이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

단일 핵 RNA-seq 및 ATAC-seq를 위한 신선한 냉동 뇌 종양에서 핵 절연

12.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/61542

⸱

2020년 8월 25일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neurology Clinic and National Center for Tumor Diseases, University Hospital Heidelberg, 2Bioinformatics and Omics Data Analytics, German Cancer Research Center (DKFZ), 3Clinical Cooperation Unit Neurooncology, German Cancer Research Center (DKFZ), 4Division of Experimental Neurosurgery, Department of Neurosurgery, University of Heidelberg, INF 400, Heidelberg, Germany

이 논문에서

요약

종양 내 이질성은 진모를 포함한 종양의 내재된 특징입니다. 우리는 단일 핵 RNA 및 ATAC 염기서열 분석 연구를 위한 신선한 동결 신경교종 조직에서 단 하나 핵을 격리하기 위하여 완충과 그라데이션 원심분리의 조합을 이용하는 간단하고 효율적인 프로토콜을 개발했습니다.

초록

성인용 확산 글리오마는 종양 내 이질성을 나타낸다. 최근까지, 대규모 분자 프로파일링 노력의 대부분은 뇌종양의 분자 분류로 이어진 대량 접근에 초점을 맞추고있다. 지난 5 년 동안, 단세포 염기서열 분석 접근은 gliomas의 몇몇 중요한 특징을 강조했습니다. 이러한 연구의 대부분은 유동 세포측정또는 항체 기반 분리 방법을 사용하여 단일 세포를 격리하기 위해 신선한 뇌종양 표본을 활용하였다. 앞으로 바이오뱅크의 신선하게 냉동 된 조직 샘플을 사용하면 단일 세포 응용 분야에 더 큰 유연성을 제공 할 것입니다. 더욱이, 단세포 필드가 발전함에 따라, 다음 과제는 종양 복잡성을 더 잘 해명하기 위해 단일 세포 또는 동일한 샘플 제제로부터 다중 omics 데이터를 생성하는 것입니다. 따라서, 고처리량 시퀀싱(snATAC-seq)을 가진 트랜스포사제-접근 크롬틴을 위한 단일 핵 RNA 시퀀싱(snRNA-seq) 및 단일 핵 분석과 같은 다양한 방법에 대한 데이터 생성을 허용하는 간단하고 유연한 프로토콜이 이 분야에 중요할 것이다.

10x 유전체학 플랫폼과 같은 접근 가능한 미세 유체 계측기와 결합된 단세포 분야의 최근 발전은 실험실에서 단일 세포 응용을 용이하게 했다. 뇌종양 이질성을 연구하기 위해, 우리는 신선한 냉동 진모에서 단 하나 핵의 격리를 위한 향상된 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 기존 단일 셀 프로토콜을 병합하고 여과 및 버퍼 매개 그라데이션 원심분리가 뒤따르는 균질화 단계를 결합합니다. 결과 샘플은 동일한 핵 제제로부터 단일 핵 유전자 발현 및 크로마티닌 접근성 데이터를 생성하는 데 사용할 수 있는 순수한 단일 핵 현탁액이다.

서론

성인에서 가장 흔한 1 차 뇌종양인 확산 저학년 진모(LGG)는 종종 대뇌 반구에서 발생하는 침을 일으키는 신생물입니다. LGGs는 종양 집단뿐만 아니라 종양 발달 및 진행1,2,3,4,5에복잡하게 관여하는 비악성 세포에 의해 구동되는 종양 내 이질성 및 종양 내 이질성을 모두 나타낸다.

지난 10 년 동안, gliomas의 필드에 수집 된 게놈 데이터의 눈사태가 있었다. 이들 데이터는 주로 벌크 종양 시퀀싱 연구에서 비롯되며 분자 특성화, 그리고 뇌종양의 현재분류5,6,7,8,9,10,11에 대단히기여하였다. 그러나, 비록 이러한 연구는 gliomas와 관련 된 광범위 한 분자 풍경을 공개, 치료 개입에 관한 진행의 실망 스러운 부족 여전히 있다. 뇌종양의 치료 내성에 대한 장애물 중 하나는 종양 내 이질성입니다. 이 문제를 해결하기 위해, 다양한 연구는 단일 세포 수준12,13,14,15,16,17에서종양 내에 존재하는 게놈, 전사, 프로테오믹및후생유전학 이질성에 초점을 맞추고 있다.

지난 몇 년 동안 단일 세포 분야에서 놀라운 기술 발전이 있었지만, 주요 제한 요인 중 하나는 세포를 분리하고 이러한 실험을 수행하는 데 필요한 신선한 표본의 가용성입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 세포18,19가아닌 핵을 사용하여 냉동 조직에서 snRNA-seq 및 snATAC-seq와 같은 분석을 수행하는 데 몇 가지 성공적인 시도가 있었다. 이러한 방법의 대부분은 형광 활성화 세포 정렬 (FACS) 또는 여과 전략에 의존. 단일 세포와 단일 핵 접근법 모두 강점과 단점이 있습니다. 단세포 접근은 미토콘드리아 성적증명서를 유지하며, 이는 유익할지라도 높은 풍부성으로 인한 전사적 적용범위를 감소시킬 수 있다. 단일 핵 절연 접근법은 미토콘드리아 분획의 높은 비율을 제거하여 핵전사체(20)의보다 심층적인 커버리지를 허용한다.

RNA-seq 및 ATAC-seq를 포함하여 단세포 유전체학 데이터를 분석하기 위하여 최근에 이용된 각종 상업적으로 이용가능한 플랫폼이 있습니다. 가장 눈에 띄는 플랫폼 중 하나는 단일 세포 유전자 발현 및 단일 세포 ATAC 프로파일링을 위한 10x 유전체학 크롬 플랫폼입니다. 플랫폼이 미세 유체 챔버의 도움으로 작동함에 따라 모든 파편이나 골재는 데이터, 시약 및 귀중한 임상 샘플의 손실로 이어지는 시스템을 막을 수 있습니다. 따라서 단일 세포 연구의 성공은 주로 단일 세포/핵의 정확한 격리에 달려 있습니다.

본 명세서에서 입증할 프로토콜은 DroNc-seq 및 Omni-ATAC-seq 프로토콜의 약간 변형된 조합이며, 인간 뇌18,19,21,22,23,24에서신경 장애 및 신경 세포 유형을 이해하기 위해 snRNA-seq를 활용하는 최근 연구에 유사한접근법을활용한다. 이 프로토콜은 동결된 시료의 효소/기계적 해리의 조합을 사용하여 여과 및 그라데이션 원심분리를 거쳐 신선한 냉동 신경교종 조직에서 단일 핵을 빠르고 정확하게 분리할 수 있게 합니다. 우리는 성공적으로 뇌종양 견본에서 동일 핵 준비에서 snRNA-seq 및 snATAC-seq 데이터를 생성하기 위하여 이 프로토콜을 이용했습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

신선한 냉동 신경교종 샘플은 독일 하이델베르크에 있는 종양 질병 (NCT) 조직 은행에서 국가 종양 질병 센터 (NCT)에서 얻어졌습니다. 환자 자료의 사용은 하이델베르크의 의학 학부에서 기관 검토 위원회에 의해 승인되었으며, 연구 결과에 포함 된 모든 환자로부터 통보 된 동의를 얻었다.

1. 실험 준비

  1. 얼음 또는 4 °C에서 모든 단계를 수행합니다.
  2. 사전 냉각 튜브, 접시, 면도날, 두드리거 및 유봉을 4 °C로 합니다.
  3. 모든 버퍼를 미리 준비합니다. 이러한 버퍼는 실온에서 안정적입니다. 멸균 여과는 특히 자당에 권장됩니다. 주식 준비는 Corces 외19에서수정됩니다. 표 1-7을참조하십시오.
  4. 액체 질소 또는 -80°C 냉동고 저장에서 샘플을 제거하고 2.1 단계까지 드라이 아이스를 유지합니다.

2. 조직 해부 및 해조

  1. 신선한 냉동 조직 샘플 (10-60 mg)을 미리 차가운 페트리 접시로 옮춥니다. 신선한 냉동 조직을 면도날로 얼음 위에 작은 조각으로 잘라냅니다.
  2. 냉각된 핵 용해 버퍼 500μL을 사전 냉각된 1.5mL 튜브에 추가합니다. 핵 리시스 완충제가 함유된 1.5mL 튜브에 조직 조각을 놓고, Douncer(재료의표)로이송한다.
    참고: 초기 시료 감소를 위한 "느슨한" 또는 "A" 유봉과 완전한 시료 균질화를 위한 "타이트" 또는 "B" 유봉의 두 가지 두 가지 다이온스 균질화 유봉이 있습니다.
  3. 마찰이 감소 될 때까지 약 20 스트로크에 대한 "느슨한"유봉으로 조직 조각을 두드리고. 파편이 존재하는 경우, 샘플은 100mm 여과로 여과에 의해 미리 지워질 수 있습니다.
  4. 완전한 조직 균질화를 달성하기 위해 20 스트로크에 대한 "꽉"유봉으로 두드리고.
  5. 호모전(약 500 μL)을 미리 냉각된 2mL 튜브로 옮긴다. 차가운 리시스 버퍼 1mL를 추가합니다. 부드럽게 섞어서 얼음에 5분간 배양합니다. 넓은 보어 파이펫 팁과 부드럽게 섞고 인큐베이션 중에 1-2회 반복합니다.
  6. 30 μm 스트레이너 메쉬를 사용하여 전체 호모게네이트를 필터링하고 15mL 팔콘 튜브로 수집하고 새로운 미리 냉각된 2mL 튜브로 다시 이송합니다. 단일 여과기는 일반적으로 전체 동형에 충분합니다.
  7. 경현미경아래에서 큰 파편의 제거와 핵멤브레인의 손상성을 확인하십시오. 핵은 둥글게 될 필요가 있고 핵막은 왜곡되어서는 안됩니다. 파편이 존재하는 경우 핵을 다시 여과할 수 있습니다.
  8. 벤치 상단 원심분리기의 4°C에서 5분 동안 500 x g의 핵원심분리기. 핵을 함유한 펠릿으로 ~50 μL을 남기고 상체를 제거합니다. 다른 1mL의 핵 용해 완충제에서 펠릿을 부드럽게 재중단하고 얼음에서 5 분 동안 배양합니다.
  9. 4°C에서 5분 동안 500 x g의 핵 원심분리기. 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거하고, 1x 균질화 버퍼(HB)의 500mL(600mL)를 추가하고, 재차질 없이 5분 동안 배양한다. 이어서, 1x HB의 또 다른 1.0 mL에서 핵을 다시 중단한다.
  10. 4°C에서 5분 동안 500 x g의 핵 원심분리기. 상체를 제거하고 새로운 2.0 mL 튜브로 1x HB의 200 μL에서 핵을 부드럽게 다시 분리합니다.

3. 그라데이션 원심분리

  1. 50% 이디엑스산올 용액(표5)의200 μL을 추가하여 최종 농도를 25% 이오디산올을 제공합니다. 300mL에 세팅된 파이펫과 10번 잘 섞으세요.
  2. 25% 혼합물 아래에 29% 이오디산올 용액(표6)의300 μL을 추가합니다. 층의 혼합물을 피하기 위해 P1000 미세 팁을 사용합니다.
  3. 29% 혼합물 아래에 35% 이오디산올 용액(표7)의300 μl을 추가합니다. 층의 혼합물을 피하기 위해 P1000 미세 팁을 사용합니다.
    주의: 이 단계는 과도한 볼륨 변위를 방지하기 위해 파이펫 팅 중에 파이펫 팁을 점진적으로 제거해야 합니다.
  4. 시료를 스윙 버킷 원심분리기에 놓고 브레이크를 끄고 4°C에서 3,500x g에서 20분 동안 회전합니다.
  5. 흔들리지 않고 샘플을 부드럽게 제거하고 빛 아래에서 관찰하십시오. 95% 순수 핵의 명확한 백색 대역은 두 번째와 제 3 층 사이에 표시되어야한다(도 1).

4. 핵 분리

  1. 29%-35%의 중간 단계에서 백색 핵 밴드까지 상부 층을 흡인한다.
  2. 200mL 부피로 핵 밴드를 수집하고, 20 μm필터(재료 표)로신선한 튜브및 필터로 옮김한다.
    참고: 핵은 여과 전에 재중단될 필요가 없습니다.
  3. 경현미경아래에서 큰 파편의 제거와 핵멤브레인의 손상성을 확인하십시오. 핵은 둥글게 될 필요가 있고 핵막은 왜곡되어서는 안됩니다.
  4. snRNA-seq/snATAC-seq를 위한 혈류계 및 알리쿼트 핵에 Trypan 블루 염색을 사용하여 핵을 계산합니다.

5. 단일 핵 RNA 및 ATAC 세크

  1. 단일 세포 유전자 발현 및 단일 세포 ATAC 시약키트(재료표)를사용하여 핵을 즉시 처리한다.
    참고: 10x 유전체학 계통에 대한 핵 샘플 농도는 snRNA-seq에 대한 μL당 1500-3000 핵, 및 snATAC-seq를 위한 m μL당 3500-7000 핵이다. 핵은 1x PBS를 사용하여 희석될 수 있다.
  2. 유전체학 코어 시설에서 생성된 라이브러리를 시퀀스합니다.
  3. 데이터의 품질 관리 분석을 수행합니다. 핵은 독특한 분자 식별자 (UMI) >1000, 유전자의 수 >500 및 미토콘드리아 유전자의 퍼센트 <5%,를 포함하는 경우에 추가 분석을 위해 포함되며, UMIs 및 유전자의 평균 + 3개의 표준 편차 내에 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

단일 핵 유전체학은 제한된 데이터와 프로토콜을 가진 진화하는 분야입니다. 단일 핵 작용의 결과에 영향을 미치는 중요한 요소는 순수하고 그대로 핵의 분리입니다. 우리는 두 개의 출판 된 프로토콜을 결합 (DroNc-seq 및 Omni-ATAC-seq 프로토콜) 상대적으로 짧은 시간에 신선한 냉동 신경 교종 조직 블록에서 고품질및 순수 핵을 분리하여 성적 증명서의 안정성을 유지(도 1).

iodixanol/자당 그라데이션을 사용하여 그라데이션 원심분리와 함께 다양한 여과 단계를 사용하면 대부분의 파편이 폐기된 순수 핵의 분리를 허용한다(도2). 동일한 분리된 핵 제제는 snRNA-seq 및 snATAC-seq 모두에 사용될 수 있다. 중요한 것은, 사용된 핵은 동일한 샘플로부터 발생하기 때문에, 생성된 데이터는 소집단을 생성하고 다중 오믹스원근(...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

종양 내 이질성 분야는 흥미로운 단계에 있으며, 기존의 지식에 도전하고 확장하기 위해 새로운 에세이와 플랫폼이 개발되고 있습니다. 종양 내 이질성은진모(28)의현재 치료 양식에 대한 질병 진행 및 저항에 기여하는 중요한 요소입니다. 뇌종양에대한 최근 연구는 동일한 종양29,30,31, 32내의 세포 이질성을 더 잘 특성화하기 위해 단일 세포 전사 및 에피소드 성 소방법을 사용하여 이 중요한 측면에 초점을 맞추고있다. 뇌종양및 기타 고형종양의 단일 세포 검정술과 현재 병목 현상 중 하나는 신선한 임상 표본의 가용성입니다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 다양한 연구는 신선한 냉동 조직에서 핵을 사용하는 것이 신선한 표본에 대한 대안이 될 수 있으며 세포

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

독일 암 센터(DKFZ)의 단일 세포 오픈 랩(scOpenLab)에 유용한 토론을 해 주셔서 감사합니다. 이 연구는 독일 암 원조에 의해 지원 되었다, 맥스 에데르 프로그램 보조금 수 70111964 (S.T.).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-메르캅토에탄올시그마M6250
CaCl2Sigma21115-100ML
Dounce HomogenizerActive motif40401
EDTA (0.5 M)Thermo ScientificR1021
Falcon 15 mL 원추형 원심분리기 튜브Fisher Scientific352096
요오딕산올(일명 Optiprep)줄기세포 기술07820
MACs 스마트 스트레이너(30 &마이크로; m)Miltenyi Biotec130-098-458
MACS 스마트 스트레이너 (100 µ m)Miltenyi Biotec130-098-463
Mg(Ac)2Sigma63052-100ML
NP-40Abcamab142227
핵 분리 키트: Nuclei EZ PrepSigma NUC101-1KT
페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF)SigmaP7626
사전 분리 필터(20 &마이크로; m)Miltenyi Biotec130-101-812
안전 잠금 튜브 1.5 mLEppendorf0030120086
안전 잠금 튜브 2.0 mLEppendorf0030120094
단일 세포 ATAC10x Genomics
단일 세포 유전자 발현10x Genomics
SucroseSigmaS0389
광폭 피펫 팁(1000 µ L)Themo Fisher Scientific2079GPK
광구경 피펫 팁(200 &마이크로; L)테모 피셔 사이언티픽2069GPK

참고문헌

  1. Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma. Nature Reviews Cancer. 10 (5), 319-331 (2010).
  2. Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
  3. Filbin, M. G., Suva, M. L. Gliomas Genomics and Epigenomics: Arriving at the Start and Knowing It for the First Time. Annual Review of Pathology. 11, 497-521 (2016).
  4. Ferris, S. P., Hofmann, J. W., Solomon, D. A., Perry, A. Characterization of gliomas: from morphology to molecules. Virchows Archive. 471 (2), 257-269 (2017).
  5. Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
  6. Eckel-Passow, J. E., et al. Glioma Groups Based on 1p/19q, IDH, and TERT Promoter Mutations in Tumors. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2499-2508 (2015).
  7. Suzuki, H., et al. Mutational landscape and clonal architecture in grade II and III gliomas. Nature Genetics. 47 (5), 458-468 (2015).
  8. Cancer Genome Atlas Research. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
  9. Noushmehr, H., et al. Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma. Cancer Cell. 17 (5), 510-522 (2010).
  10. Yan, H., et al. IDH1 and IDH2 mutations in gliomas. The New England Journal of Medicine. 360 (8), 765-773 (2009).
  11. Yan, H., Bigner, D. D., Velculescu, V., Parsons, D. W. Mutant metabolic enzymes are at the origin of gliomas. Cancer Research. 69 (24), 9157-9159 (2009).
  12. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).
  13. Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
  14. Wu, M., Singh, A. K. Microfluidic Flow Cytometry for Single-Cell Protein Analysis. Methods in Molecular Biology. 1346, 69-83 (2015).
  15. Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: techniques and emerging applications. Nature Reviews Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
  16. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
  17. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
  18. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  19. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  20. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
  21. Mathys, H., et al. Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer's disease. Nature. 570 (7761), 332-337 (2019).
  22. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
  23. Al-Dalahmah, O., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies Huntington disease astrocyte states. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 19(2020).
  24. Jakel, S., et al. Altered human oligodendrocyte heterogeneity in multiple sclerosis. Nature. 566 (7745), 543-547 (2019).
  25. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. , (2018).
  26. Lake, B. B., et al. Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain. Nature Biotechnology. 36 (1), 70-80 (2018).
  27. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  28. Bready, D., Placantonakis, D. G. Molecular Pathogenesis of Low-Grade Glioma. Neurosurgery Clinics of North America. 30 (1), 17-25 (2019).
  29. Venteicher, A. S., et al. Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq. Science. 355 (6332), (2017).
  30. Tirosh, I., et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).
  31. Weng, Q., et al. Single-Cell Transcriptomics Uncovers Glial Progenitor Diversity and Cell Fate Determinants during Development and Gliomagenesis. Cell Stem Cell. 24 (5), 707-723 (2019).
  32. Neftel, C., et al. An Integrative Model of Cellular States, Plasticity, and Genetics for Glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
  33. Al-Ali, R., et al. Single-nucleus chromatin accessibility reveals intratumoral epigenetic heterogeneity in IDH1 mutant gliomas. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 201(2019).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

신선 동결 조직단일 핵 ATAC-seq밀도 구배 원심분리아이오딕사놀 용액핵 용해 버퍼여과 단계혈구계수기 측정트립판 블루 염색
단일 핵 RNA-seq 및 ATAC-seq를 위한 신선한 냉동 뇌 종양에서 핵 절연
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.