종양 내 이질성은 진모를 포함한 종양의 내재된 특징입니다. 우리는 단일 핵 RNA 및 ATAC 염기서열 분석 연구를 위한 신선한 동결 신경교종 조직에서 단 하나 핵을 격리하기 위하여 완충과 그라데이션 원심분리의 조합을 이용하는 간단하고 효율적인 프로토콜을 개발했습니다.
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이 논문에서
요약
초록
성인용 확산 글리오마는 종양 내 이질성을 나타낸다. 최근까지, 대규모 분자 프로파일링 노력의 대부분은 뇌종양의 분자 분류로 이어진 대량 접근에 초점을 맞추고있다. 지난 5 년 동안, 단세포 염기서열 분석 접근은 gliomas의 몇몇 중요한 특징을 강조했습니다. 이러한 연구의 대부분은 유동 세포측정또는 항체 기반 분리 방법을 사용하여 단일 세포를 격리하기 위해 신선한 뇌종양 표본을 활용하였다. 앞으로 바이오뱅크의 신선하게 냉동 된 조직 샘플을 사용하면 단일 세포 응용 분야에 더 큰 유연성을 제공 할 것입니다. 더욱이, 단세포 필드가 발전함에 따라, 다음 과제는 종양 복잡성을 더 잘 해명하기 위해 단일 세포 또는 동일한 샘플 제제로부터 다중 omics 데이터를 생성하는 것입니다. 따라서, 고처리량 시퀀싱(snATAC-seq)을 가진 트랜스포사제-접근 크롬틴을 위한 단일 핵 RNA 시퀀싱(snRNA-seq) 및 단일 핵 분석과 같은 다양한 방법에 대한 데이터 생성을 허용하는 간단하고 유연한 프로토콜이 이 분야에 중요할 것이다.
10x 유전체학 플랫폼과 같은 접근 가능한 미세 유체 계측기와 결합된 단세포 분야의 최근 발전은 실험실에서 단일 세포 응용을 용이하게 했다. 뇌종양 이질성을 연구하기 위해, 우리는 신선한 냉동 진모에서 단 하나 핵의 격리를 위한 향상된 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 기존 단일 셀 프로토콜을 병합하고 여과 및 버퍼 매개 그라데이션 원심분리가 뒤따르는 균질화 단계를 결합합니다. 결과 샘플은 동일한 핵 제제로부터 단일 핵 유전자 발현 및 크로마티닌 접근성 데이터를 생성하는 데 사용할 수 있는 순수한 단일 핵 현탁액이다.
서론
성인에서 가장 흔한 1 차 뇌종양인 확산 저학년 진모(LGG)는 종종 대뇌 반구에서 발생하는 침을 일으키는 신생물입니다. LGGs는 종양 집단뿐만 아니라 종양 발달 및 진행1,2,3,4,5에복잡하게 관여하는 비악성 세포에 의해 구동되는 종양 내 이질성 및 종양 내 이질성을 모두 나타낸다.
지난 10 년 동안, gliomas의 필드에 수집 된 게놈 데이터의 눈사태가 있었다. 이들 데이터는 주로 벌크 종양 시퀀싱 연구에서 비롯되며 분자 특성화, 그리고 뇌종양의 현재분류5,6,7,8,9,10,
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프로토콜
신선한 냉동 신경교종 샘플은 독일 하이델베르크에 있는 종양 질병 (NCT) 조직 은행에서 국가 종양 질병 센터 (NCT)에서 얻어졌습니다. 환자 자료의 사용은 하이델베르크의 의학 학부에서 기관 검토 위원회에 의해 승인되었으며, 연구 결과에 포함 된 모든 환자로부터 통보 된 동의를 얻었다.
1. 실험 준비
- 얼음 또는 4 °C에서 모든 단계를 수행합니다.
- 사전 냉각 튜브, 접시, 면도날, 두드리거 및 유봉을 4 °C로 합니다.
- 모든 버퍼를 미리 준비합니다. 이러한 버퍼는 실온에서 안정적입니다. 멸균 여과는 특히 자당에 권장됩니다. 주식 준비는 Corces 외19에서수정됩니다. 표 1-7을참조하십시오.
- 액체 질소 또는 -80°C 냉동고 저장에서 샘플을 제거하고 2.1 단계까지 드라이 아이스를 유지합니다.
2. 조직 해부 및 해조
- 신선한 냉동 조직 샘플 (10-60 mg)을 미리 차가운 페트리 접시로 옮춥니다. 신선한 냉동 조직을 면도날로 얼음 위에 작은 조각으로 잘라냅니다.
- 냉각된 핵 용해 버퍼 500μL을 사....
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결과
단일 핵 유전체학은 제한된 데이터와 프로토콜을 가진 진화하는 분야입니다. 단일 핵 작용의 결과에 영향을 미치는 중요한 요소는 순수하고 그대로 핵의 분리입니다. 우리는 두 개의 출판 된 프로토콜을 결합 (DroNc-seq 및 Omni-ATAC-seq 프로토콜) 상대적으로 짧은 시간에 신선한 냉동 신경 교종 조직 블록에서 고품질및 순수 핵을 분리하여 성적 증명서의 안정성을 유지(도 1).
iodixanol/자당 그라데이션을 사용하여 그라데이션 원심분리와 함께 다양한 여과 단계를 사용하면 대부분의 파편이 폐기된 순수 핵의 분리를 허용한다(도2). 동일한 분리된 핵 제제는 snRNA-seq 및 snATAC-seq 모두에 사용될 수 있다. 중요한 것은, 사용된 핵은 동일한 샘플로부터 발생하기 때문에, 생성된 데이터는 소집단을 생성하고 다중 오믹스원근(.......
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토론
종양 내 이질성 분야는 흥미로운 단계에 있으며, 기존의 지식에 도전하고 확장하기 위해 새로운 에세이와 플랫폼이 개발되고 있습니다. 종양 내 이질성은진모(28)의현재 치료 양식에 대한 질병 진행 및 저항에 기여하는 중요한 요소입니다. 뇌종양에대한 최근 연구는 동일한 종양29,30,31, 32내의 세포 이질성을 더 잘 특성화하기 위해 단일 세포 전사 및 에피소드 성 소방법을 사용하여 이 중요한 측면에 초점을 맞추고있다. 뇌종양및 기타 고형종양의 단일 세포 검정술과 현재 병목 현상 중 하나는 신선한 임상 표본의 가용성입니다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 다양한 연구는 신선한 냉동 조직에서 핵을 사용하는 것이 신선한 표본에 대한 대안이 될 수 있으며 세포
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
독일 암 센터(DKFZ)의 단일 세포 오픈 랩(scOpenLab)에 유용한 토론을 해 주셔서 감사합니다. 이 연구는 독일 암 원조에 의해 지원 되었다, 맥스 에데르 프로그램 보조금 수 70111964 (S.T.).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2-메르캅토에탄올 | 시그마 | M6250 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-100ML | |
| Dounce Homogenizer | Active motif | 40401 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Scientific | R1021 | |
| Falcon 15 mL 원추형 원심분리기 튜브 | Fisher Scientific | 352096 | |
| 요오딕산올(일명 Optiprep) | 줄기세포 기술 | 07820 | |
| MACs 스마트 스트레이너(30 &마이크로; m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS 스마트 스트레이너 (100 µ m) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Mg(Ac)2 | Sigma | 63052-100ML | |
| NP-40 | Abcam | ab142227 | |
| 핵 분리 키트: Nuclei EZ Prep | Sigma NUC101-1KT | ||
| 페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF) | Sigma | P7626 | |
| 사전 분리 필터(20 &마이크로; m) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
| 안전 잠금 튜브 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 안전 잠금 튜브 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| 단일 세포 ATAC | 10x Genomics | ||
| 단일 세포 유전자 발현 | 10x Genomics | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| 광폭 피펫 팁(1000 µ L) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
| 광구경 피펫 팁(200 &마이크로; L) | 테모 피셔 사이언티픽 | 2069GPK |
참고문헌
- Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma. Nature Reviews Cancer. 10 (5), 319-331 (2010).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell
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재인쇄 및 허가
