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방법 논문

인간 자연 킬러 세포 대사의 분석

6.7K 조회수

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DOI:

10.3791/61466

⸱

2020년 6월 22일

 ,  , 
1Cardiovascular Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Departamento de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid (CSIC-UAM), 3Lymphoid Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

이 논문에서

요약

본 논문에서, 우리는 말초 혈액에서 분리된 1 차적인 인간 자연 킬러 (NK) 세포에 있는 글리코리시스 및 미토콘드리아 호흡을 측정하는 방법을 기술합니다, 휴식 또는 IL15 유도된 활성화에 따라. 설명된 프로토콜은 다른 사이토카인 또는 수용성 자극에 의해 활성화된 1차 인간 NK 세포로 쉽게 확장될 수 있었다.

초록

천연 킬러(NK) 세포는 주로 선천적 항종양 및 항바이러스 면역 반응을 중재하고 다양한 사이토카인 및 기타 자극에 반응하여 생존, 세포 증식, 인터페론 감마(IFNγ) 및/또는 세포 독성 프로그램과 같은 사이토카인의 생산을 촉진한다. 사이토카인 자극에 의한 NK 세포 활성화는 그들의 생에너지 및 생합성 요구 사항을 지원하기 위하여 신진 대사 통로의 실질적인 리모델링을 요구합니다. NK 세포 대사가 손상되면 NK 세포 대사를 결정하는 방법의 가용성의 임상 적 중요성을 강조하는 비만 및 암을 포함한 다수의 만성 질환과 관련이 있음을 시사하는 증거가 많이 있습니다. 여기서 우리는 인간 NK 세포의 에너지 대사의 변화를 모니터링하는 도구로, 글리코리시스와 미토콘드리아 산소 소비의 실시간 측정을 허용하는 플랫폼인 세포외 플럭스 분석기의 사용을 설명합니다. 여기에 설명된 방법은 또한 IL-15와 같은 사이토카인을 가진 NK 세포의 자극 후 대사 변화를 모니터링할 수 있게 해주며, 현재 광범위한 임상 시험에서 조사되고 있는 시스템이다.

서론

천연 킬러 (NK) 세포는 항 종양 및 항 바이러스 반응을 중재하는 선천성 림프구입니다. NK 세포는 인간 말초 혈액에 있는 모든 림프구의 5-15%를 포함하고, 또한 비장, 간, 골수 및 림프절에서 찾아볼 수 있습니다. NK 세포는 T 세포 수용체(TCR) 또는 B-세포 수용체(BCR)와 같은 다형성 클로노티픽 수용체를 발현하지 않는다. 대조적으로, 그들의 세포분석 기능의 활성화는 표적 세포1의표면에 불변의 리간드를 인식하는 수용체의 참여에 의해 자극된다1,2.

말초 혈액에서 분리 된 인간의 NK 세포를 휴식 인간 혈 청으로 보충 하는 배양 배지에서 며칠 동안 살아남을 수 있습니다. IL-15 또는 IL-2와 같은 사이토카인에 의한 NK 세포의 활성화는 세포를 증식하고 그들의 살상 능력의 증가로 유도하며, 다른 효과 들사이에서3,,4,,5. 몇몇 연구 결과는 그들의 신진 대사 활동에 있는 NK 세포 활성화 그리고 변경 사이 직접적인 상관관계를 보여주었습니다6. 이러한 신진 대사 변화는 에너지와 생합성의 관점에서 세포의 특정 요구 사항을 충족 하도록 운명.

호기성 세포와 유기체는 탄수화물, 지방 및 단백질의 이화작용 및 산화를 수반하는 일련의 화학 반응을 통해 에너지를 얻습니다. 글리코리시스, 트리카박실산(TCA) 주기 및 산화 인산화의 조합을 통해, 진핵세포는 ATP 수요의 대부분을 충족하고 세포 성장 및 증식에 필수적인 거대 분자를 위한 빌딩 블록으로 요구되는 중간체를 얻습니다. 글리코리시스(도1A)의공정은 세포내 포도당의 진입로 시작한다. 시토솔에서 포도당은 인산화되어 피루바테(포도당 분자당 ATP 분자 2분자의 순 생산)로 변형되어 젖산으로 감소하거나 미토콘드리아로 이송하여 아세틸-코아로 변형하여 TCA 주기를 입력합니다. TCA 주기는 아세틸-CoA의 더 많은 분자로 연료를 공급하고 CO2를 생성합니다 (결국 세포 외부에서 확산되고, 매체에서 H2O와 반응함으로써, 매체의 산성화로 이어질 탄산산을 생성합니다) 및 NADH, 전자 수송 체인 (ETC)에 전자를 기증하는 분자. 전자는 다른 단백질 복합체를 통해 여행하고 마지막으로 산소에 의해 허용됩니다. 이러한 복합체(I, III 및 IV)는 미토콘드리아 매트릭스에서 막 간 공간으로 H+를 펌핑합니다. 생성된 전기화학적 그라데이션의 결과로 H+는 복잡한 V(ATP-synthase)를 통해 매트릭스에 다시 입력하여 ATP 생성에 축적된 잠재적 에너지를 투자합니다.

글리코리시스와 미토콘드리아 호흡은 억제제를 사용하여 다른 지점에서 차단될 수 있다. 이러한 억제제의 지식과 사용은 세포외 플럭스 분석의 개발을 위한 기초였다. pH 및 산소와 같은 두 가지 간단한 파라미터를 실시간으로 측정함으로써 세포외 플럭스 분석기는 96웰 플레이트에서 글리코리시스 및 미토콘드리아 호흡의 속도를 유추합니다. 글리코리시스 스트레스 시험은 포도당 없이 기저 배지에서 수행된다(도1B)7. 세포외 산성화속도(ECAR)의 첫 번째 측정은 글리코리시스 독립적인 산성화를 나타낸다. 이전에 설명한 바와 같이 배지에서 H2 O와 결합하여 H +(TCA-연결된 ECAR)를 생성하는 TCA에 의해+ 생성된 CO2와 비혈당산성화라고 합니다.2 첫 번째 주사는 포도당 활용을 유도 하 고 글리코 리 시 증을 향상 하는 포도 당이다. 두 번째 주사는 두 로테네톤을 결합, 복합 I 억제제, 및 항마이신 A, 복합 III 억제제, ETC. 세포가 세포 ATP 수준을 유지하기 위해 글리코분해를 활성화하여 미토콘드리아 ATP 생산의 이러한 극적인 감소에 반응하는 것을 차단하고, 이는 기저 상태의 세포에 의해 사용되지 않지만 ATP 수요증가에 대응하여 잠재적으로 모집될 수 있는 글리코리시스의 양을 나타낸다. 세 번째 주사는 포도당 아날로그 2-Deoxyglucose (DG), 효소 헥소키나아제에 대 한 기판으로 포도당과 경쟁. 이 인산화의 생성물, 2-deoxyglucose-6-인산염은 피루바테로 변환될 수 없고, 따라서 글리코리시스가 막혀 ECAR를 최소한으로 낮춥습니다. 이 시점에서 측정된 ECAR에는 글리코리시스 또는 호흡기 활성뿐만 아니라 2-DG(Post 2-DG 산성화)에 의해 완전히 억제되지 않은 잔류 당화에 기인하지 않는 세포외 산성화의 다른 공급원을 포함한다.

미토콘드리아 스트레스 시험은 포도당(도1C)8을가진 배지에서 수행됩니다. 산소 소비속도(OCR)의 첫 번째 측정은 미토콘드리아 호흡(기저 호흡)의 기저선에 대응한다. 첫 번째 주사는 ATP 신타제(복합 V)를 통해 양성자의 반환을 억제하는 올리고마이신으로, ATP 합성을 차단하여 미토콘드리아 멤브레인을 급속히 극화하여 호흡기 복합체를 통해 추가 양성자가 펌핑되는 것을 방지하고 OCR의 감소로 이어집니다. 기준선 호흡과 올리고마이신을 첨가하여 주어진 값 간의 비교는 ATP 연결 호흡을 나타낸다. 산소 소비의 나머지 올리고마이신 무감각 비율은 양성자 누출이라고 하며, 이는 아데닌 뉴클레오티드 트랜스로케이스9와같은 내부 미토콘드리아 막내지질 이중층 또는 단백질을 통한 양성자의 흐름을 나타낸다. 두 번째 주사는 미토콘드리아 막의 탈극화및 미토콘드리아 ATP 합성의 중단으로 이어지는 미토콘드리아 매트릭스에 H+의 대규모 진입을 유도하는 비커플러 2,4-디니트로페놀(DNP)이다. 세포는 막 전위(최대 호흡 용량)를 복구하려는 쓸데없는 시도에서 전자 수송 및 산소 소비 속도를 최대 수준으로 증가시킴으로써 양성자 동기력의 소멸에 반응한다. 최대 호흡 용량과 기저 호흡의 차이는 세포의 예비 호흡 용량으로, 이는 세포가 기저 상태에서 ATP를 생성하는 데 사용되지 않는 호흡의 양을 나타내지만 ATP 수요의 증가 또는 스트레스8의조건 하에서 잠재적으로 모집 될 수 있다. 세 번째 주사는 로테네온과 항마이신 A의 조합이다. 이 주사는 ETC와 OCR이 가장 낮은 수준으로 감소하는 것을 완전히 막고, 나머지 산소 소비는 비 미토콘드리아 (NADPH-산화제 등에 의한)입니다.

대사 경로의 변화는 체외에서 사이토카인을 가진 NK 세포의 지속적인 활성화가 다른 대사 경로10,,11의연구에 의해 NK 세포 피로로 이어질 수 있음을 시사했기 때문에 어떻게 든 NK 세포의 기능을 예측할 수 있었다. NK 세포 대사 상태와 기능 사이의 상관 관계는 암 면역 요법의 관점에서 매우 중요하다. 본 분야에서, IL-15의 주입을 갖는 NK 세포의 활성화, 단독으로 또는 단일 클론 치료 항체와 병용하여 종양 세포 살해를 개선하기 위해 시험되었다12,,13,,14. 이러한 치료 전략에 대한 응답으로 NK 세포의 대사 상태에 대한 지식은 NK 세포 활성화 상태 및 살인 기능의 귀중한 예측을 제공 할 것입니다.

단핵구, T 및 B 세포와 같은 다른 골수성 및 림프구 세포에서 대사 경로에 대한 연구는15에 설명되고 최적화된 방법이16에발표되었다. 이 프로토콜에서 우리는 순수하고 실행 가능한 NK 세포의 높은 숫자를 산출하는 NK 절연 프로토콜과 세포 외 플럭스 분석기를 사용하여 대사 활동을 측정하는 최적화 된 프로토콜을 모두 결합하는 방법을 제공합니다. 여기서 우리는 이것이 휴식과 IL-15 활성화 된 인간 NK 세포에 있는 신진 대사 변경의 연구를 위한 유효한 방법임을 보여줍니다. 세포 외 플럭스 분석의 경우 세포 수 및 약물 농도와 같은 매개 변수가 테스트되고 최적화되었습니다. 다른 호흡 측정 방법에 비해 세포 외 플럭스 분석기는 완전히 자동화되어 매우 적은 양의 세포, 최대 92 개의 샘플을 동시에 테스트 할 수 있으므로 비교적 빠른 방식으로 높은 처리량 스크리닝 (여러 샘플 및 복제)을 허용합니다17.

이 방법은 NK 세포 대사를 공부하여 NK 세포 기능을 평가하는 데 관심이있는 연구원에 의해 사용될 수 있습니다. 그것은 그밖 사이토카인, 항체 또는 수용성 자극에 의해 활성화된 세포에 또한 적용될 수 있었습니다.

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프로토콜

모든 실험은 헬싱키의 의학 연구의 윤리적 원칙 선언에 따라 수행되었다. 기증자로부터 말초 혈액 샘플은 환자 서면 통보 동의와 함께 99-CC-0168 IRB 승인 프로토콜에 따라 수혈 의학의 NIH 부에서 얻어졌다.

1. 시약 준비

  1. NK 셀의 분리를 위한 시약
    참고: 세포 배양 후드에서 이러한 시약을 준비합니다.
    1. NK 분리 버퍼 준비: 1mM EDTA와 2% 태아 송아지 혈청(FCS)을 갖춘 보충 PBS(pH 7.4)는 이전에 열비활성화(30분 동안 56°C).
    2. NK 배양 배지 준비: 10%의 인간 혈청(HS)을 갖춘 이스코브의 수정된 덜벡코 미디어(IMDM)를 보충합니다. 멸균 필터와 2-8 °C에 보관하십시오. 세포에 추가하기 전에 중간을 37°C로 데우도록 데우습니다.
    3. 200 μg/mL에서 PBS에서 휴먼 IL-15를 재중단합니다.
  2. 세포 외 플럭스 분석용 시약
    1. 분석 매체 준비: 미토콘드리아 스트레스 테스트 배지의 경우, 염분 1m 나트륨, 2mM L-글루타민 및 10mM 포도당을 기본 배지에 추가하십시오. 글리코리시스 응력 테스트 배지의 경우, 베이스 배지에 2mM L-글루타민을 추가합니다.
      참고: 포도당, 피루바테 및 글루타민의 농도는 세포외 플럭스 분석기 제조업체에서 권장하는 대로 제공됩니다. 그러나, 배지 구성은 원하는 경우, 문화 매체의 것과 완벽하게 일치하도록 연구원에 의해 변경될 수 있다.
    2. 벤치탑 pH 미터를 사용하여 0.1 N NaOH로 양 매체의 pH를 조정하고 0.2 μM 모공 크기를 통해 멸균 필터를 2-8°C에 저장합니다. 37°C로 웜 미디어를 사용하고, pH를 확인하고, 필요한 경우 사용하기 전에 7.4로 재조정하십시오.
      참고: 외세포 플럭스 분석기의 대기에 주변 CO2만 포함되어 있으며, 중탄산염이 없는 미디어의 사용은 매우 중요합니다.
    3. 시약용 재고 솔루션 준비: 올리고마이신(ATP 신타제 억제제), DMSO내 10m 재고 솔루션; 2,4-디니트로페놀 (DNP, 언커플러), DMSO의 1 M 스톡 솔루션; 항마이신 A (복합 III 억제제), DMSO내 10m 스톡 솔루션; 로테네 (복합 I 억제제), DMSO의 10 m 재고 용액. 모든 시약의 30 μL 알리쿼를 만들고 -20 °C에 보관하십시오.
      참고: 이 지침은 연구원이 개별적으로 구입하고 제조한 시약을 위한 것입니다. 대신 분석기 제조업체에서 시약을 구입한 경우 시약 준비에 대한 지침을 따르십시오.

2. 말초 혈액으로부터 의 NK 세포 격리

  1. 인간 혈액에서 말초 혈액 단핵세포 (PBMC) 준비
    참고: 세포 배양 후드에서 이러한 단계를 수행합니다. 표백제와 혈액과 접촉하는 모든 잔류물 및 물질을 오염 제거하고 소각할 적절한 용기에 버려십시오.
    1. 50mL 원판 튜브로 림프구 분리 매체(LSM)의 파이펫 20 mL.
    2. 조심스럽게, 튜브를 30° 각도로 유지하면서 LSM 위에 피20mL의 피피, 매우 부드럽게 튜브의 벽에 닿습니다. LSM과 혈액의 혼합을 피하고 두 유체 사이의 눈에 보이고 잘 정의 된 상호 단계를 만듭니다.
      참고: 말초 혈액 또는 농축 된 백혈구 제품을 사용할 수 있습니다.
    3. 원심 분리튜브는 실온에서 25분, 1000 x g의 튜브를 원심분리합니다. 튜브 (LSM 및 혈액) 혼합의 두 단계를 만들 수 있으므로 브레이크를 사용하지 마십시오.
    4. 원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 꺼내 랙에 넣습니다. LSM(클리어)과 플라즈마(yellow) 사이의 중간 단계에서 형성되는 세포(단일 핵 세포)의 눈에 띄는 층의 존재를 확인하며, 관 의 바닥에 적혈구펠릿을 놓습니다.
    5. 10mL 플라스틱 파이펫(약 5-8mL)으로 단일핵 세포 층을 부드럽게 흡인하고 새로운 50mL 원문 튜브에 놓습니다. 최대 2개의 다른 관의 림프구 interphase는 함께 풀로 풀수 있습니다.
    6. 45mL PBS로 재차막하고 실온에서 5분 동안 800 x g에서 원심분리하여 단핵 세포를 2배 세척합니다.
      참고: 이 단계 후 말초 혈액 단핵세포(PBMC)의 펠릿이 얻어지고 연구원은 NK 절연 단계로 진행할 수 있다.
  2. PBMC로부터의 NK 절연
    1. 2.1.6에서 셀을 계산하고 NK 분리 버퍼 (1x 108 PBMC / mL)에서 다시 일시 중지합니다.
    2. 셀 리서스펜션(109PBMC)을9 10mL로 가져가서 50mL 튜브에 넣습니다.
    3. NK 세포 격리 항체 믹스의 500 μL(50 μL/mL)을 추가하고 10 μL(1μL/mL 의 완충제)을 PbMC에 안티 CD3 양성 절연 항체 믹스를 넣고 실온에서 10분 동안 배양한다.
    4. 자기 구슬을 소용돌이시키고 항체 (100 μL 구슬 / ml PBMC)와 PBMC의 혼합에 1 mL을 추가합니다. 때때로 교반과 실온에서 10 분 동안 배양.
    5. NK 절연 버퍼 35mL(3.5ml 버퍼/ml PBMC)를 넣고 15분 동안 자석에 넣고 15분(2.2 x 107 PBMC/mL)에 넣습니다. 그 후, 양분비와 셀이 긍정적으로 선택된 (NK 셀을 제외한 모든)은 튜브의 벽에 부착됩니다.
    6. 튜브의 측면이나 바닥을 만지지 않고 50mL 플라스틱 파이펫으로 상체(NK 셀 포함)를 조심스럽게 수집합니다.
    7. 셀 카운터와 원심분리기를 사용하여 셀을 800 x g에서 5분 동안 계산합니다.
    8. 10% HS를 포함하는 IMDM에서 5 x 106 세포/mL에서 격리된 NK 세포를 재중단하고 실험이 수행될 때까지 5%CO2로 37°C의 인큐베이터에 배치한다.
      참고: 이 NK 격리 프로토콜은 50mL 튜브와 큰 자석의 사용을 위해 적응된 세포 번호 및 시약 볼륨을 명시합니다. 이 프로토콜은 다른 튜브에서 격리 단계를 반복하거나 튜브의 부피를 줄임으로써 축소함으로써 확장(더 많은 PBMC가 얻어질 경우)을 확장할 수 있다. 14-45mL의 최종 부피를 위해 50mL 폴리스티렌 튜브가 사용되며, 4-14의 경우 15mL 폴리스티렌 튜브가 사용되고 볼륨 1-4mL, 5mL 폴리스티렌 튜브가 사용된다. 자석은 다르며 각 경우에 적절한 튜브에 맞습니다. 항체 혼합 및 자기 비드의 양은 또한 세포의 수와 최종 부피에 따라 확장될 수 있다.
  3. 유동 세포측정을 위한 NK 세포 인구 염색
    1. 단계 2.2.8에서 샘플 당 0.25 x 106 세포를 가지고, 실온에서 5 분 동안 800 x g에서 원심 분리에 의해 배지를 제거하고 PBS의 500 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단.
    2. 제조업체의 권장 사항에 따라 생존 성 염료를 추가 (1 μL 의 DMSO 재구성 염료 1 mL에 1 mL 의 세포 회수) 및 30 분 동안 실온에서 배양.
    3. 실온에서 5mL PBS로 재차폐하고 800 x g에서 원심분리하여 2배 를 세척하십시오.
    4. 빛으로부터 보호되는 얼음에 대해 30분 동안 10% HS를 함유하는 IMDM의 100 μL에서 해당 항인간 항체를 가진 얼룩(표 1참조). 모든 항체는 결합및 단일 염색 단계에서 사용될 수 있다.
    5. 수득된 NK 세포 집단의 순도를 평가하기 위해 혈류 세포측정에 의한 샘플을 분석한다. 이전에 설명된 세포 게이팅 및 분석 방법을 사용하여18,,19.
  4. 용해성 IL-15를 가진 NK 세포 자극
    1. 96개의 웰 플레이트(원형 바닥)에서 10% HS를 함유하는 IMDM의 100 μL에서 2.2.8 또는 2.4.3 단계에서 0.75 x 106 셀을 다시 일시 중단합니다.
    2. 10% HS를 함유한 IMDM에서 인간 IL-15 ~ 1 μg/mL을 희석시하십시오. 0.5 μg/mL의 최종 농도에 도달하기 위하여 희석된 인간 IL-15의 100 μL를 세포에 추가합니다.
      참고: 0.5 μg/mL은 IL-15의 포화 농도입니다. IL-15 또는 IL-2, IL-12 또는 IL-18과 같은 다른 사이토카인의 낮은 농도는 원하는 경우 연구원에 의해 테스트될 수 있다.
    3. 세포외 유혈분석기를 수행하기 전에 인큐베이터에 세포를 37°C로 배치하고 48시간 동안 자극한다. IL-15 없이 10% HS를 함유하는 IMDM의 동일한 농도 및 부피에서 자극되지 않은(대조군) 세포를 다시 중단하고, 48h에 대해 동일한 인큐베이터에 배치한다.

3. 센서 카트리지의 수분 공급

참고: 센서 카트리지의 96개의 프로브 팁에는O 2 및 PH 변화를 감지하기 위해 수분을 공급해야 하는 O2 및H+에 대한 개별 솔리드 스테이트 형광이 포함되어 있습니다.

  1. 분석기를 켜고 최대 37 °C까지 따뜻하게하십시오.
  2. 센서 카트리지 패키지를 열고 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에서 분리합니다. 유틸리티 플레이트의 각 웰에 교정용 액의 200 μL을 추가하고 센서 카트리지를 플레이트에 다시 넣어 센서가 용액에 완전히 침수되어 있는지 검증합니다. 최적의 결과를 위해 증발을 방지하기 위해 적절하게 가습되는 CO2-free 인큐베이터에서 37 °C에서 하룻밤 카트리지를 배양합니다. 수분 공급 중에 센서 의 거품 형성을 방지합니다.
    참고: 최소 카트리지 수분 공급 시간은 CO2-무료인큐베이터에서 37°C에서 4h입니다. 또는, CO2-무료인큐베이터에서 37°C에서 멸균수 200μL을 사용한 센서 카트리지의 야간 수분공급, 실행 시작 45~60분 전에 미리 데워진 교정용200μL의 센서 카트리지를 배양하여 사용할 수 있다.

4. 세포 외 플럭스 분석

  1. 접착제 코팅 플레이트 준비
    참고: 대사 파라미터의 측정은 96-음표판의 바닥에 형성된 마이크로 챔버에서 이루어지기 때문에 서스펜션 세포는 먼저 우물의 바닥에 부착되어야 합니다. 홍합 미틸러스 에둘리에서 추출한 세포 접착제가 채용된다. 세포 접착제의 제조 업체는 1 ~ 5 μg / cm2의코팅 농도를 권장합니다. 분석기 세포 배양 마이크로플레이트의 우물은 약 0.110cm2의표면을 갖는다. 따라서 5 μg/cm2 농도의 경우 접착제의 약 0.55 μg가 필요합니다. 접착제 용액의 25 μL이 각각 잘 코팅하는 데 사용되기 때문에, 분석기 세포 배양 마이크로 플레이트에 대한 최적의 접착제 용액 농도는 약 22.4 μg/mL(22.4 μg/mL x 0.025 mL = 0.56 μg)이다.
    1. 0.1M 나트륨 중탄산염, pH 8.0에서 세포 접착제 용액(22.4 μg/mL)을 준비한다. 중탄산염은 세포 부착 성능을 위한 최적의 pH를 제공하며, 제조업체에 따르면 6.5에서 8.0 사이입니다.
    2. 피펫 25 μL 세포 접착제 용액은 분석 플레이트의 각 웰에 20 분 동안 실온에서 배양한다. 그 후, 용액을 제거하고 멸균 물 / 잘 200 μL로 2x를 세척하십시오. 세포 배양 후드 내부에 15 분 동안 접시를 열어 두어 우물을 건조하게하십시오.
      참고: 코팅된 플레이트는 4°C에서 최대 1주 동안 보관될 수 있다.
  2. 접착제로 코팅 된 접시에 세포 파종
    1. 원심분리기 세포는 실온에서 5분 동안 200 x g에서 2.4.3 단계에서. 온난한 미토콘드리아 응력 시험 매체(미토콘드리아 응력 시험이 수행되는 경우) 또는 글리코리시스 응력 시험 배지(글리코리시스 스트레스 테스트가 수행되는 경우)에서 초월제를 제거하고 세포를 세척합니다. 펠릿 세포는 동일한 배지에서 선호하는 세포 농도로 다시 중단(재서스펜션 부피는 선택된 세포 농도에 따라 달라집니다; 각 우물은 세포 현탁액의 180 μL을 포함하기 때문에, 준비 0.26 x 106,0.52 x 106,1.04 x 106,2.08 x 106,4.17 x 106 및 8.33 x 106 셀/m 0.047 x 106,0.094 x 106,0.187 x 106,0.375 x 106,0.75 x 106 및 1에 대한 L 셀 서스펜션. 5 x 106 셀 각각 잘).
    2. 각 우물의 측면을 따라 잘 세포 현탁액의 플레이트 180 μL. 멀티채널 파이펫을 추천합니다. 분석기 배양판의 우물 A1, A12, H1 및 H12를 배경 보정을 위한 제어 우물로 사용하십시오. 이러한 우물(셀 없음)에 분석 배지의 180 μL을 추가합니다. 추가 제어 우물은 원하는 경우 플레이트에 충분한 공간이있는 경우 사용할 수 있습니다.
      참고: 혈청의 존재는 세포 부착이 좋지 않을 수 있습니다.
    3. CO2-무료인큐베이터에서 37°C에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다. 그 동안 10배 화합물을 준비합니다(아래 단계 4.3 참조).
    4. 원심분리기 설정을 제로 제동으로 변경합니다. 5 분 동안 200 x g에서 플레이트를 원심 분리합니다. 현미경의 밑에 세포를 관찰하여 우물의 바닥에 단층층을 형성하는지 확인하십시오. 플레이트를 CO2-무료인큐베이터로 다시 25분 간 옮길 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 도금 후 총 시간이 약 1h보다 크지 않아야 합니다.
  3. 센서 카트리지에 적재할 10배 작동 솔루션 준비
    참고: 센서 카트리지의 96개의 프로브 팁은 각각 4개의 포트(A, B, C 및 D)를 항구하며, 이는 개별 우물에 화합물을 순차적으로 주입하는 데 사용할 수 있습니다.
    1. 미토콘드리아 응력 시험을 수행하기 위해, 각각 10 μM 올리고마이신, 1mM DNP, 10 μM 로테네톤 및 10 μM 항마이신 A의 혼합물을 미토콘드리아 응력 분석 매체에서 각각 2.5mL를 준비한다(1.2.3단계로부터스톡용액을 사용한다). 주입 후 우물의 최종 농도는 1 μM 올리고마이신, 0.1 mM DNP 및 1 μM 항마이신 A/로테네톤이 될 것이다.
    2. 글리코리시스 응력 테스트를 수행하려면 글리코리시스 응력 분석 매체에서 10 μM 로테네네 및 10 μM 항마이신 A의 혼합물 2.5mL를 준비합니다(1.2.3단계로부터의 스톡 용액사용). 글리코리시스 응력 시험 배지에 포도당을 용해하여 500mMMM 용액을 위한 글리코리시스 응력 시험 배지에서 100mMM 용액및 2-deoxy-포도당(2-DG)을 용해한다. 주입 후 우물의 최종 농도는 10mM 포도당, 1 μM 항마이신 A/로테네톤 및 50mM MM 2-DG가 될 것이다.
    3. 37°C에 대한 따뜻한 솔루션, pH를 확인하고 필요한 경우 7.4로 재조정하십시오. 4.3.1 단계에서 제조된 하중 화합물. (미토콘드리아 응력 테스트용) 또는 4.3.2(글리코리시스 응력 테스트용)는 표 2에도시된 바와 같이 카트리지와 함께 제공되는 멀티채널 마이크로파이프터 및 포트 로딩 가이드를 사용하여 수화 센서 카트리지(3.2단계에서)의 포트 A, B 및 C로 한다.
      참고: 분석 중에 모든 우물에서 적절한 주입을 보장하려면 사용되는 각 일련의 포트(예: 모든 포트 A)는 전체 센서 카트리지에서 동일한 사출 볼륨을 포함해야 합니다. 이것은 배경 보정 우물과 실험에 사용되지 않는 우물에도 적용됩니다.
    4. 프로그램을 설정하는 동안 CO2-무료인큐베이터에서 37°C에서 로드된 센서 카트리지를 배양합니다.
  4. 세포외 플럭스 분석 프로토콜 설정
    1. 세포 외 플럭스 분석기 소프트웨어를 열고 그룹 정의 및 플레이트 맵 탭을 사용하면 유사한 조건이 있는 우물 그룹을 나타냅니다(예: 셀 수가 동일한 우물 또는 휴식 세포 또는 IL-15 자극 세포가 있는 우물). 또한 배경 보정 우물(기본적으로 A1, A12, H1 및 H12)을 나타내지만 추가 웰을 사용할 수 있음)과 빈 우물을 표시합니다.
    2. 프로토콜 탭을 사용하여 소프트웨어에서 표 3에 설명된 프로그램을 설정합니다.
    3. 실행 분석 탭을 사용하여 프로그램을 시작합니다. 센서 카트리지(10배 화합물로 수화 및 하중)와 유틸리티 플레이트를 트레이에 놓습니다. 교정 단계(15 -20분) 후, 프롬프트되면 분석 플레이트(뚜껑 제외)의 교정판을 부착된 셀로 교체한다. 그 후 실행이 완전히 자동화됩니다(기계는 모든 측정 및 주사를 수행합니다).
      참고: 특정 화합물이 적절한 포트에 적재되는 한 동일한 플레이트에서 미토콘드리아 스트레스 테스트 및 글리코리스틱 응력 테스트를 수행할 수 있습니다(포트 A에서 올리고마이신, DNP 및 항마이신/로테네네, B와 C는 미토콘드리아 스트레스 테스트가 수행되는 우물의 각각; 포도당, 항마이신/로테네론 및 2-DG포트 A, B 및 C는 각각 글리코분해 응력 시험이 수행되는 우물의 Plate Map 각 계열에 사용되며, 각 테스트에 대해 동일한 양의 포트와 우물에서 사용되며, 각 테스트에 대해 동일한 양의 주사가 적절히 식별된다.
    4. 실행이 완료된 후 데이터를 검색하고 소프트웨어를 사용하여 분석합니다.

5. 셀 번호 결정

참고: 셀 수의 가능한 차이를 고려하여 결과를 정규화할 수 있습니다. 아래에 설명된 두 가지 주요 방법을 사용할 수 있습니다.

  1. DNA 함량 결정
    1. 각 우물에서 파이펫으로 나머지 분석 매체를 제거합니다. 매질을 흡입할 때는 세포를 방해하지 않도록 주의하십시오. 플레이트는 분석될 때까지 -20°C로 저장할 수 있습니다.
      참고: 동결 단계는 효율적인 세포 용해 및 DNA 함량 결정에 중요합니다.
    2. 증류수(200 μL/웰)에서 세포 증식 분석 분석 버퍼(20x)의 1x 용액을 준비한다.
    3. 세포 증식 분석염제 스톡 용액(400x)을 1x 세포 용해 버퍼에 추가합니다. 웰 당 50 ~ 50.000 셀의 검출을 위해, 1 x 세포 증식 분석염료를 사용하십시오. 세포 수가 높을수록, 1x 이상의 최종 농도에서 세포 증식 분석 염료를 사용하는 것이 좋습니다. 이 경우, 5배 최종 농도에서 세포 증식 분석 염료를 사용한다(세포증증 분석 스톡 용액을 80배로 희석하여 1배 세포-용해 버퍼로 희석).
    4. 각 우물에 세포 증식 분석 분석 시약의 200 μL을 추가합니다. 실온에서 2-5 분 동안 샘플을 배양하십시오. 빛으로부터 보호하십시오.
    5. 여기에서 샘플의 형광을 측정 : 480 nm; 배출: 제조업체의 권장 사항에 따라 형광 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 520 nm.
  2. 단백질 함량 결정
    1. 조심스럽게, 세포를 건드리지 않고 각 우물에서 분석 배지를 완전히 흡인시키고 적어도 1 h동안 -20 °C에서 세포를 동결한다. 대안적으로, 세포는 분석이 수행될 때까지 더 긴 시간(최대 1주)동안 동결된 유지될 수 있다.
    2. 각 우물에 1x 프로테아제 억제제(100x 스톡 용액에서)로 보충된 방사성 면역 강수량 분석법(RIPA) 용해 배지50μL을 추가합니다. 실온에서 5분 동안 셰이커에 접시를 놓고 완벽한 셀 용해를 위해 30분 동안 얼음 위에 접시를 배양합니다.
    3. 상온에서 200 x g에서 5 분 동안 접시를 원심 분리합니다. 이 단계는 단백질 측정과의 간섭을 방지하기 위해 세포 이물질을 펠릿합니다.
    4. 제조 업체의 권고에 따라 bicinchoninic acid (BCA) 분석에 의해 단백질 농도측정.

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결과

말초 혈액에서 NK 세포의 격리는 순수하고 실행 가능한 인구를 제공합니다

세포 외 플럭스 분석은 우물에서 H+ 및 O2 농도의 측정을 기반으로하며 세포의 다른 집단 이나 생존가능성을 구별하지 않습니다. 이러한 이유로, 관심있는 세포의 매우 순수하고 실행 가능한 인구를 얻는 것은 이 실험에서 성공하기 위한 중요한 단계이었습니다.

말초 혈액으로부터 NK 세포의 분리는 섹션 2에 명시된 대로 수행되었다. 얻어진 NK 세포의 순도와 생존가능성을 평가하기 위해, PMBC와 고립된 NK 세포 집단으로부터의 작은 알리쿼트들이 혈류 세포측정(그림2A)에의해 염색되고 분석되었다. 단일핵세포는 전방(FSC-A)과 측면 산란 영역(SSC-A)을 보여주는 플롯에 문이 있었다. 이 인구 내에서 단일 세포는 FSC-A 대 전방 산란 ...

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토론

이 논문에서, 우리는 말초 혈액에서 순수하고 실행 가능한 1 차적인 인간 NK 세포를 효율적으로 격리하고 배양하기위한 프로토콜을 설립했습니다. 우리는 또한 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 산소 소비율 및 세포외 산성화 율에 의해 평가된 이들 NK 세포의 대사 활성 측정을 위한 조건을 최적화했습니다. 다른 호흡 측정 방법에 비해 세포 외 플럭스 분석기는 빠르며 소수의 세포가 필요하며 높은 처리량 검사를 허용합니다. 그러나, 그것의 시약은 비싸다, 화합물의 주사는 단지 4로 제한됩니다. NK 세포내 사이토카인에 의한 글리코리시스 및 산화 인산화의 대사 리모델링 및 활성화는 견고한 NK 세포반응(21)에필수적이며, 여기서 설명된 기술은 NK 세포의 대사 프로파일에 대한 연구를 실시간으로 허용한다. 이 프로토콜은 IL-2, IL-12 및 IL-18과 같은 다른 사이토카인에 의해 활성화된 세포또는 수용체 활성화에 결합하는 항체로 확장될 수 있었다. 우리는 최적의 합류에서 세포를 도금하거나 최대 ...

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공개 사항

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

저자들은 마이클 N. 삭 박사(국립 심장, 폐 및 혈액 연구소)에게 지원과 토론을 해 주셔서 감사합니다. 이 연구는 건강의 국가 학회, 국립 암 연구소 및 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다. JT는 미킨(스페인)의 라몬 이 카잘 프로그램(교부라이C2018-026050-I)의 지원을 받고 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-Deoxy-D-glucose (2-DG)MilliporeSigmaD8375-5G글리콜리시스 스트레스 테스트 인젝터 화합물
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)MilliporeSigmaD198501ETC 언커플러/미토콘드리아 스트레스 테스트 인젝터 화합물
96 웰 세포 배양 플레이트/뚜껑이 있는 둥근 바닥Costar3799NK 세포 배양
안티마이신 AMilliporeSigmaA8674복합 III 억제제 / 해당과정 및 미토콘드리아 스트레스 테스트 인젝터 화합물
BD FACSDIVA 소프트웨어BD Biosciences흐름 데이터 수집
BD LSR FortessaBD Biosciences흐름 데이터 수집
Cell-TakCorning354240세포 접착제
CyQUANT 세포 증식 분석ThermoFisher ScientificC7026DNA 정량화를 위한 세포 증식 분석. 세포 용해 완충액 및 CyQUANT GR 염료
포함 EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II줄기세포 기술PBMC에서 17851NK 세포 분리
EasySep Human NK 세포 농축 키트줄기세포 기술19055PBMC에서 NK 세포 분리
EasySep 자석줄기세포 기술PBMC에서 18001NK 세포 분리
EDTA 0.5M, pH 8품질 생물학적10128-446NK 판매 분리 완충액
FACS 튜브Falcon-Fisher Scientific352235유세포 분석 실험
Falcon 50ml 원뿔형 튜브Falcon-Fisher Scientific14-432-22NK 세포 분리
태아 송아지 혈청(FCS)Gibco10437-028NK 세포 분리 완충액
FlowJo SoftwareBD Biosciences플로우 데이터 분석
포도당MilliporeSigmaG8270미토콘드리아 스트레스 테스트 매체의 구성 요소. 해당과정 스트레스 테스트 인젝터 화합물
Halt Protease Inhibitor CocktailThermoFisher Scientific78429Protease inhibitor 100X. RIPA 용해 완충액
Human IL-15Peprotech200-15-50ugNK 세포 자극
Human serum (HS)Valley Biomedical9C0539NK 세포 배양 배지 보충제
IMDMGibco12440053NK cell 배양 배지
L-글루타민 (200 mM)ThermoFisher Scientific25030-081스트레스 테스트 배지 LIVE
/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit구성 요소 ThermoFisher ScientificL34965유세포 염색을 위한 생존 염료
LSMmpbio50494XPBMC 분리
마우스 anti-human CD3 BV711BD Biosciences563725T 세포 유세포 분석 염색
마우스 anti-human CD56 PEBD Pharmingen555516NK 유세포 분석 염색
마우스 anti-human NKp46 PEBD Pharmingen557991NK 유세포 분석 염색
OligomycinMilliporeSigma75351Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound
PBS pH 7.4Gibco10010-023NK cell 분리 완충액
Pierce BCA 단백질 분석 키트ThermoFisher Scientific23225단백질 농도 측정을 위해
RIPA 완충액Boston BioProductsBP-115세포 용해
RotenoneMilliporeSigmaR8875Complex II 억제제 / 해당과정 및 미토콘드리아 스트레스 테스트 인젝터 화합물
Seahorse Wave Controller SoftwareAgilentSeahorse XFe96 분석기 컨트롤러
Seahorse Wave 데스크톱 소프트웨어데이터 분석용애질런트
Seahorse XF Base MediumAgilent102353-100Extracellular Flux assay base medium
Seahorse XFe96 분석기AgilentExtracellular Flux Analyzer
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102416-100XF96 세포 배양 플레이트 20개, XFe96 센서 카트리지 18개, 화합물을 분석 카트리지로 이동시키기 위한 로딩 가이드, 캘리브런트 용액 1병(500ml)이 포함되어 있습니다.
중탄산나트륨MilliporeSigmaS5761Cell-Tak 용액 준비하기 위해
피루브산나트륨 (100 mM)ThermoFisher Scientific11360-070미토콘드리아 스트레스 테스트 배지의 구성 요소

참고문헌

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