우리는 매달려 드롭 방법을 사용하여 신경 세포로 마우스 배아 줄기 세포의 체외 분화에 대한 절차를 설명합니다. 또한 RT-qPCR, 면역형광, RNA-seq 및 유동 세포종을 통해 포괄적인 현상 분석을 수행합니다.
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이 논문에서
요약
초록
우리는 마우스 배아 줄기 세포를 뉴런 혈통으로 배양하고 분화하기 위한 단계별 절차를 설명하고, 분화된 세포를 특징짓는 일련의 에세이를 따릅니다. 상기 E14 마우스 배아 줄기세포는 매달려 있는 낙하 방법을 통해 배아체를 형성하기 위해 사용되었고, 그 후 망막산에 의해 신경 전구 세포로 분화하도록 유도하고, 마지막으로 뉴런으로 분화하였다. 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-qPCR) 및 면역형광 실험은 신경 전조자와 뉴런이 각각 8일째와 12일째에 대응하는 마커(신경 전조자 및 뉴런용 신경필라멘트용 네신틴)를 나타낸다는 것을 밝혔다. Sox1 프로모터 중심의 GFP 리포터를 발현하는 E14 라인에 대한 유동 세포 측정 실험은 8일째에 세포의 약 60%가 GFP 양성인 것으로 나타났으며, 이는 이 단계에서 신경 전구 세포의 성공적인 분화를 나타낸다. 마지막으로, RNA-seq 분석은 글로벌 전사적 변화를 프로파일로 사용되었다. 이러한 방법은 신경 분화 시 세포 정체성 전이를 조절하는 특정 유전자 및 경로의 개입을 분석하는 데 유용합니다.
서론
개발 중인 마우스 발아세포1,2,마우스 배아 줄기세포(mESC)의 내세포 질량으로부터의 첫 번째 파생이후 줄기세포자가재생 및분화3을연구하는 강력한 도구로 사용되고 있다. 더욱이, mESC 분화를 연구하면 신경퇴행성 질환4와같은 질환 치료에 줄기세포 기반 치료의 효율성과 안전성을 향상시킬 수 있는 분자 메커니즘에 대한 엄청난 이해를 이끌어 낸다. 동물 모델에 비해, 이 체외 시스템은 실용성 및 평가의 단순성, 동물과 대조적으로 세포주를 유지하는 데 드는 저렴한 비용, 유전자 조작의 상대적 용이성을 포함하여 많은 이점을 제공합니다. 그러나, 분화된 세포 유형의 효율 및 품질은 종종 다른 선인 mESC뿐만 아니라 분화 방법5,6에의해 영향을 받는다. 또한, 분화 효율을 평가하는 전통적인 분석은 견고성이 결여되어 유전자 발현의 글로벌 변화를 파악하지 못하는 선택된 마커 유전자의 질적 검사에 의존한다.
여기서 우리는 신경 분화의 체계적인 평가를 위해 애사의 배....
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프로토콜
1. mESC 문화
- 10cm 조직 배양 처리 플레이트를 0.1% 젤라틴으로 코팅하고 젤라틴이 15-30분 이상 을 세울 수 있도록 한 후 이를 꺼낼 수 있습니다.
- 종자 γ 조사 마우스 배아 섬유아데스 (MEFs) 하루 전에 미리 온난 한 mESC 배지에서 mESC를 배양하기 전에 (덜벡코의 수정 된 이글 매체 (DMEM) 15% 태아 소 혈청 (FBS), 비 필수 아미노산, β-메르카토에탄올, L-글루타민, 페니실린/연쇄절제술신, 피루바테 나트륨, LIF, PD0325901(PD), Chir99021(CH).
- γ 조사된 MEF가 E14 세포를 배양하기 전에 플레이트 표면에 정착하고 부착하도록 허용합니다.
- 37°C 수조에서 E14 EsC를 해동하고 따뜻한 mESC 배지로 15cm 원문 튜브로 세포를 신속하게 이송합니다. 3 분 동안 200 x g에서 세포를 펠릿과 상체를 제거합니다.
- mESC 배지의 10mL에서 세포를 재연하고 이전에 시드된 γ 조사된 MEF를 포함하는 배양판에 세포를 플레이트한다. 5% CO2미만의 37°C 인큐베이터에서 세포 배양을 배양한다.
- 배양 패용, 배지를 흡인시키고 멸균 1x PBS로 접시를 씻으세요. 플레이트 표면을 덮고 3....
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결과
우리의 방법의 표현으로, 우리는 E14 세포에 EB, NPC 및 신경 분화 실험을 수행했습니다. E14 세포는 γ 조사된 MEF 인구가 희석될 때까지 γ 조사된 MEF(도1A)에서배양되었다. 우리는 나노그 및 Oct4 마커에 대한 알칼리 인파타아제 (AP) 염색(도 1B)및 이후 RT-qPCR (아래 참조)을 수행하여 E14 세포의 자통을 확인했다. γ 조사된 MEF-없는 E14 세포는 도 2A에설명된 프로토콜을 사용하여 분화를 위해 유도되었다. 간단히, 500세포를 포함하는 20 μL의 분화 매체 액적물배양판의 뚜껑에 씨를 뿌려 하였다(자세한 내용은 프로토콜 섹션 2 참조). 그런 다음 형성된 EB를 수집하여 신선한 분화 매체에 서스펜션에 배치했습니다. 4일부터 8일까지, 5μM RA를 배양판에 첨가하여 NPC를 유도하였다.
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토론
마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화 방법은 수십 년 동안 확립되어 왔으며 연구자들은 이전 프로토콜을 수정하거나 다양한 목적을 위해 새로운 프로토콜을 계속 생성하고있다7,10,11. 우리는 마우스 또는 인간 ESC의 다른 혈통 분화의 분석에 사용될 수 있는 신경에 mESC의 분화 단계의 효율성 그리고 진행을 종합적으로 분석하기 위하여 일련의 분석을 이용했습니다. 더욱이, 우리의 접근은 시험관8에서신경 분화에 특정 유전자 또는 통로의 충격을 평가하기 위하여 유용한 공구로 입증되었습니다.
우리의 방법을 통해, 망막산 (RA)로 처리 된 다능한 언커밋 ESC는 고효율신경 혈통에 커밋하고 뉴런7을생성하도록 유도된다. ES 세포의 성공적인 .......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 NIH (1R35GM133496-01)에서 Z. Gao에 대한 보조금에 의해 지원되었습니다. 우리는 단면에 도움을 준 라이언 홉스 박사에게 감사드립니다. 우리는 게놈 과학 및 생물 정보학, 고급 빛 현미경 검사영상, 유동 세포측정을 포함한 의학의 펜실베니아 주립 대학의 핵심 시설에 감사드립니다. 우리는 또한 RNA-seq 분석에 있는 도움을 주셔서 유카 이마무라 박사에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 트립신 + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0.1% 젤라틴 | Sigma | G1890-100G | 탈이온수에서 준비 |
| 16% 파라포름알데히드 | Thermo Scientific | 28908 | 1X PBS |
| 40-&mu에 희석; m cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | 항체를 1:500으로 희석하여 IF |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| B27 보충제 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer 고감도 DNA 키트 | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| 클로로포름 | C298-500 | Fisher 화학 | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 매체 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB 버퍼 | Qiagen | 19086 | |
| 에탄올 | 111000200 | Pharmco | 탈이온수에 희석 |
| 소 태아 혈청 | 애틀랜타 Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 염기서열분석 시스템 | Illumina | SY-401-2501 | |
| 이소프로판올 | BDH1133-4LG | BDH VWR 분석 | 탈이온수 |
| L-글루타민 | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | 해당 없음 | MEF 상등액 | |
| m18srRNA 프라이머 | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'MEM |
| 비필수 아미노산 | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog 프라이머 | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTGG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes 프라이머 | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'mNeuroD1 |
| 프라이머 | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'mOct4 |
| 프라이머 | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'- CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'mPax6 |
| 프라이머 | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'N2 |
| 보충제 | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin 일차 항체 | Millipore | MAB5326 | 에 대해 1:200에 희석하였다 |
| 뉴로필라멘트 1차 항체 | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq 라이브러리 준비 키트 | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 코닝 | 30-002-Cl | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | N/A | N/A | 탈 이온수에서 준비 |
| - 염화칼 | P217-500G | VWR | |
| - 인산칼륨 일염기성 무수 | 0781-500G | VWR | |
| - 염화나트륨 | BP358-10 | 피셔 생물 시약 | |
| - 인산나트륨, 이염기성, 헵타하이드레이트 | SX0715-1 | Milipore | |
| 랜덤 헥사머 프라이머 | Thermo Scientific | SO142 | |
| 레티노산 | Sigma | R2625 | DMSO |
| 피루브산 나트륨 | Corning | 25-000-Cl | |
| 수크로오스 | Sigma | 84097 | 1X PBS에 희석, |
| SuperScript III, 역전사 효소 | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. 화합물 | Sakura | 4583 | |
| TriPure 분리 시약 | 시그마-알드리치 | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| &베타;-메르캅토에탄올 | Fisher BioReagents | BP176-100 |
참고문헌
- Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent....
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재인쇄 및 허가
