민물 평면도는 정량적 행동 분석에 의해 구별 되는 세 가지 걸음걸이 (활공, 연동 및 scrunching)를 전시합니다. 당사는 다양한 유해 자극, 정량화, 연동 및 글라이딩으로부터의 구별을 이용하여 스크런치를 유도하는 방법을 설명합니다. 유전자 녹다운을 사용하여, 우리는 정량적 현상 읽기로 스크런치의 특이성을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
민물 플래니안들은 보통 복부 쪽의 섬모 추진을 통해 매끄럽게 미끄러집니다. 그러나 특정 환경 조건은 근육 중심의 운동 형태인 연동 또는 스런치를 유도할 수 있습니다. 연동은 섬모 결함에서 발생하지만, 스크런치는 섬모 기능과 독립적이며 절단, 유해 온도, 극단적 인 pH 및 에탄올을 포함한 특정 자극에 대한 특정 반응입니다. 따라서, 이 두 근육 중심의 걸음걸이는 기계적으로 구별된다. 그러나, 그들은 질적으로 구별하기 어려울 수 있습니다. 여기에서는 다양한 물리적 및 화학 자극을 사용하여 스크런치를 유도하는 프로토콜을 제공합니다. 우리는 자유롭게 사용할 수있는 소프트웨어를 사용하여 연연및 글라이딩과 구별하는 데 사용할 수있는 스크런치의 정량적 특성을 자세히 설명합니다. scrunching은 보편적 인 평면 걸음걸이이기 때문에, 특성 종 별 차이가이기는하지만,이 프로토콜은 광범위하게 적절한 고려 사항을 사용할 때, 평면의 모든 종에 적용 할 수 있습니다. 이를 입증하기 위해, 우리는 행동 연구에서 사용되는 두 개의 가장 인기있는 플라야 종, Dugesia japonica 및 Schmidtea 지중해의반응을 물리적 및 화학 적 자극의 동일한 세트와 비교합니다. 더욱이, scrunching의 특이성은 이 프로토콜이 관련된 분자 표적 및 신경 회로를 해부하기 위하여 RNA 간섭 및/또는 약리학적 노출과 함께 사용될 수 있게 해주며, 잠재적으로 노치프션과 신경 근육 통신의 중요한 양상에 기계론적인 통찰력을 제공할 수 있습니다.
서론
4줄기세포 및재생연구1,,2,,3,민물 평면주의에 대한 인기 외에도, 민물 평면도는4,5에서오랫동안 사용되어 왔으며, 비교적 큰 크기(길이가 몇 밀리미터), 실험실 유지 보수의 용이성과 저렴한 비용, 광범위한 관찰 가능한 동작을 활용하고 있다. 평면 행동 연구에 컴퓨터 비전과 자동 추적의 도입6,,7,,8,,9,,10,,11 행동 표현형의 정량적 분화를 가능하게했다. 동물 행동은 신경 기능의 직접적인 판독입니다. 기획자 신경계는 중간 크기와 복잡성이지만, 척추 동물뇌12,,13,<....
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프로토콜
1. 양적 평면 행동 분석
- 실험 설정
- 희미한 LED 패널을 평평한 표면에 놓습니다. LED 패널은 두 가지 목적을 제공합니다: (1) 균일한 흰색 배경을 제공하고 (2) 적절한 콘트라스트를 얻기 위해 조정 가능한 광원으로 사용된다. LED 패널에 100mm 페트리 디쉬 아레나를 배치합니다.
참고: 처리량을 늘리기 위해 멀티 웰 플레이트를 아레나23,,24로사용할 수 있지만, 더 큰 경기장은 자동화된 이미지 분석을 용이하게 합니다. - 경기장 위의 링 스탠드에 카메라를장착합니다(그림 1A). 카메라 위치, 높이 및 초점을 필요에 따라 조정하여 전체 경기장이 시야 내에 중심이 되고 초점이 집중되도록합니다(그림 1B).
참고: 카메라 해상도는 평면을 LED 패널에서 제공하는 균일한 배경과 명확하게 구별할 수 있을 만큼 충분히 높아야 합니다. - 적절한 노출 매체(평면 수또는 화학용액)로 경기장을 최대 최대 량으로 채우면 됩니다(이는 목욕이라고 합니다). 이것은 100mm 페트리 접시에 대한 약 25 mL에 해당합니다....
- 희미한 LED 패널을 평평한 표면에 놓습니다. LED 패널은 두 가지 목적을 제공합니다: (1) 균일한 흰색 배경을 제공하고 (2) 적절한 콘트라스트를 얻기 위해 조정 가능한 광원으로 사용된다. LED 패널에 100mm 페트리 디쉬 아레나를 배치합니다.
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결과
S. 지중해 평면도에서 비외-UV 지각은 TRPA1 에 의존하 고 H2O2 릴리스17에연결 될 제안 되었습니다. H22O2 노출은 S. 지중해 및 D. japonica planarians28에서TRPA1 의존적인 스크런치를 유도하기 때문에, 섹션 2.1.4의 단계는 거의 UV 빛 노출이 두 종모두에서 스크런치를 유도하는지 여부를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. D. japonica planarians scrunch (10/10) 가까운 UV 빛에 노출 될 때, S. 지중해 평면도 는 이전에설명 된 대로 꼬리 숱이 (7/10)를 전시하거나 응답 없음 (3/10)(그림 4A,4B.......
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토론
이 프로토콜을 사용하여, 하나는 물리 및 화학 자극7,,28,,29 또는 유전자 조작 (RNAi)28, 29,29 의 효과 의 효과 평면 운동에서 정량적으로 연구 할 수 있습니다. 공간 해상도를 최대화하기 위해 카메라를 경기장과 최대한 가깝게 이동시키면서 전체 경기장이 시야에 있는지 확인하는 것이 가장 좋습니다. 처리량을 높이기 위해 여러 평면의 동작을 동시에 기록하여 한 번에 선별할 수 있습니다. 단일 경기장에서 하나 이상의 평면을 선별할 때, 피지에서 관심 있는 지역을 그려 서 여기에 설명된 대로 개별 평면인을 격리하거나 더 진보된 다중 물체 추적을 사용할 수 있습니다. 같은 경기장에서 여러 평면을 갖는 한 가지 문제는 경로를 교차 할 수 있다는 것입니다........
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 원고에 대한 의견에 대한 씨 타완 골에게 감사드립니다. 이 작품은 NSF 커리어 그랜트 1555109에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 알릴 이소티오시아네이트, 95% (AITC) | 시그마-알드리치 | 377430-5G | 주의: 가연성 및 급성 독성; 적절한 PPE로 흄 후드를 다루십시오. |
| 카메라 렌즈, 2/3 25mm F/1.4 | Tamron | 23FM25SP | |
| 세포 배양 플레이트, 6 웰, 조직 배양 처리 | Genesee Scientific | 25-105 | |
| 원심분리기 튜브, 50mL 폴리프로필렌, 멸균 | MedSupply Partners | 62-1019-2 | |
| 신남알데히드, >95% | Sigma-Aldrich | W228613-100G-K | |
| 조광 가능 A4 LED 트레이서 라이트 박스 | Amazon | B07HD631RP | |
| Flea3 USB3 카메라 | FLIR FL3-U3-13E4M | ||
| 내열 장갑 | Fisher Scientific | 11-394-298 | |
| 핫 플레이트 | Fisher Scientific | HP88854200 | |
| Instant Ocean Sea Salt, 탈이온수 | Instant Ocean | SS15-10 | 0.5g/L의 탈이온수로 준비합니다. |
| 몬티ü Milli-Q 물에서 제조된 ic 염 | Sigma-Aldrich | 다양한 | 1.6mM NaCl, 1.0mM CaCl2, 1.0mM MgSO<>sub4, 0.1mM MgCl2, 0.1mM KCl, 1.2mM NaHCO3에서 milli-Q 물에서 준비하고, HCl로 pH를 7.0으로 조정합니다. |
| 페트리 접시, 100 mm x 20 mm, 멸균 폴리스티렌 | Simport | D210-7 | |
| 피펫, 20-200 μ L 범위 | Rainin | 17008652 | |
| PYREX 150 mL 비커 | Sigma-Aldrich | CLS1000150 | |
| 면도날, 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Roscolux 컬러 필터: 골든 앰버 | Rosco | R21 | 또는 3가지 색상 필터가 모두 포함된 Roscolux 디자이너 색상 선택기(Musson 극장 제품 #SBLUX0306)를 구입하십시오. |
| Roscolux 컬러 필터: 미디엄 레드 | Rosco | R27 | |
| Roscolux 컬러 필터: Storaro Red | Rosco | R2001 | |
| Samco 이송 피펫, 62 & 마이크로; L 대형 조리개 | Thermo Fisher | 691TS | |
| 지원 스탠드 | Fisher Scientific | 12-947-976 | |
| 온도계 | VWR | 89095-600 | |
| UV 레이저 포인터 | 아마존 | B082DGS86R | 이것은 클래스 II 레이저 (405nm ± 10nm) 출력 전력 < 5mW입니다. |
참고문헌
- Rink, J. C. Stem cell systems and regeneration in planaria. Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).
- Reddien, P. W., Alvarado, A. S. Fundamentals of Planarian Regeneration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (200....
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재인쇄 및 허가
