본 명세서에 의한 복막, 비장 및 골수 조직에서 뮤린 면역 B 세포 구획의 이질성에 대한 간단한 분석을 설명한다. 프로토콜을 다른 마우스 조직으로 조정하고 확장할 수 있습니다.
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방법 논문
뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
광범위한 연구는 이차 림프구 기관에서 뮤린 B 세포의 개발 및 분화를 특징으로합니다. B 세포에 의해 분비된 항체는 고립되고 잘 확립된 치료제로 개발되었습니다. murine B 세포 발달의 검증은 자가 면역 경향이 마우스의 맥락에서, 또는 수정된 면역 계통을 가진 마우스에서, 마우스에 있는 치료에이전트를 개발하거나 시험하는 중요한 분대이고 유동 세포측정의 적당한 사용입니다. 잘 확립된 B 세포 흐름 세포 계발성 파라미터는 뮤린 복막, 골수 및 비장의 B 세포 발달을 평가하는 데 사용될 수 있지만, 다수의 모범 사례를 준수해야 한다. 또한, B 세포 구획의 유동 세포 측정 분석은 또한 B 세포 발달의 추가 판독을 보완해야 한다. 이 기술을 사용하여 생성된 데이터는 항체 또는 항체 와 같은 분자를 치료제로 생성하는 데 사용할 수 있는 인간화된 마우스뿐만 아니라 야생 유형, 자가 면역 경향이 마우스 모델뿐만 아니라 인간화된 마우스에 대한 우리의 이해를 더욱 발전시킬 수 있습니다.
서론
단일 클론 항체는 주류 의학의 일부가됨에 따라 점점 많은 인간 질환에 대한 선택 요법이되고있다1,2. 우리는 이전에 마우스 IgH constants3,4를 가진 완전히 인간 변수 지역을 항구하는 항체를 능동하게 생성하는 유전자 조작 마우스를 기술했습니다 3,4. 가장 최근에, 우리는 뚜렷한 항원 결합5가 있는 항체 같이 분자를 생성하는 유전자 조작한 마우스를 기술했습니다5. 항체는 B 세포에 의해 분비되고 적응성 유머 면역의 기초를 형성합니다. B 세포, B-1 및 B-2의 2개의 명백한 모형이 있습니다. 포유동물에서 B-1 세포는 태아 간에서 유래하고 출생 후 점막 조직및 흉막 및 복막 구멍에서 풍부하게 되며, B-2 세포는 출생 전 과 그 이후 골수 (BM)에서 태아 간에서 유래한다. B-2 세포는 비장 과 혈액6,7,8을 포함하여 이차 림프성 기관에서 농축된다. BM에서,....
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프로토콜
모든 마우스 연구는 Regeneron의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 감독되고 승인되었습니다. 이 실험은 잭슨 연구소에서 3개의 C57BL/6J 암컷 마우스(17주)에서 조직에 대해 수행하였다. 이상적인 농도를 결정하기 위해 실험을 시작하기 전에 모든 항체를 적중시한다. 단일 색상 보정을 위해 보상 구슬을 사용할 때 샘플보다 밝거나 밝은 얼룩이 있는지 확인하십시오. 모든 완충제, 항체 및 세포를 얼음 또는 4°C로 유지합니다. 생존 성 염료를 추가 한 후, 저조도 또는 어둠 속에서 4 ° C에서 모든 단계와 인큐베이션을 수행합니다.
1. 회간 세포 수확 및 단일 세포 격리
- CO2또는 승인된 프로토콜에 따라 마우스를 안락사시합니다.
- 마우스를 등에 놓고 70% 에탄올로 스프레이하고 복막을 자르지 않도록 주의하면서 가위로 바깥복부 피부를 잘라냅니다.
- DPBS [vol/vol]에 3mL의 얼음 냉세척 버퍼(0.5% 소 세럼 알부민(BSA)를 복막 구멍에 주입하여 25게이지 바늘이 장착된 3mL 주사기로 복막 구멍에 넣습니다.
- 손끝으로 회대를 부드럽게 마사지하세요.
- 1.3 및 1.4 단계를 반복합니....
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결과
여기서 우리는 마우스 복막, BM 및 비장의 B 세포 발달을 특성화하기위한 게이팅 전략을 제시합니다. 분석의 기초는 생존 염료로 염색의 개념을 중심으로 형성되고, 전방 분산 영역 (FSC-A) 및 전방 분산 높이 (FSC-H)에 따라 두 배를 게이팅하고, 마지막으로 FSC-A 및 측면 분산 영역 (SSC-A) 특성에 따라 세포를 선택하여 이물질을 제거하여 이물질을 제거합니다. 관심있는 인구에 게이팅하기 전에.
복막 B 세포의 흐름 세포 측정 분석은 표 1에 설명된 염색 패널을 사용하여 실행 가능한 복막 세포, 총 B 세포, B-1 및 B-2 서브세트뿐만 아니라 C57BL/6J 마우스에서 B-1a 및 B-1b 세포의 주파수를 나타낸다. 이러한 주파수의 평균 절대 셀 수는
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토론
림프및 비 림프구 조직의 흐름 세포 분석은 1980 년대 이후 마우스와 인간에서 B 세포 하위 집단의 동시 식별 및 열거를 가능하게했다. 그것은 유머 면역의 척도로 사용되었으며 B 세포 기능을 평가하기 위해 더 적용 할 수 있습니다. 이 방법은 희귀 한 집단에서도 B 세포 이질성의 평가를 가능하게하는 다중 매개 변수의 동시 분석을 통해 마우스와 인간에서 B 세포 성숙의 다른 단계를 평가하기 위해 시약 가용성을 활용합니다. 복잡한 이종성 샘플을 측정하는 데 사용되는 경우 개별 셀33에서 몇 분 안에 하위 집단을 감지할 수 있습니다. 흐름 사이토메트릭 분석에 가장 자주 적용되는 순차 적 게이팅 분석 전략은 특정 인구를 식별해야 할 때 간단하고 직관적일 수 있습니다34. 마지막으로, 흐름 세포 측정의 또 다른 장점은 숙련 된 사용자의 지도하에, 대부분의 학술 실험실에서 쉽게 적응 할 수 있다는 것입니다. 우리의 프로토콜은 성공적으로 B-1 인구를 설.......
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공개 사항
모든 저자는 Regeneron 제약, Inc.의 직원 및 주주입니다.
감사의 글
원고를 비판적으로 읽어주신 매튜 슬리먼에게 감사드립니다. 우리는 또한 이 연구를 지원해 준 Regeneron의 Vivarium 운영 및 플로우 세포측정 핵심 부서에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.5 mL 안전 잠금 Eppendorf 튜브 | Eppendorf | 22363611 | 0.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 |
| 1.5mL Eppendorf 튜브 | 에펜도르프 | 22364111 | 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 |
| 15 mL Falcon 튜브 | 코닝 | 352097 | 15 mL 원뿔형 튜브 |
| 18 게이지 바늘 | BD | 305196 | |
| 25 게이지 바늘 | BD | ||
| 3 mL 주사기 | BD | 309657 | |
| 70 mM MACS SmartStrainer | 밀테니 바이오텍 | 130-110-916 | 70mM 세포 스트레이너 |
| 96 웰 U 바닥 플레이트 | VWR | 10861-564 | |
| ACK 용해 완충액 | 지브코 | A1049201 | 적혈구 용해 완충액 |
| Acroprep Advance 96 웰 필터 플레이트 | Pall Corporation | 8027 | 필터 플레이트 |
| B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ | BD | 552843 | 보상 구슬 |
| BD CompBead Anti-Rat Ig/κ | BD | 552844 | 보상 비즈 |
| 소 세럼 알부민 | 시그마-알드리치 | A8577 | BSA |
| BP-1 | BD | 740882 | |
| 브릴리언트 스테인 버퍼 | BD | 566349 | 브릴리언트 스테인 버퍼 |
| C-Kit | BD | 564011 | |
| CD11b | BD | 563168 | |
| CD11b | BioLegend | 101222 | |
| CD19 | BD | 560143 | |
| CD21/35 | BD | ||
| CD23 | BD | 740216 | |
| CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
| CD3 | BD | 561388 | |
| CD3 | BioLegend | 100214 | |
| CD43 | BD | 553270 | |
| CD43 | BioLegend | 121206 | |
| CD5 | BD | 563194 | |
| CD93 | BD | 740750 | |
| CD93 | BioLegend | 136504 | |
| DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
| eBioscience 정착성 생존도 염료 eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | 생존도 염료 |
| 확장 미세 팁 전달 피펫 | Samco | 233 | 일회용 전달 피펫 |
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| Fc 블록, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc 블록 |
| FlowJo | Flowjo | 플로우 사이토미터 분석 소프트웨어 | |
| gentleMACS C 튜브 | 밀테니 바이오텍 | 130-096-334 | 자동 해리 튜브 |
| 젠틀MACS Octo 디스해리터와 히터 | 밀테니 바이오텍 | 130-095-937 | 조직 해리기 기기 |
| GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
| IgD | BioLegend | 405710 | |
| IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
| Kappa | BD | 550003 | |
| Lambda BioLegend | 407308 | ||
| 파라포름알데히드, 32% 용액 | 전자 Microscopy Sciences | 15714 | |
| Ter119 | BioLegend | 116220 | |
| True-Stain monocyte blocker | BioLegend | 426103 | monocyte blocker |
| UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | |
| EDTA Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | cell counter instrument |
참고문헌
- Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins. Clinical Medicine. 17 (3), London. 220(2017).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-1....
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재인쇄 및 허가
