x)Gibco17504-044
Dako 형광 장착 매체DakoS3023
D-glucose 무수Fisher ScientificG/0450/603.4 g/L
에피형광 현미경ZeissAxioObserver Z1x63x 객관적인
소 태아 혈청(FBS)BiochromS061510%
GentamicinSigma-AldrichG1272120 µ g/mL
글루타메이트시그마-알드리치G841525&마이크로; M
글루타민시그마-알드리치G31260.5 mM
Hoechst 33342InvitrogenH13992 &마이크로; M; 잠복기 - 실온에서 10분
저산소증 배양 챔버Stemcell Technologies27310챔버 OGD 유도에 사용
소 췌장에서 인슐린Sigma-AldrichI55005 mg/L
케타민Sigma-AldrichK-00287.5 mg/Kg
최소 필수 매체 독수리 매체Sigma-AldrichM026837°C까지 예열; C 사용 전
마우스 Anti-MAP2Santa Cruz BiotechnologySc-744211/500 희석; 잠복기 4 °C에서 하룻밤; C
Neurobasal 매체Gibco21103-04937까지 워밍업;
C 조직학을 위한 사용 전 파라핀 파스틸,시그마-알드리치1.07164응고 점 56-58° C
파라포름알데히드시그마 - PBSP6148
; g/mL)
Poly-D-lysineSigma-AldrichP1024
Rabbit Anti-GFAPDAKOZ03341/2000 희석;4°C에서 하룻밤 동안 잠복기; C
탄산수소나트륨Fisher ScientificS/4240/602.2g/L
자일라진시그마-알드리치X112612 mg/kg
에 활용된 안티-마우스 - 실온에서 1시간 페니실린/스트렙토마이신 바이오크롬 A 2213 페니실린(12U/mL)/스트렙토마이신(12&마이크로)에서 Aldrich 4%

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