dCas9 Synergistic Activation Mediator System을 통한 Enhancer RNAs In Situ의 강제 활성화

Zian Liao; Joo-Hyung Lee; Joanna Krakowiak; Ruoyu Wang; Wenbo Li

doi:10.3791/61460

이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

dCas9 Synergistic Activation Mediator System을 통한 Enhancer RNAs In Situ의 강제 활성화

2.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/61460

⸱

2020년 6월 5일

Zian Liao^*¹^,² , Joo-Hyung Lee^*¹ , Joanna Krakowiak¹ , Ruoyu Wang¹^,² , Wenbo Li¹^,²

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center, ²Graduate School of Biomedical Sciences, University of Texas MD Anderson Cancer Center and UTHealth

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

인핸서 RNA(eRNA)는 활성 인핸서에서 생산되는 비암호화 RNA입니다. eRNA 기능을 연구하는 최적의 방법은 네이티브 염색질 영역에서 eRNA 수준을 조작하는 것입니다. 여기에서는 CRISPR-dCas9 융합 전사 활성제를 사용하여 관심 있는 eRNA의 발현을 유도하는 eRNA 연구를 위한 강력한 시스템을 소개합니다.

초록

인핸서(Enhancer)는 포유류 게놈에 흩어져 있는 중추적인 게놈 요소이며 조직 특이적 유전자 발현 프로그램을 지시합니다. 인핸서(enhancer)가 전사 인자(transcription factor, TF)에 대한 DNA 결합 모티프를 제공할 뿐만 아니라 eRNA라고 하는 비암호화 RNA를 생성한다는 증거가 증가하고 있습니다. 연구에 따르면 eRNA 전사체는 생리학과 질병 모두에서 유전자 조절에 중요한 역할을 할 수 있습니다. eRNA의 기능을 조사하기 위해 일반적으로 사용되는 방법은 eRNA의 knockdown 또는 enhancer transcription의 화학적 억제에 의한 "기능 손실" 접근 방식으로 제한됩니다. eRNA가 종종 과발현되는 인간 암과 같은 특정 질병 상태를 모방하기 위해 eRNA의 "기능 획득" 연구를 수행하는 강력한 방법은 없었습니다. 여기에서는 dCas9 mediated Synergistic Activation Mediaators(SAM) 시스템을 적용하여 eRNA의 역할에 대한 기능적 질문을 위해 eRNA를 정확하고 강력하게 활성화하는 방법을 소개합니다. eRNA 선택, gRNA 설계, RT-qPCR에 의한 eRNA 활성화 검증에 이르기까지 eRNA 활성화의 전체 워크플로우를 제시합니다. 이 방법은 유전자 조절 및 질병 발달에서 특정 eRNA의 역할을 연구하는 독특한 접근 방식을 나타냅니다. 또한 이 시스템은 특정 질병의 맥락에서 표현형을 유발하는 eRNA 표적을 식별하기 위한 편향되지 않은 CRISPR 스크리닝에 사용할 수 있습니다.

서론

인간 게놈에는 조절 요소 ^1,2,3의 별자리가 포함되어 있습니다. 이 중 인핸서는 가장 중요한 범주 중 하나로 부상합니다 ^4,5,6. 인핸서(Enhancer)는 발달을 조절하는 데 필수적인 역할을 하며, 세포 정체성을 결정하기 위한 공간-시간 유전자 발현 프로그램을 생성하는 역할을 합니다 ^5,6,7. 일반적으로 인핸서는 전사 인자(transcription factor, TF)에 대한 결합 모티프를 제공하는 DNA 요소로만 간주되며, 이는 표적 유전자 발현을 조절합니다 ^6,8. 그러나 일련의 연구에 따르면 많은 활성 인핸서가 비코딩 인....