이 프로토콜은 경미한 외상성 뇌 손상에 대한 신경 염증 및 혈역학 반응을 특성화하고 부분 최소 제곱 회귀를 사용하는 다변량 시스템 분석의 일부로 이러한 데이터를 통합하는 방법을 제시합니다.
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방법 논문
외상성 뇌 손상에 대한 신경 염증 및 혈역학 반응의 시스템 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
경미한 외상성 뇌 손상 (mTBIs)은 중요한 공중 보건 문제입니다. mTBI에 반복적으로 노출되면 누적적이고 오래 지속되는 기능 결핍이 발생할 수 있습니다. 우리 그룹과 다른 사람들의 수많은 연구에 따르면 mTBI는 사이토 카인 발현을 자극하고 미세 아교세포를 활성화시키고 뇌 혈류와 신진 대사를 감소시키고 뇌 혈관 반응성을 손상시킵니다. 또한, 몇몇 연구는 이러한 신경 염증 및 혈역학 마커의인지 장애의 혼란과 연관성을보고했습니다. 본원에서 우리는 마우스에서 mTBI에 대한 신경염증 및 혈역학적 조직 반응을 특성화하는 방법을 상세히 설명한다. 구체적으로, 우리는 mTBI의 중량 감소 모델을 수행하는 방법, 확산 상관 분광법이라고 불리는 비침습적 광학 기술을 사용하여 뇌 혈류를 종방향으로 측정하는 방법, 그리고 미세아교세포 및 기타 신경 면역 세포의 활성에 반응하고 조절하는 사이토카인 및 면역조절 포스포 단백질(예를 들어, MAPK 및 NFκB 경로 내)을 정량화하기 위해 뇌 조직 샘플에 대해 루미넥스 다중화 면역검정을 수행하는 방법을 설명한다. 마지막으로 다변량 시스템 분석 접근 방식을 사용하여 이러한 데이터를 통합하여 이러한 모든 변수 간의 관계를 이해하는 방법을 자세히 설명합니다. 이러한 생리 변수와 분자 변수 간의 관계를 이해하면 궁극적으로 mTBI를 담당하는 메커니즘을 식별 할 수 있습니다.
서론
개요
경미한 외상성 뇌 손상 (mTBIs)은 ~ 1.6-3.8 백만 운동 선수에게 매년 영향을 미칩니다1. 뇌진탕 하 및 뇌진탕 부상을 포함한 이러한 부상은 일시적인 신체적, 정서적, 심리적 및인지 적 증상을 가진 환자를 떠날 수 있습니다2. 더욱이, "취약성의 창" 내에서 지속되는 반복적인 mTBI(rmTBI)는 단일 mTBI 단독의 효과보다 더 오래 지속되는 인지적 결과의 누적된 심각도 및 지속기간을 야기할 수 있고, 궁극적으로는 기능(4,5,6)의 영구적인 손실로 이어질 수 있다. 많은 환자들이 비교적 짧은 기간 (<1 주) 내에 회복되지만, 환자의 10-40 %는 > 1 개월 동안 mTBI의 더 오래 지속되는 효과를 겪으며 일부는 1 년까지 지속됩니다 3,7,8,9.<....
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프로토콜
모든 동물 절차는 Emory University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침을 준수합니다.
1. 가벼운 외상성 뇌 손상의 체중 감소 모델
- 중량 감소 설정을 준비합니다. 수직으로 정렬된 1m 가이드 튜브(내경 2.54cm)가 있는 평평한 표면에 바이스를 장착합니다(레벨을 사용하여 확인). 충격을 위해 54g 볼트(기본 본체 직경 0.95cm, 헤드 직경 2cm, 길이 10.2cm)를 사용합니다.
- 마우스를 간단히 마취하십시오. 마우스를 45초 동안 100% 산소 중의 4.5% 이소플루란으로 유도하였다. 발가락 꼬집음 반응의 부족으로 마취의 충분한 깊이를 확인하십시오.
- 부상을 유발하십시오.
- 마우스를 마취에서 빠르게 제거하고 마우스를 얇은 막 (11.2 cm x 21.3 cm 조직)의 중앙에 놓습니다.
- 양손을 사용하여 중앙에 있는 마우스와 함께 조직 타우트를 잡으십시오. 엄지 손가락 아래 마우스의 꼬리를 고정하십시오. 마우스 헤드를 가이드 튜브 아래에 놓습니다(그림 2). ....
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결과
이전에 수집된 데이터는 C57BL/6 마우스 8마리로 구성된 그룹이 매일11일에 한 번 간격을 두고 3개의 폐쇄머리 부상(그림 2)을 입은 이전 작업에서 가져온 것입니다. 이 연구에서, 뇌 혈류는 마지막 손상 후 4 시간 후에 확산 상관 분광법으로 측정되었다 (그림 3, 그림 4). 손상 후 CBF 평가 후, 동물을 안락사시키고, 면역검정을 통해 사이토카인 및 포스포 단백질의 정량화를 위해 뇌 조직을 추출하였다(도 5). 우리는 또한 웨스턴 블롯을 통해 식세포 / 미세 아교세포 활성화 마커 Iba1을 정량화했습니다 (11에 설명 된 방법). 각 마우스로부터의 뇌 조직을 용해시키고, 총 단백질 농도를 BCA 검정을 사용하여 측정하였다........
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토론
여기에서 우리는 반복적 인 경미한 외상성 뇌 손상에 대한 혈역학 및 신경 염증 반응의 평가를위한 방법을 자세히 설명합니다. 또한 부분 최소 제곱 회귀를 사용하여 이러한 데이터를 다변량 시스템 분석의 일부로 통합하는 방법을 보여 주었습니다. 아래 텍스트에서 우리는 프로토콜과 관련된 몇 가지 주요 단계 및 제한 사항뿐만 아니라 기존 방법에 비해 방법의 장점 / 단점에 대해 논의 할 것입니다.
가벼운 외상성 뇌 손상의 체중 감소 모델. 외상성 뇌 손상 유도의 이러한 방법은 스포츠 관련 두부 부상10,19에서 흔히 볼 수 있는 빠른 전후부 회전 가속에 뒤따르는 둔한 충격을 특징으로 한다는 점에서 유리하다. 확실히, lissencephalic 마우스 뇌는 gyrocephalic 인간 두뇌의 복잡성을 완전히 회복하지 못합니다. 그럼에도 불구하고,이 모델은 .......
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감사의 글
이 프로젝트는 National Institutes of Health R21 NS104801 (EMB) 및 R01 NS115994 (LBW / EB) 및 애틀랜타 주니어 교수진 집중 상 (EMB)의 어린이 건강 관리가 지원했습니다. 이 작업은 또한 미국 국방부가 상 번호 (Award No)에 따라 의회 감독 의료 연구 프로그램을 통해 지원했습니다. W81XWH-18-1-0669 (LBW / EMB). 의견, 해석, 결론 및 권고는 저자의 의견이며 반드시 국방부에서 보증하는 것은 아닙니다. 이 자료는 보조금 번호 1937971에 따라 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십 프로그램에서 지원하는 작업을 기반으로합니다. 이 자료에 표현 된 의견, 결과 및 결론 또는 권장 사항은 저자의 의견이며 반드시 국립 과학 재단의 견해를 반영하지는 않습니다.
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재료
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참고문헌
- Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview. Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).
- Iraji, A., et al.
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재인쇄 및 허가
