여기에 제시된 인포프로테오믹 접근법, 즉 아라비도시스 인포프로테오움의 높은 처리량과 깊은 커버리지를 제공하는 추출 팁 기반인 인포프로테오믹을 이동합니다. 이 접근은 아라비도시스에서 삼투압 신호의 개요를 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
단백질 인산화는 삼투성 조건 하에서 효소 활성 및 유전자 발현의 조절에 매우 중요합니다. 질량 분광법 (MS)기반 인포 프로 테오믹스는 식물 신호 변환을 연구하는 방법을 변화시켰습니다. 그러나, 커버리지의 깊이를 달성하기 위해 많은 시작 재료와 장기간 MS 측정 시간의 요구 사항은 식물의 글로벌 인포 프로테오믹 변화에 대한 높은 처리량 연구에 대한 제한 요인이되고있다. 식물 인산염의 감도와 처리량을 개선하기 위해, 우리는 삼투압 스트레스에 대응하여 식물 인산화 의 신속하고 포괄적 인 분석을 위한 탠덤 질량 태그 (TMT) 라벨과 결합된 정지 및 이동 추출 (stage) 팁 기반 인포프로테오믹스 접근법을 개발했습니다. 단계 팁 기술의 단순성과 높은 처리량을 활용하여 전체 절차는 두 가지 팁을 사용하여 인포펩티드 농축, 분수 및 시료 세척 단계를 완료하는 데 약 1시간이 걸리며, 이는 접근 방식의 사용하기 쉽고 높은 효율을 시사합니다. 이 접근법은 심층적인 식물 인포프로테오믹스 분석(> 11,000인스포펩티드 식별)을 제공할 뿐만 아니라 인접한 분수 간의 우수한 분리 효율(&5% 중복)을 보여줍니다. 또한, 멀티플렉싱은 TMT 라벨링을 사용하여 야생형 및 snrk2 탈취 돌연변이 식물의 인포프로테오믹 변화를 정량화하고 있다. 이 접근법은 육상 식물의 초기 삼투압 신호에 대한 이해를 밝히는 삼투압 스트레스에 대한 응답으로 Raf와 같은 키나아제의 인광 이벤트를 성공적으로 밝히는 데 사용되었습니다.
서론
염도가 높고, 저온, 가뭄으로 인해 삼투압이 발생하며, 이는 식물 생산성1,2에영향을 미치는 주요 환경 요인이다. 단백질 인산화는 삼투압3,4,5에대한 식물 반응에서 신호 지각 및 트랜스포팅을 중재하는 가장 중요한 번역 후 변형 중 하나입니다. SNF1 관련 단백질 키나아제 2s(SnRK2s)는 삼투성 응력 신호6에관여한다. SnRK2 가족 구성원 10명 중 9명은 삼투압7,8에대한 대응으로 상당한 활성화를 보여준다. snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-12)모든 10 SnRK2에서 돌연변이를 갖는 돌연변이는 삼투압에 과민반응을 표시하였다. snrk2-dec 돌연변이체에서는, 삼투성 스트레스-유도된 이노시톨 1,4,5-트리스포산염(IP3),abscisic acid (ABA)....
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프로토콜
1. 샘플 준비
- 알루미늄 호일에 대조군 및 응력 처리 모종(1g)을 수확하고 액체 질소로 샘플을 동결시한다.
참고: 단백질 농도가 높은 것은 일반적으로 성숙한 식물에서 보다 2 주 오래 된 모종에서 관찰. 모종의 한 그램은 MS 분석에 충분 한 단백질 lysate의 약 10 mg을 생성 합니다. 모든 원심 분리 단계는 1단계에서 16,000 x g에서 수행됩니다. - 냉동 모종을 박격포와 액체 질소로 채워진 유봉을 사용하여 미세 한 분말로 갈아 냅니다.
- 용해 버퍼 1mL 추가(100mM Tris-HCl에서 6M 구니딘-HCl, pH 8.5) 10mM Tris (2-carboxyethyl)인 포스핀 염산염(TCEP), 40mMM 2 클로로아세타미드(CAA), 프로테아제 억제제 및 인산 억제제 칵테일을 박격포에 넣고 유봉의 도움으로 혼합한다.
- 식물용 용액을 1.5mL 튜브로 옮기고 95°C에서 5분 동안 가열합니다.
- 튜브를 얼음 위에 10분 동안 놓습니다. 얼음 에 튜브를 10 초 동안 초음파 처리하고 10 초 동안 일시 중지하고 세 번 반복합니다.
- 원심 분리는 20 분 동안 튜브를 원심 분리하고 식물의 150 μL을 1.5 mL 튜브로 lysate.
- 튜....
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결과
이 워크플로우의 성능을 입증하기 위해 Hp-RP 단계 팁 분획과 결합된 IMAC 단계 팁을 활용하여 30분 동안 매니톨 처리 유무에 관계없이 야생형 및 snrk2-dec 돌연변이 묘목의 인포프로테오믹 변화를 측정했습니다. 각 샘플은 생물학적 삼중방식으로 수행되었으며 실험 워크플로우가 도 1로표현된다. 각 시료의 소화된 펩티드(400 μg)는 1개의 TMT-6plex 채널로 분류되었고, 풀과 탈염시켰다. 인포스펩타이드는 IMAC 단계 팁을 사용하여 더욱 농축되었고, 정제된 인포스펩타이드는 이후 Hp-RP 단계 팁에 의해 8개의 분획으로 분획되었다. 각 분획은 90분 LC 그라데이션 분석에 의해 분석되었다. 원시 파일은 아라비도시스 탈리아나 데이터베이스에 대한 검색 엔진을 사용하여 검색되었습니다.
총 11,077개의 고유 인포펩타이드가 6,852개의 국소화된 인산화 부위(클래스 I, 국소화 확률 &.......
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토론
식물 프로테오메와 인포프로테오움의 동적 범위와 복잡성은 여전히 인포프로테오믹스 분석의 깊이에 대한 제한 요소입니다. 10,000개의 인산화부위(21,22)를식별하는 단일 실행 LC-MS/MS 분석의 능력에도 불구하고, 전체 식물 인포프로테오메의 커버리지는 여전히 제한적이다. 따라서 환경 스트레스에 대응하여 식물 신호 네트워크의 글로벌 뷰를 프로파일링하는 데 높은 감도 및 우수한 분리 효율을 제공하는 인포프로테오믹 워크플로우가 요구된다. 상용 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 컬럼 계 크로마토그래피는 MS분석(23,24)에앞서 펩타이드 복잡성을 감소시키는 일반적인 방법이다. 그러나 지루한 샘플 수집 단계와 큰 용출 량은 감도 및 처리량 측면에서 HPLC 기반 방법의 주요 과제입니다. 단계 팁은 고감도 및 고처리량 작업에 .......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 중국 과학 아카데미의 전략적 우선 순위 연구 프로그램, 그랜트 XDB27040106에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 튜브 | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, 무색, 100 튜브 |
| 200 µ L 피펫 팁 | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| 아세트산 | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| 아세토니트릴 | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| 수산화암모 | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| 인산암모늄 monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA 단백질 분석 키트 | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| 무딘 바늘 | Hamilton | 90516 | Kel-F 허브 (KF), 포인트 스타일 3, 게이지 16 |
| C18-AQ 비드 | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µ m | |
| C8 Empore 디스크 | 3 M | 2214 | 47 mm |
| 원심분리기 | 에펜도르 | 프 22620444 | |
| 클로로포 | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| 데이터 분석 소프트웨어 | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic 산성 | 시그마 알드리치 | 5330020050 | |
| 프릿 | 애질런트 | 12131024 | SPE 카트리지 용 프릿 |
| 구아니딘 하이드로 클로 | 시그마 알드리치 | 50933 | |
| H2O | 시그마 알드리치 | 1153334000 | |
| 헤페스 | 시그마 알드리치 | H3375 | |
| 철 (III) 염화물 | 시그마 알드리치 | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| 질량 분석기 | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| 메탄올 | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| 나노 LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA 스핀 컬럼 | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine 나트륨 소금 | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| 플런저 | Hamilton | 1122-01 | 플런저 어셈블리 N, RN, LT, LTN 모델 1702용 (25 μ l) |
| 검색 엔진 소프트웨어 | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK 카트리지 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| 나트륨 데옥시콜레이트 | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac Thermo Fisher Scientific | SPD121P | ||
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| 트리에틸암모늄 바이카보네이트 완충액 | 시그마-알드리치 | T7408 | |
| 트리플루오로아세트산 | 시그마-알드리치 | 91707 | |
| 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염 | 시그마-알드리치 | C4706 | |
| 트리즈마 염산염 | 시그마-알드리치 | T3253 |
참고문헌
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperatur....
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재인쇄 및 허가
