마우스 심장의 모세혈관, 동맥 및 페리사이클의 동적 측정 및 이미징

요약

여기에 제시된 것은 혈관 동맥이 수납 및 가압되기 때문에, 모세관 침대 및 백혈구를 포함하는 혈관 나무 구성 요소뿐만 아니라 압력을 유지하는 동맥 관류 압력 및 흐름의 전 생체 모니터링에 의해 살아있는 뮤린 심장 조직에서 관상 동맥 미세 순환을 연구하는 프로토콜이다.

초록

관상 동맥 톤은 모세 혈관의 개폐와 함께 주로 일정한 관류 압력에서 심근세포로의 혈류를 결정합니다. 그러나, 관상 동맥과 전체 심혼에 있는 모세 혈관의 동적 변경을 감시하기 어렵습니다, 주로 그것의 운동 및 논스톱 치기 때문에. 여기에서 우리는 마우스 오른쪽 심실 유두 근육에 동맥 관류 속도, 압력 및 모세 혈관의 직경 변화의 모니터링을 가능하게하는 방법을 설명합니다. 마우스 중격 동맥은 다른 동적으로 측정된 일정한 흐름 또는 압력에서 수중 및 퍼플레이션됩니다. 형광으로 표시된 렉틴(예: 알렉사 플루어-488 또는 -633개의 밀-세균 아글루티닌, WGA)을 배설한 후, 오른쪽 심실 포세혈관 근육과 중격의 동맥 및 모세혈관(및 기타 혈관)을 용이하게 이미지화할 수 있다. 혈관 직경 의 변화는 심장 수축의 존재 또는 부재에서 측정 될 수있다. 유전적으로 인코딩된 형광 단백질이 발현되었을 때, 특정 특징은 모니터링될 수 있었습니다. 예를 들어, pericytesNG2-DsRed를 표현 마우스 심혼에 시각화되었습니다. 이 방법은 심장에 있는 모세관 pericytes의 생리적 기능을 연구하는 유용한 플랫폼을 제공했습니다. 또한 혈관/모세관 직경과 동맥 발광 압력을 동시에 측정하여 심장의 혈류에 대한 시약의 효과를 연구하는 데 적합합니다. 이 준비는 최첨단 광학 이미징 시스템과 결합되어 거의 생리적 조건하에서 심장의 세포 및 분자 수준에서 혈류량과 제어를 연구할 수 있습니다.

서론

적절한 관상 동맥 압력 -유동 조절은 신진 대사 요구를 충족하기 위해 심장에 충분한 혈액 공급을 보장^1. 그러나, 그것은 단지 최근에 관상 동맥 압력 흐름은 지난 수십 년 동안 생체 내 및 체외에서 수행 된 광범위한 연구에도 불구하고, 심장에서 동적으로 조절되는 방법을 분명하게되고있다. 그 이유 중 하나는 심장의 지속적인 박동으로 인해 이러한 연구를 위한 생리적 작업 모델을 확립하는 데 어려움이 있기 때문입니다. 에 관계없이, 살아있는 조직 또는 동물에서 관상 동맥 마이크로 선박의 관찰을 위해 다양한 방법이 확립되었지만, 이러한 방법 중 어느 것도 동시에 압력, 유량 및 미세 혈관 직경의 일정한 / 안정적인 초점 과 측정을 달성 할 수 없었다^2,3. 박동 심혼에 관상 동맥 마이크로 혈관의 직접적인 시각화는 수십 년 전^4,3,그러나 작은 선박의 직경 측정이 도전적이었고 마이크로 순환과 관련된 많은 특수 세포 유형의 특정 기능이 균등하게 골치 아픈 것이었습니다. 스트로보스코픽 방법과 부동 목표 시스템조차도 위의 정보를 동시에 제공할 수 없다

프로토콜

모든 동물 관리는 메릴랜드 볼티모어 대학과 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인 프로토콜의 지침에 따라했다.

1. 솔루션 준비

참고: 솔루션을 미리 준비합니다. 두 가지 유형의 기본 솔루션이 실험에 사용됩니다: (1) 목욕 상복부에 대한 생리식염수 용액(PSS)과 (2) 루멘 난투에 대한 타이로드의 솔루션. PSS의 pH를 유지하기 위해서는 CO_2를 사용하여 연속 버블링이 필요합니다. HEPES 버퍼티로드의 용액은 기포가 내피 세포^7을 손상시키고 흐름을 폐색하기 때문에 PSS 대신 루멘에서 사용됩니다.

1. PSS 솔루션: 표 1에서PSS 솔루션의 수식 및 구성을 참조하십시오. Ca²⁺-무료 및 포도당 없는 PSS 재고 솔루션의 10 L을 만들고 실온에서 보관하십시오. 1h 는 어떤 절차 전에, 5% CO₂ (74% N 2 및 21% O_2)로 스톡 용액의 1 L을 꺼내용 용액의 pH를 ~7.4로 유지한다. 포도당 1.8g과 1.8mL CaCl₂ (1M 스톡)^8을....

결과

형광 혈관 마커가 혈관 루멘(여기 WGA가 알렉사 플루오르-488과 결합됨)에 침투하면 고속 공초점 현미경을 사용하여 도 5(왼쪽 패널)에 도시된 바와 같이 전체 혈관 나무를 시각화할 수 있다. 추가 배율은 모세관의 이미징을 자세하게 가능하게한다(도 5,오른쪽 패널). 가압 시스템은 발광 압의 지속적인 모니터링을 지원하기 때문에,이 준비는 동맥 압력과 동맥 직경의 변화를 연결하는 데 사용할 수 있습니다. 비디오 1은 핀산틸이 ATP에 민감한 K⁺ 채널(K_ATP)아고니스트가 루멘에서 제공되었을 때, 동맥의 직경이 증가하였다는 것을 보여준다. 도 6은 혈관 수축기 ET-1이 루멘으로부터 적용되었을 때, 동맥의 직경이 감소하고, 유동이 일정하게 설정되었을 때 발광 압력이 증가되었다는 것을 나타낸다.

.......

토론

본 연구에서는 생리적 조건 하에서 심장에서 관상 동맥 미세 순환을 연구하기 위해 매우 간단하면서도 매우 실용적인 전 생체 내 방법을 도입했습니다. 이 방법은 쥐^2를사용하여 기계적 조사에서 수정되었다. 도전적인 추가는 고속 및 고광학 해상도를 가진 이미징 기술이었습니다. 따라서 우리는 현재 상용화된 고급 광학 이미징 시스템을 활용할 수 있었습니다. 유두 근육의 기능을 유리한 위치에 신중하게 해부하고 배치함으로써, 우리는 동맥, 모세혈관 동맥, 모세 혈관 및 베룰뿐만 아니라 회신을 시각화할 수 있었고, 다른 부분을 제어하면서 동맥 압력 및/또는 흐름을 측정할 수 있었습니다. 동맥 및 모세관 직경 변화는 고속 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 모니터링되었다. 광학 영상과 생리식염수 용액의 내부 관류의 조합은 이러한 준비를 생물학적 치료의 효과의 평가뿐만 아니라 심장^1의혈류의 생리적 및 병리학적 조절에 관여하는 메커니즘의 연구에 도움이 된다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1 M CaCl2 용액	MilliporeSigma, 미국	21115
1 M MgCl2 용액	MilliporeSigma, 미국	M1028
AxoScope 소프트웨어	Molecular Devices, San Jose, CA, 미국
냉각기 / 물 인큐베이터	FisherScientific, 미국 Isotemp	3016S
Confocal	Nikon Instruments, 미국	A1R
사용자 정의 유리관	Drummond Scientific Company	9-000-3301
Digidata 1322A	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
해부 현미경	올림푸스, 일본	SZX12
Endothelin-1	MilliporeSigma, 미국	E7764
집게	Fine Scientific Tools	11295-51
헤파린 나트륨 Salt	Sigma-Aldrich, USA	H3393
인라인 솔루션 히터	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	SH-27B
Isoflurane	VETone, Idaho, USA	502017
마이크로피펫 풀러	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97
마이크로피펫/캐뉼라 홀더	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	64-0981
NG2DsRedBAC 형질전환 마우스	The Jackson Laboratory	#008241
혈관 묶기용 나일론 실	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	THR-G
PDMS(폴리디메틸실록산)	SYLGARD, Germantown, WI, USA	184 SIL ELAST KIT
연동 펌프	Gilson, Middleton, WI, USA	minipuls 3
압력 서보 컨트롤러	리빙 시스템 계측, 미국 버몬트주 벌링턴	PS-200-S
가위	미세 과학 도구, 포스터 시티, 캘리포니아, 미국	15000-10
서보 펌프	리빙 시스템 계측, 미국 버몬트주 벌링턴	PS-200-P
온도 컨트롤러	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	TC-324B
밀 배아 응글레티닌, 알렉사 플루어 488 Conjugate	ThermoFisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	W11261