방법 논문

뮤린 모델에서 허혈혈 재관류 부상 후 줄기 세포의 지연 된 자궁 내 납품

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DOI:

10.3791/61546

⸱

2020년 9월 3일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Medicine, Mayo Clinic, 2Department of Radiology and Molecular Imaging Program at Stanford (MIPS), Stanford University School of Medicine

이 논문에서

요약

줄기 세포는 심근 손상을 가진 개별을 위한 잠재적인 처리로 지속적으로 조사됩니다, 그러나, 부상당한 조직 내의 그들의 감소된 생존및 보존은 그들의 장기 효험에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 원고에서 우리는 허혈 재관전 손상의 뮤린 모델에서 줄기 세포 전달을위한 대체 방법을 설명합니다.

초록

심근 손상을 입은 개인의 심장 기능 회복을 위한 줄기 세포(SC)의 사용에 상당한 관심이 있습니다. 가장 일반적으로, 심장 줄기 세포 치료는 심근 상해의 유도와 동시에 SC를 전달하여 공부됩니다. 그러나, 이 접근은 2개의 중요한 한계를 제시합니다: 초기 적대적인 선동적인 허혈성 환경은 이식한 SC의 생존에 영향을 미칠 수 있고, SC가 사용될 가능성이 있는 아급성 경색 시나리오를 나타내지 않습니다. 여기에서 우리는 허혈 재관성 상해의 유도 및 중간엽 줄기 세포 (MSC)의 납품을 위한 외과 절차의 2 부분으로 시리즈를 기술합니다. 줄기 세포 투여의 이 방법은 초기 면역 반응을 우회하여 손상된 조직 주위의 더 긴 생존력과 보존을 허용할 수 있다. 허혈성 재관류 손상의 모델은 중간엽 줄기 세포 (3.0 x 105)의전달을 동반한 마우스에서 유도되었으며, 균등하게 발현 된 CMV 프로모터, intramyocardily 7 일 후 기자 유전자 반딧불 루시포라제를 표현하였다. 동물은 각각 세포의 상해 그리고 주입의 확인을 위한 초음파 및 생물 발광 화상 진찰을 통해 심상화되었습니다. 중요한 것은 SC 납품을 위한 이 2절차 접근방식을 수행할 때 추가합병증 비율이 없었습니다. 이러한 줄기세포 투여 방법은, 일체적으로 최첨단 리포터 유전자의 활용과 함께, 임상적으로 일반적으로 본 만성 허혈의 상황에서 이식된 SC의 생존력 및 유지에 대한 생체 내 연구를 허용하면서도 초기 프로 염증 반응을 우회할 수 있다. 요약하자면, 우리는 손상된 조직의 재생을 촉진하는 잠재적인 새로운 접근법으로 사용될 수 있는 심근으로 줄기 세포의 지연된 전달을 위한 프로토콜을 설치했습니다.

서론

심혈관 질환은 전 세계적으로 사망률과 사망률의 가장 흔한 원인으로 남아 있습니다. 심장 허혈성 사건은 심근 및 주변 세포1의전반적인 기능에 해로운 것으로 밝혀졌다. 심근세포의 ̴0.45-1.0%만이 심근 손상이 발생한 후 매년 재생됩니다2. 증가하는 수요와 치료 개발에 내재된 초점에도 불구하고, 부상당한 조직의 재생을 돕는 치료는 확립하기 어려웠으며 여전히추가최적화3,44,5를필요로합니다. 줄기 세포 치료는 허혈성 사건 후 손상된 조직을 젊어지게하는 대체 경로로 도입되었습니다. 그러나, 이들 치료법의 발전은 세포의 제한된 생존 및 유지에 의해66.

허혈성 사건 후 심장의 미세 환경은 저산소, 프로 산화제 및 프로 염증으로 특징 지어질 수 있으며, 생존에 적응하기 위해 치료 줄기 세포에 대한 적대적인 조건을제시7,,8. 면역 반응이 부상 후, 순진한 림프구, 대식세포, 호중구 및 유방 세포가 죽어가는 세포를 제거하고 조직 리모델링 을 위한 과정을 조절하여9손상을 복구하려고 시도함에 따라9,10,,11. 처음 3 일 이내에 허혈 후, 염증은 지역에서 호중구와 단핵구의 높은 숫자와 프로 염증 사이토 카인의 방출과 함께 절정에10,,12. 7일 후, 염증의 상당 부분은 가라앉고 회복세포로의 전환이 시작되어 리모델링 캐스케이드가 완료될 때까지 계속,마우스(13)에서는약 14일이 된다. 우리의 외과 방법은 허혈 재관류 손상 후 피크 타고난 면역 반응을 우회하기 위해 심근에 생물학적 제제를 도입하는 잠재적 인 대체 접근법입니다. 동시에 급성 심근 경색에 비해 고려해야 할 다른 변수가있을 수 있는 아급성 /만성 허혈 의 조건에서 모든 치료법의 연구를 허용할 것입니다.

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프로토콜

실험은 여성 C57BL/6 마우스, 나이 10-12 주 및 20-25 g 체중에 수행되었다. 모든 동물 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 명시된 기준을 준수 (실험실 동물 자원 연구소, 국립 과학 아카데미, 베데스다, MD, 미국) 및 의학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 메이요 클리닉 대학 (IACUC)에 의해 승인되었다.

1. 준비 및 삽관

  1. 수술 전에 모든 수술 기구를 자동 클로브하십시오. 한 세션에서 여러 번의 수술을 수행하려면 각 동물 후 악기를 청소하고 뜨거운 비드 멸균기를 사용하여 다시 멸균하십시오.
  2. 유도 챔버에서 1 L/min O2에서 3.5-4%의 이소플루란으로 마우스를 마취시합니다.
  3. Buprenorphine SR 1 mg/kg (진통제)를 피하, 동물의 무게, 인공 호흡기에 무게를 입력.
  4. 흉골에서 어깨 수준으로 가슴의 왼쪽을 면도하고 여분의 모피를 제거하기 위해 탈모 크림을 바르습니다.
  5. 허혈 재관류 절차의 경우 2cmH2O에서 인공호흡기에 양성 말기만기 압력(PEEP)을 유지한다. 세포 시술의 지연된 주입을 위해 폐 붕괴를 방지하기 위해 PEEP를 3cmH2O로 변경한다.
  6. 20G 내트라큐리 튜브를 사용하여 동물을 삽관하고, 35-37°C의 체온을 유지하기 위해 제어된 가열 패드로 이송한다.
  7. 마우스를 왼쪽에 두개골 끝이 있고 오른쪽에 는 카우달 끝이 있는 측면 의 실로 인공호흡기에 놓습니다.
  8. 마취를 2-2.5% 이소플루란에서 1 L/min O2에서 나머지 시술시술을 유지합니다.
  9. Scrub the surgical area alternating between povidone-iodine and alcohol swabs three times and apply ophthalmic ointment to both eyes.

2. 이혈혈 재관류 부상

  1. #10 블레이드 메스를 사용하면 시야에서 왼쪽 젖꼭지의 오른쪽까지 수직 절개 2.5mm를 만듭니다.
  2. 가위를 사용하여 늑간 근육과 갈비뼈가 보일 때까지 피상근육 층을 잘라냅니다.
  3. 갈비뼈와 주변 조직을 들어 올리는 동안, 4갈비뼈와 5갈비뼈 사이의 늑간 공간을 잘라낸 다음 눈꺼풀 리트랙터를 열린 공간에 삽입합니다.
  4. 구부러진 집게를 사용하여 회심을 철회하고 폐를 위쪽으로 움직이고 시야에서 벗어나게 합니다.
  5. LAD 동맥을 시각화하고, 9-0 나일론 봉합사를 사용하여, 동맥 아래 심근을 통과 2.5 mm 왼쪽 auricle에 실살하고 느슨한 사각형 매듭을 묶는다.
  6. 폴리에틸렌 튜브 1cm를 자르고 느슨한 매듭 안에 놓습니다.
  7. 튜브 주변의 봉합사를 고정하고 허혈을 확인한 다음 35 분 후에 놓습니다.
    참고: 창구와 심실 부정맥에 의한 허혈을 확인합니다.
  8. 결찰을 해제하고 튜브를 제거 한 후, 심근의 재관류를 확인하기 위해 5 분 기다립니다.
  9. 24 G I.V. 카테터 튜브를 흉부 구멍에 넣고 개구부 오른쪽에 늑간 공간 하나를 배치합니다.
  10. 간단한 중단 패턴에 6-0 흡수 봉합사로 늑간 절개를 닫습니다.
  11. 연속 봉합사 패턴으로 6-0 흡수 가능한 봉합사로 근육 층을 닫습니다.
  12. 피상적 근육 층을 닫은 후 흉부 튜브를 제거하고 1 mL 결핵 주사기를 사용하여 흉부 구멍에서 공기를 철회하십시오.
  13. 연속 수평 매트리스 패턴에 6-0 흡수 봉합사로 피부 절개를 닫습니다
    참고: 나일론 봉합사 및 불연속 봉합추 패턴은 피부 층에도 사용될 수 있다.
  14. 1.5mL의 따뜻한 식염수를 피하하고 감염을 예방하기 위해 절개 부위에 삼중 항생제 연고를 적용한다.
  15. 이소플루란을 끄고 동물이 100% O2의 인공호흡기를 통해 숨을 쉴 수 있도록 하여 도움 없이 지속적으로 호흡할 수 있습니다.
  16. 완전히 복구 될 때까지 35-37 °C의 온도와 따뜻한 패드에 덮여 침구 (종이 타월 또는 드레이프)와 침대가없는 케이지 또는 케이지로 마우스를 전송합니다.

3. 마우스 중간엽 줄기 세포 전달

참고: 절차에 사용되는 마우스의 균주는 근친선이며 유전적으로 동일한 것으로 간주됩니다. 중간엽 줄기 세포는 동일한 균주의 동물로부터 수득되었고, 프로토콜 설계에 의하면 면역 억제는 유도되지 않았다1.

  1. 첫 번째 절차에 대해 이전에 수행한 대로 준비 및 삽관 단계를 완료합니다.
  2. 가위와 집게를 사용하여 피부 층에서 봉합사를 제거합니다.
  3. #10 메스로 이전 수술과 동일한 위치에 절개를하십시오.
  4. 메스를 계속 사용하여 흉터 조직을 절단하여 근육 층 봉합사가 보일 때까지 계속
  5. 가위를 사용하여 봉합사를 제거하고 근육 층을 열어 잘라.
  6. 갈비뼈를 함께 들고 있는 봉합사를 시각화하고 제거하고 이전 절개에서 늑간 근육을 계속 절단합니다.
    참고 : 폐가 가슴 벽에 부착 되었을 수 있습니다., 이 발생 하는 경우, 무딘 또는 곡선 된 집게를 사용 하 여 신중 하 게 분리 하 고 그들을 해제.
  7. 눈꺼풀 리트랙터를 늑간 공간에 넣고 이전 리그레이션 영역을 찾습니다.
  8. 중간엽 줄기 세포(3.0 x105)를적재하고, 20 μL PBS에서 중단되어 30G 인슐린 주사기에 넣고, 적절한 각도를 주입하기 위해 필요에 따라 바늘을 약간 구부린다.
    참고: 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 4-6 주 된 C56BL/6 마우스의 지방 조직으로부터 분리되었다. 초기 통로 세포(p3)는 CMV 프로모터 의 산반딧불 루시파제 유전자를 발현하는 벡터로 변환되어 생체 내 세포 생존 가능성 모니터링을 허용하였다. Adipose 유래 마우스 MSC는 유동 세포측정을 특징으로 하고 세포는 CD44, CD29, CD90 및 CD105에 대해 양성이었지만 조혈 마커 CD4514에대해 부정적이었다. 주사 전에, MSC는 해동 과정에서 세포의 손실을 피하기 위해 적어도 하나의 통로를 위해 배양되었다.
  9. 심장의 밑쪽으로 정점방향으로 이동하는 것은 바늘 개구부가 완전히 심근 안쪽에 들어갈 때까지 주사기를 peri-infarct 부위로 삽입한다.
  10. 일단 안쪽에 천천히 심근에 세포를 주입하고, 3 s를 기다린 다음 바늘을 제거하십시오.
  11. 심실 세동과 같은 세포에 대한 비정상적인 반응이 없는지 확인하기 위해 3 분 동안 심장을 면밀히 관찰하십시오.
  12. 24 G IV 카테터 튜브를 흉부 구멍에 넣고 개구부 오른쪽에 늑간 공간 1개를 넣습니다.
  13. 늑간, 근육 및 피부 층을 닫고 첫 번째 절차와 동일한 방법으로 흉관을 제거하십시오.
  14. 1.5mL의 따뜻한 식염수를 피하하고 감염을 예방하기 위해 절개 부위에 삼중 항생제 연고를 적용한다.
  15. 이소플루란을 끄고 동물이 100% O2에서 인공호흡기를 통해 숨을 쉴 수 있도록 하여 도움 없이 지속적으로 호흡할 수 있습니다.
  16. 완전히 복구 될 때까지 35-37 °C의 온도와 따뜻한 패드에 덮여 침구 (종이 타월 또는 드레이프)와 침대가없는 케이지 또는 케이지로 마우스를 전송합니다.

4. 두 절차에 따라 수술 후 치료

  1. 자발적인 호흡, 흉골 회항 및 정상적인 움직임이 확립 될 때까지 동물을 지속적으로 관찰하십시오.
  2. 수술 당일 최소 3시간 동안 15-30분마다 관찰을 계속합니다.
  3. 5일 동안 매일 한 번, 매주 2-3회 상처 착증 또는 비정상적인 통증을 위해 마우스를 확인하십시오.
  4. 동물이 72 h op 후 통증의 징후 (즉, 아치형 등, 최소한의 움직임, 찡그린 눈가리개 또는 거친 모피)를 표시하는 경우, Buprenorphine SR 진통제의 추가 복용량을 제공합니다.

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결과

허혈 재관전 부상은 0일째에 마우스에서 유도되었고, 그 다음에는 줄기세포 이식 전날 수술 후 심전도 및 심전도가 뒤따랐다. 초음파 및 심전도 분석은 경색및 감소된 심실 수축 기능을 확인하였다(도1A-D). 데이터의 추가 검사는 허혈성 손상을 받은 마우스에서 배출 분획 및 분수 단축이 감소된 반면, 최종 확장기 및 수축부 부피가 증가하였다(표1). 일반 마우스심장(도 2A)에비해, 마손 트리크롬 염색심 조직 7일 후 상해(도2B)는좌심실 벽의 콜라겐 증착 및 숱이 증가한 것으로 나타났다. 두 번째 절차는 부상 후 7 일 수행되었다; 마우스는 중간엽 줄기 세포(3.0 x 105 in 20 μL PBS)의 내트라미카르탈 주사를 주었으며, 이는 구성적으로 발현된 CMV 프로모터 하에서 기자 유전자 ...

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토론

전 세계적으로 8,500만 명 이상이 심혈관 질환3의영향을 받습니다. 이러한 허혈성 이벤트의 높은 보급은 손상된 조직의 재생을 촉진하기위한 대체 치료의 추가 개발 및 확장을 보증합니다. 전통적인 방법은 치료 1의 후속 투여와 급성 설정에서 허혈 재관류 절차를활용한다. 염증 반응은 호중구, 대식세포 및 증가 된 사이토카인 신호10,12의침투와 함께 심장 허혈성 사건을 후유하는 3-4 일 사이에 절정에있습니다. 죽은 세포 집적의이 기간 후, 1 차적인 면역 반응은 가라앉기 시작하고 리모델링단계(13)로전환하기 시작한다. 더욱이, 임상 설정에 제시 된 것과 동일한 시나리오 내에서 치료 조사 하는 것이 중요 하다. 이 원고에서는, 우리는 MSC의 지연 주입으로 이중 외과 수술의 타당성 및 안전을 입증하기 ...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.9% NaCl 관개, USPBaxter0338-0048-04
11x12" Press n' Seal 수술용 드레이프, 오토클레이브 가능SAI 주입 기술PSS-SD
24G 3/4" IV 카테터 튜브Jelco4053
28G x 1/2" 1mL 알레르기 주사기BD305500진통제
주입 30G x 1/2" 3/10cc 인슐린 주사기Ulticare08222.0933.56줄기세포 주입
6-0 S-29, 12" Vicryl 봉합사EthiconJ556G늑간, 표재성 근육 및 피부층 절개 폐쇄
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멸균 6인치 테이퍼 면 팁 애플리케이터Puritan25-826-5WC
멸균 장갑Cardinal HealthN8830
살균 파우치MedlineMPP100525GS
수술 캡
외과 현미경LeicaM125
봉합사 묶는 집게, 스트레이트 (x2)Fine Science Tools10825-10
Transpore 수술 테이프3M1527-1
트리플 항생제 연고G & W Laboratories11-2683ILNC2감염 방지를 위한 국소 적용
Vannas-Tü bingen 스프링 가위, 곡선형Fine Science Tools15004-08
Vetflo 기화기Kent Scientific
한 진 Johnson

참고문헌

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  9. Peet, C., Ivetic, A., Bromage, D. I., Shah, A. M. Cardiac monocytes and macrophages after myocardial infarction. Cardiovasc Research. 16 (6), 1101-1112 (2020).
  10. Swirski, F. K., Nahrendorf, M. Cardioimmunology: the immune system in cardiac homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (12), 733-744 (2018).
  11. Zhang, Z., et al. Mesenchymal Stem Cells Promote the Resolution of Cardiac Inflammation After Ischemia Reperfusion Via Enhancing Efferocytosis of Neutrophils. Journal of the American Heart Association. 9 (5), 014397(2020).
  12. Saxena, A., Russo, I., Frangogiannis, N. G. Inflammation as a therapeutic target in myocardial infarction: learning from past failures to meet future challenges. Translational Research. 167 (1), 152-166 (2016).
  13. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
  14. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).

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