방법 논문

혈관 의료 기기의 혈혈성 호환성 및 호스트 세포 활성화를 조사하는 시험관 헤모역학 루프 모델

DOI:

10.3791/61570

⸱

2020년 8월 21일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiothoracic Surgery, Otto-von-Guericke-University, 2Department of Mechanical Engineering, Institute for Materials and Joining Technology, Otto-von-Guericke-University, 3Institute of Clinical Chemistry and Pathobiochemistry, Otto-von-Guericke-University, 4Division of Cardiology and Angiology, Department of Internal Medicine, Otto-von-Guericke-University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시된 시험관 내 혈역학 루프 모델에 대한 표준화된 프로토콜이 있습니다. 이 모델은 ISO(국제표준화기구) 표준 10993-4에 따라 관류 관 또는 혈관 스텐트의 혈중 호환성을 테스트할 수 있습니다.

초록

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이 연구에서는, 폴리염화비닐(PVC)으로 만들어진 5mm의 내경을 가진 튜브의 혈투호환성은 코팅되지 않은 PVC 튜브, 라텍스 튜브 및 PVC 튜브 내부에 배치된 내트라바 내 적용을 위한 스텐트와 비교하였다. 혈역학평가는 ISO 표준 10993-4에서 권장하는 체외 혈역학 루프 모델을 사용하여 수행되었다. 튜브는 동일한 길이의 세그먼트로 절단하고 스플라이스의 틈새를 피하는 루프를 형성하기 위해 폐쇄된 다음 인간의 피로 채워져 3시간 동안 37°C의 수조에서 회전하였다. 그 후, 관 내부의 혈액은 전혈세포 수, 혈류(프리 플라즈마 헤모글로빈), 보완 시스템(sC5b-9), 응고 시스템(fibrinopeptide A), 및 백혈구 활성화(다형성 엘라스타제, 종양 괴사 인자 및 인터류크인-6)의 분석을 위해 수집되었다. 숙주 세포 활성화는 혈소판 활성화, 백혈구 인테그린 상태 및 유동 세포측정을 이용한 단핵혈소판 응재를 위해 결정되었다. 부정확한 루프 폐쇄의 효과는 엑스레이 미세토포그래피 및 주사 전자 현미경으로 검사되었으며, 이는 스플라이스에서 혈전 형성을 보였다. 라텍스 튜브는 혈액의 플라즈마 및 세포 성분 모두의 가장 강력한 활성화를 보여주었으며, 이는 혈우호환성이 좋지 않았으며 스텐트 그룹과 코팅되지 않은 PVC 튜브가 뒤따랐습니다. 코팅된 PVC 튜브는 혈소판 활성화 상태가 현저한 감소를 나타내지 않았지만 코팅되지 않은 PVC 튜브에 비해 보완 및 응고 계단식으로 증가했습니다. 루프 모델 자체는 세포 또는 수용성 인자의 활성화로 이어지지 않았고, 용해 수준이 낮았다. 따라서, 제시된 체외 혈역학 루프 모델은 기계적 힘에 의한 혈액 성분의 과도한 활성화를 방지하고 기증자 혈액과 혈관 의료 기기 간의 체외 상호 작용을 조사하는 방법으로 작용한다.

서론

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의료 기기의 혈우호환성 테스트는 외피 막 산소화를 위한 혈관 스텐또는 관류관과 같은 새로운 장치의 개발에 중요한 단계입니다. 오늘날까지 동물 모델은 인간에서 구현되기 전에 의료 기기 를 테스트하는 절차를 마무리하는 표준 도구로 간주됩니다. 따라서동물에 대한 조사를 최소화하는 데 도움이 되는 체외 모델의 대안을 찾아야 합니다. 이 연구에서, 우리는, 따라서, 체외 혈역학 루프 모델의 소형을 탐구했다. 이 제시된 방법의 목표는 ISO 10993-4 표준에 따라 의료 기기의 체외 혈액 호환성을 테스트하는 것이다.

ISO 10993-4 표준은 혈액 표본1에서조사할 임상 파라미터의 표준화된 세트를 설명합니다. 간단히, 이들은 혈전증 (혈소판 응집 및 개수), 응고 (fibrinopeptide A, FPA), 혈액 학적 분석 (전혈 세포 수), 혈청 지수 (무료 혈장 헤모글로빈) 및 보완 시스템 (말기 보완 복합, sC5b9)이다. 그러나, 호중구 다형성 엘라스타제(PMN), 인터류키 6(IL-6) 및 종양 괴사 인자-알파(TNF)와 같은 추가 마커는 백혈구의 활성화 상태를 반영하는 측정을 위해서도 고려될 수 있다. 혈장에 존재하는 순환 세포 무료 단백질을 결정하고 정량화하기 위해, 샌드위치 효소 연결 면역조벤트 분석법(ELISA)은 종래의 가장 신뢰할 수 있는 방법2,3을나타낸다. 마찬가지로, 숙주 세포의 표현형 및 활성화 상태(예를 들어, 백혈구)는 단일 세포 현탁액 기반 판독을 제공하는 유혈 세포 측정(FACS)에 의해 분자의 세포 표면 발현을 검출함으로써 정량화될 수 있으며, 여기서 형광표시 특정 항체가 표적 세포 표면분자에결합된다. 스캐닝 전자 현미경 검사법(SEM)은 또한 ISO 10993-4 표준1에의해 테스트된 물질상 혈전 형성을 결정하는 것이 좋습니다. 이 방법은 X선 미세토모그래피(μCT)로 보완될 수 있으며, 3D 렌더링 된 이미지5에서혈전 의 두께, 크기 및 국소화와 같은 혈전의 구조적 분석을 수행할 수 있습니다.

체외 혈역학 모델을 사용하는 뒤에 근거는 혈소판과 같은 혈액 성분의 기본적인 생리적 역학을 이해하여 최고의 성능과 호환 의료 장치를 선별하는 것입니다, 이는 1 차 혈전 또는 백혈구및 혈관 장치의 다른 유형과의 상호 작용에 관여하는. 이러한 체외 시스템은 동물 연구의 필요성을 줄이기 때문에 매우 요구됩니다.

여기에 제시된 루프 모델은 이러한 요구를 충족시다. 이 모델은 1958년 A.B 챈들러가 혈액 혈전 생산을 위해 처음 설명되었으며, 따라서 챈들러 루프 모델6이라고도합니다. 지금까지, 본모델은 의료기기7,8,9,10,11,12,13,14의혈액 생체 적합성을 조사하기 위해 일련의 실험 및 수정에 사용되어 왔다. 그것은 부분적으로 혈액으로 채워지고 재 closable 루프로 형성되는 폴리머 튜브로 구성되어 있습니다. 이 루프는 온도 조절 수조에서 회전하여 출혈성 효과로 혈관 유동 조건을 시뮬레이션합니다. 고분자 튜브 내부의 혈류를 유도하기 위해 루프 내부의 기계적 볼 밸브를 사용하는 펌프 구동 모델 또는 모델과 같은 대체 방법은 이미15,16으로설명되었다. 그러나, 여기서 제시된 방법의 전반적인 장점은 혈액 세포및 단백질에 적용되는 기계적 힘이 낮고, 용혈을 피하고, 혈액과 커넥터 사이에 접촉이 없다는 것입니다, 이는 아마도 혈류 난류와 혈액 성분의 활성화로 이어질 수 있다는 것이다. 루프 내부의 주요 활성화 요소는 테스트 재료 자체와 내부에 갇혀있는 공기입니다. 이는 혈액-공기 인터페이스가 단백질데니션(17)으로이어질 수 있더라도 측정 오류의 원인을 최소화하고 높은 재현성을 제공하는 데 도움이 된다. 또한 길이 나 크기 제한없이 튜브 재료와 스텐트 직경의 종류를 조사하여 서로 다른 길이와 내지름의 튜브를 사용할 수 있습니다. 더욱이, 부정확한 루프 폐쇄에 대한 호스트 혈전성 및 코팅되지 않은 튜브 표면에 대한 노출도 조사할 수 있다. 시험관 내 혈역학 루프 모델의 다른 유사한 의료 응용은 또한 1차 임상 시험 전에 전임상 개발 또는 개별 약물 안전 스크리닝 동안 면역치료제(drug)와 혈액 성분 간의 상호작용을 연구하거나, 추가실험18,19,20에사용될 수 있는 혈전 물질의 생성을 위해 사용될 수 있다는 것이다.

이 연구는 관류 관 및 /또는 스텐트의 혈전성을 테스트하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 여기서, 코팅되지 않은 PVC 튜브(hepPVC: 헤파린 코팅, polyPVC: 생리활성 폴리머코팅)의 비교. 혈소판의 활성화를 낮췄지만, 응고 시스템(FPA)의 높은 활성화는 코팅되지 않은 튜브에 비해 코팅된 두 튜브 모두에 대해 발견되었다. 여기에 사용되는 hepPVC 튜브는 혈전저항성(21)을 만들기 위해 상주 바인딩 된 헤파린으로 변형되었으며 이미 다른 매개 변수(22)를최적화하고 특성화하기 위해 루프 모델에 사용되었습니다. 이 연구에서 사용되는 polyPVC 튜브는 초보성 혈액 관류의 임상 설정에 사용되는 시판되는 튜브이며혈전성(23)을줄이기 위해 헤파린 폴리머로 코팅된다. 때로는 임상 응용 분야에서도 코팅되지 않은 PVC 튜브가 사용됩니다. 따라서, 우리는 혈소판의 과도한 활성화를 보여 긍정적 인 대조군으로 라텍스 튜브를 포함, 응고 시스템, IL-6, TNF 및 PMN 엘라스타제와 같은 수용성 인자. 부정확한 루프 폐쇄를 시뮬레이션했을 때 혈전 형성이 발견되었습니다. 이것은 기준조건에 비교된 응고 및 보완 시스템뿐만 아니라 백혈구 및 혈소판의 활성화로 이어졌다. 더욱이, 여기서 사용되는 스텐트 물질(베어 메탈 니티놀 스텐트, 탄소함침 확장 폴리테트라플루오로로틸렌으로 덮여 있음)에 대한 혈액 접촉은 PMN 엘라스타제의 관점에서 더 높은 혈소판 및 백혈구 활성화로 이어졌다. 전반적으로, 제시된 모형은 적혈구 (RBC) 혈류가 명백한 라텍스 관을 제외하고, 기준선 또는 정적 조건에 비교되었기 때문에 시험된 혈관 장치 중 임의의 혈류를 유도하지 않았다. 더욱이, 이 관혈관은 화상 진찰또는 결투에 의해 검토될 수 있습니다. 조직학적 평가가 가능할 지 모르지만, 우리는 주로 ELISA및 유동 세포측정에 초점을 맞추어 이러한 실험을 수행하고 이를 통해 많은 실험실에 대한 본선 모델을 기반으로 실험을 수행할 수 있습니다. 따라서, 이러한 방법은 ISO 10993-4 표준의 권고에 따라 혈관 의료기기의 혈액 생체 적합성을 시험하는 실현 가능한 방법을 나타낸다. 더욱이, 이 방법은 혈액과 물질 간의 상호 작용이 유동 조건하에서 시험되어야 할 때마다 사용될 수 있고, 생체 내 조건을 모방할 수 있다.

프로토콜

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이 연구는 대학 병원 Magdeburg의 의학 교수의 윤리위원회에 의해 승인되었다 (신청 번호 88/18) 및 과목은 혈액 그리기 절차에 앞서 서면 통보 동의를 제공.

1. 헤파린 재고 준비 및 혈액 샘플링

  1. 전체 실험에 필요한 혈액의 양을 계산합니다.
    참고: 거의, 5 mL의 분리된 혈액은 중복 (루프)에 있는 각 혈관 장치에 필요합니다. 마찬가지로, 각 기준선과 정전기 상태에 대해 5mL의 혈액이 필요하며 실온에서 따로 유지됩니다.
  2. 100 IU/mL 농도의 헤파린 스톡 솔루션을 증분물에 분별하지 않은 헤파린(예: 로텍스메디소)을 희석하여 준비합니다. 10mL 의 신선한 혈액의 분리에 이 용액의 150 μL을 사용하십시오.
  3. 전혈구 수, ELISA 및 FACS 에세이에 필요한 혈장뿐만 아니라 혈액의 양을 계산합니다.
    참고: 이 연구에서 표현된 측정은 총 혈액 부피가 10mL인 병렬(복제본)으로 실행되는 두 개의 루프에서 가져옵니다.
  4. 필요한 양의 혈액을 기준으로 10mL 주사기를 150 μL의 헤파린 스톡 용액으로 채우고 1.5 IU/mL 혈액의 최종 헤파린 농도로 혈액 응고를 방지합니다.
  5. 나비를 사용하여 혈액을 그립니다 (크기 : 21 G). 과도한 진공으로 인한 용혈이나 세포 활성화를 피하기 위해 주사기를 매우 부드럽게 채웁니다.
    참고: 지역 윤리위원회의 허가는 실험이 시작되기 전에 얻어야 한다. 각 인간의 혈액 기증자로부터 정보에 입각한 동의를 얻습니다. 혈액 기증자가 건강하고 어떤 약물을 취하지 않는지 확인, 특히 실험 전에 적어도 10 일 동안 항혈소판 에이전트 또는 비 스테로이드 항 염증 약물. 참고로, 이 원고에 제시된 바와 같이 처음으로 다양한 유형의 혈관 장치를 비교할 때 동일한 기증자가 선호됩니다. 개별 간 차이를 추가로 평가하기 위해 프로토콜은 다른 기증자와 함께 반복될 수 있습니다.
  6. 유리 비커에 혈액을 수집, 과도한 동요를 방지.

2. 체외 혈역학 루프 조립

  1. 수위가 회전 장치의 중앙까지 도달 할 때까지 수조를 채웁니다. 수온을 37°C로 설정합니다.
  2. 다른 튜브 재료 (폴리 PVC, hepPVC, PVC 및 라텍스)를 테스트하기위한 루프 어셈블리
    1. 각 튜브 재료(내름 5mm)의 50cm 길이 의 두 개를 튜브 커터로 자릅니다. 작은 직경의 루프에 대한 완벽한 폐쇄에 특히 중요하므로 절단 표면이 평평하여 혈액이 피팅 가장자리에 왜곡없이 흐르도록하십시오.
      참고: 이 전체 프로토콜은 5mm의 내경을 가진 튜브를 사용합니다.
    2. 처리를 용이하게 하고 회전 후 시료 처리 지연을 방지하려면 4개의 루프(중복된 재료 2개)만 병렬로 실행합니다.
    3. 루프 형상을 생성하려면 튜브의 열린 엔딩을 조사 튜브의 외부 직경에 맞는 짧은 실리콘 튜브에 연결합니다.
    4. 폴리카보네이트 장력 밴드를 사용하여 루프의 적절한 닫기를 보장합니다. 처음으로 사용하면, 필요한 길이의 가위로 장력 밴드를 절단하여 루프의 외부 직경에 맞게 밴드의 길이를 조정하고 3mm 토크 렌치로 고정합니다.
    5. 튜브 엔딩을 검사하여 텐션 밴드 커넥터의 잠금 나사를 조심스럽게 조입니다. 폐점력을 조정하여 튜브 엔딩 사이에 간격이 남지 않도록 합니다. 잠금 나사가 완전히 강화되고 폴리 카보네이트 밴드의 긴장이 너무 낮아 튜브 엔딩 사이의 간격을 닫을 수 없다면 시스템을 잠그고 장력 대역의 몇 mm를 자릅니다. 정확한 루프 폐쇄가 이루어질 때까지 반복하십시오(그림1A).
    6. 튜브 재료가 매우 부드럽고 장력 밴드 내부에 미끄러지는 경향이있는 경우, 장력 밴드(그림 1B, C)에전기 테이프로 루프를 고정합니다.
    7. 테스트 루프와 동일한 치수로 온도 제어를 위해 PVC의 추가 루프를 준비합니다.
    8. 수조 외부 회전 장치의 루프 요람에서 루프를 고정합니다. 그 후, 루프 요람을 수조 내부의 회전 유닛에 부착한다(도1E).
    9. 장력 대역을 루프에서 부분적으로 분해하고 각 튜브의 한쪽 끝을 분리하여 루프를 엽니다.
    10. 부드럽게 5mL 세로지 피펫으로 혈액의 5mL로 각 루프를 채웁니다. 루프에 적재하기 전에 천천히 위아래로 파이프를 통해 유리 비커에 두 번 부드럽게 혈액을 섞습니다.
    11. 일회용 온도계를 가지고 온도 제어 루프 내부에 배치합니다. 온도계가 너무 크면 가위로 잘라 작은 튜브에 맞게 자릅니다. 실온에서 5mL의 탈온화된 물로 루프를 채웁니다.
    12. 루프를 닫고 루프, 장력 밴드 및 랙이 제대로 장착되었는지 확인합니다.
    13. 회전 속도를 분당 30라운드(rpm)로 설정하고 3시간 동안 회전합니다.
  3. 부적절한 루프 클로저(간격)의 영향을 테스트하기 위한 루프 어셈블리
    1. 2.2에 설명된 대로 4개의 루프(polyPVC)를 준비합니다.
    2. 텐션 밴드로 루프 두 개를 제대로 닫고 튜브 엔딩 사이의 간격을 피하십시오.
    3. 다른 두 루프의 경우 2.2.3에 설명된 대로 개방 엔딩을 더 큰 튜브로 연결하지만 루프 엔딩 사이에 1-2mm의 간격을 둡니다. 이러한 루프에 대한 장력 대역을 사용하지마십시오(그림 1D).
    4. 2.2.7 및 2.2.11에 설명된 바와 같이 하나의 온도 제어 루프를 준비합니다.
    5. 2.2.10에 설명된 바와 같이 모든 루프를 혈액으로 채웁니다.
    6. 회전 속도를 30rpm으로 설정하고 3시간 동안 회전합니다.
  4. 스텐트 테스트를 위한 루프 어셈블리
    1. 2.2 및 다음에 설명된 대로 4개의 루프를 준비합니다.
      참고: 스텐트의 혈액 생체 적합성을 평가하기 위해 튜브 재료 자체는 세포 활성화의 마스킹을 방지하기 위해 생체 적합성검사를 받아야 합니다. 데이터가 없는 경우 튜브 재료 자체는 2.2에 설명된 대로 테스트할 수 있습니다. 또한 스텐트의 직경 범위가 적용될 수 있으며(제조업체의 지침 참조) 튜브 재료의 내경에 맞추어야 한다.
    2. 루프 두 개를 열고 튜브를 장력 밴드 시스템에서 꺼냅니다.
    3. 제조업체의 지침에 따라 스텐트를 튜브 중앙에 삽입합니다.
    4. 스텐트 없이 다른 두 루프를 컨트롤로 사용합니다. 2.2.10에 설명된 바와 같이 모든 루프를 혈액으로 채웁니다.
    5. 회전 속도를 30rpm으로 설정하고 3시간 동안 회전합니다.
  5. 온도 제어
    1. 지속 시간 동안 및 회전이 중지될 때 언제든지, 루프 내부의 혈액의 온도는 온도 조절 루프 내부의 온도계에 의해 표시됩니다. 온도를 읽으려면 회전을 멈추고 온도계로 표시된 온도를 즉시 읽으십시오.

3. 혈액 샘플 처리

  1. 회전 후 루프가 루프를 여는 동안 유출을 방지하여 루프의 바닥에 혈액이 축적될 수 있도록 상향 위치에서 2분 동안 랙에 서게 하십시오.
  2. 정적인 조건에 남아 있는 혈액검사: 이 혈액이 응고되는 경우에, 부적절한 분리는 궁극적으로 의심됩니다. 이 경우, 다른 혈액 기증자와도 바람직하게는 실험을 반복한다.
  3. 조심스럽게 랙에서 루프를 꺼내. 커넥터를 열고 혈류가 10mL 유리 비커로 흘러 들어갑니다.
  4. 중복으로 실행되는 튜브에서 혈액을 풀.
  5. 1.5 및 1.6에 기술된 것과 동일한 기증자로부터 기준선 분석을 위해 신선한 혈액을 그립니다.
  6. 구연산 나트륨 혈액의 수집
    1. 구연산 나트륨 혈액의 수집을 위해, 구연산 나트륨 관에서 수집된 111 μL 나트륨 구연산용액으로 각각 4개의 1.5mL 튜브를 채우고, 구연산나트륨의 3.2%의 최종 농도를 생성한다.
    2. 1.6 및 3.3에 기술된 바와 같이 유리 비커로부터 1mL의 혈액으로 각 튜브를 채웁니다.
    3. 실온에서 혈액을 유지하고 12에 설명 된 바와 같이 FACS 분석을 위해이 혈액을 사용합니다.
      참고: 다양한 실험 용 설정에 대한 루프의 길이를 변경하려면 측정량에 따라 aliquots를 올바르게 계획합니다. 모든 측정에 충분 한 루프에 혈액의 볼륨을 보장 하기 위해 실제 실험 전에 신선한 혈액으로 모든 필요한 측정을 설정 해야 할 수 있습니다.
  7. 에틸렌디아민테트라아세산(EDTA) 혈액 및 플라즈마 샘플의 수집.
    1. 혈액이 있는 각 유리 비커(1.6 및 3.3 참조)에서 4.5 ml의 혈액을 1ml EDTA 튜브로 옮킨다. 각 10ml 유리 비커에서 두 개의 EDTA 튜브를 혈액으로 채웁니다.
    2. 부드럽게 혈액을 혼합하고 얼음에 보관합니다.
    3. 2mL 잠금 원심분리 관으로 혈액 2mL를 전송하고 5에 설명된 바와 같이 혈액 세포 수 및 무료 헤모글로빈 측정을 위해 이 혈액을 사용합니다. 그리고 6.
    4. 20 분 동안 3,500 x g에서 나머지 혈액을 원심 분리합니다.
    5. 500 μL 알리쿼트에서 상체에서 플라즈마를 조심스럽게 수집하고 -80 °C에서 즉시 동결하십시오.

4. 전자 현미경 검사 및 μCT 이미지 스캔

  1. 혈액 샘플 처리 후, 2.3에서 설명한 대로 제조된 비워진 루프를 각각 10mL의 인산염 완충식식염수(PBS)로 헹구는다.
  2. 각 튜브의 각 끝에서 메스로 1cm 길이의 샘플을 조심스럽게 잘라냅니다.
  3. 2% 글루타랄데히드 용액에서 4°C에서 하룻밤 동안 시료를 배양합니다.
    주의: 알데히드 증기의 흡입은 콧물 광석 의 지속적인 답체 및 기도 자극과 같은 비강 증상을 유발할 수 있으며 피부와의 접촉으로 피부염이 발생할 수 있습니다. 알데히드는 장갑, 보호 가운, 안전 고글을 착용하는 동안 연기 후드로 처리해야합니다.
  4. PBS로 시료(3회)를 헹구는다.
  5. 1% 용액을 탈수에 osmium 테트산화물(OsO4)의용액을 분해된 물에 준비하고 실온에서 15분 동안 시료를 배양합니다.
    주의: OsO4는 강한 산화제이며, 빛에 노출되어 감소될 수 있다. 준비 중 감소를 피하기 위해, 갈색 유리 병에 OsO4를 저장합니다. OsO4는 매우 휘발성이며, 연기는 눈, 코 및 목에 독성이 있습니다. 항상 연기 후드 아래에서 작동하고 장갑을 사용하고 옷을 보호하여 신체의 일부가 OsO4에노출되지 않도록합니다. 폐기물 처리 및 보관 처리에 관한 교육기관의 지침에 문의하십시오. 일반적으로 OsO4는 몇 달 동안 보관할 수 있지만, OsO4는 누출된 연기가 있는 동안 냉장고의 내부 표면과 내용물에서 탈색할 수 있기 때문에 테플론 라이너와 건조기가 있는 특수 유리 병이 필요합니다.
  6. 샘플을 꺼내서 새로운 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고 PBS로 샘플을 3번 헹구십시오.
  7. 다양한 농도의 일련의 에탄올 준비(25%, 50%, 75%, 95%, 100%)
  8. 에탄올의 탈수 샘플: 각각 25%, 50%, 75%, 90%, 30분 100%로 20분 동안 배양합니다.
  9. 100% 에탄올 에서 샘플을 채취하고 실온에서 밤새 공기를 건조시키십시오.
  10. 5kV의 가속 전압과 X 선 μCT 스캐너로 스캐닝 전자 현미경의 샘플을 검사합니다.

5. 혈액 세포 수

  1. 3.7.3에 기술된 바와 같이 얻은 EDTA 혈액의 2mL를 복용하십시오.
  2. 튜브를 자동화된 혈액학 분석기에 삽입하고 제조업체의 지침을 따릅니다.

6. 플라즈마에서 무료 헤모글로빈 (fHb)의 측정

  1. 3.7.5에 기재된 바와 같이 얻어진 각 조건으로부터 1개의 플라즈마 샘플을 해동한다. 해동 후 얼음에 보관하십시오.
    참고: 항상 37°C의 수조에서 냉동 플라즈마 샘플을 해동하고 즉시 얼음으로 옮겨 물을 함유하여 온도를 낮춥춥습니다. 이것은 해동 하는 동안 혈액 구성 요소의 활성화를 피하기 위해 중요 하다.
  2. fHb 시약을 사용하고 제조업체의 지침을 따르십시오. 개봉 후 오염을 피하고 직접 광 (태양, 자외선)으로부터 시약을 보호하십시오.
  3. 1:5 희석과 함께 파이펫 팅 방식(제조업체의 지침 참조)을 사용합니다.
  4. 1.6mL 세미 마이크로 큐벳에 헤모글로빈 시약의 1000 μL을 추가합니다. 이 큐벳을 사용하여 빈 값을 결정합니다.
  5. 다른 세미 마이크로 큐벳에 헤모글로빈 시약의 1000 μL과 플라즈마 샘플의 250 μL을 추가합니다.
  6. 반응 혼합물을 반복적으로 채우어 파이펫을 철저히 세척하여 두 큐벳의 내용물을 혼합하고 실온에서 최소 3분 이상 배양합니다.
  7. 빈 시약으로 fHb 시약에 대한 샘플의 소멸 (E)을 결정합니다. 샘플의 fHb 농도(mmol/l)를 계산합니다: E540-E680 x 0.452.

7. FPA 측정

  1. 3.7.5에 기술된 바와 같이 얻어진 각 조건으로부터 플라즈마 샘플을 해동하고 해동 후 얼음에 저장한다.
  2. FPA 엘리사 키트를 사용하고 제조업체의 지침을 따르십시오.

8. sC5b9 의 측정

  1. 3.7.5에 기술된 바와 같이 얻어진 각 조건으로부터 플라즈마 샘플을 해동하고 해동 후 얼음에 저장한다.
  2. sC5b-9 ELISA 키트를 사용하고 제조업체의 지침을 따르십시오.

9. PMN 의 측정

  1. 3.7.5에 기술된 바와 같이 얻어진 각 조건으로부터 플라즈마 샘플을 해동하고 해동 후 얼음에 저장한다.
  2. PMN-엘라스테E ELISA 키트를 사용하고 제조업체의 지침을 따르십시오.

10. TNF 측정

  1. 마이크로 플레이트는 ELISA를 실행하기 하루 전에 코팅해야합니다. 코팅의 경우, 모든 우물에 100 μL의 포획 항체 용액을 추가하고, 밀봉 플레이트를 밀봉하고 2°C-8°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
  2. 3.7.5에 기재된 바와 같이 얻어진 각 조건으로부터 1개의 플라즈마 샘플을 해동한다. 해동 후 얼음에 보관하십시오.
  3. TNF ELISA 키트를 사용하고 제조업체의 지침을 따르십시오.

11. IL-6 의 측정

  1. 마이크로 플레이트는 실험 하루 전에 캡처 항체로 코팅되어야 합니다. 코팅의 경우, 세트와 함께 제공되는 마이크로 플레이트의 모든 우물에 100 μL의 캡처 항체 용액을 추가하고 4 °C에서 하룻밤 동안 인큐베이션합니다.
  2. 3.7.5에 기재된 바와 같이 얻어진 각 조건으로부터 플라즈마 샘플을 해동한다. 해동 후 얼음에 보관하십시오.
  3. IL-6 ELISA 키트를 사용하고 제조업체의 지침을 따르십시오.

12. FACS 분석

  1. 1x PBS의 488mL에 태아 종아리 혈청 10mL및 EDTA 용액 2mL(0.5M)를 추가하여 500mL의 FACS 버퍼를 준비한다. FACS 버퍼는 4°C에서 4주 동안 저장할 수 있습니다.
  2. 각 염색 절차(단핵혈소판 응집체(MPA), 혈소판 활성화(PA), 백혈구 인테그린(LI)에 대해 구산나트륨 혈액의 100μL(참조 3.6.3 참조)을 사용한다.
  3. 각 샘플에서 5mL FACS 튜브로 혈액의 파이펫 100 μL. 각 샘플에서 MPA(단화 혈소판 응집) 패널, PA(혈소판 응집) 패널 및 LI(백혈구 인테그린) 패널을 사용하여 항체 염색 및 라벨을 위한 3개의 튜브를 준비한다.
  4. 나머지 4개의 샘플을 5mL FACS 튜브 에 혼합합니다. 스테인드 및 형광을 뺀 하나(FMO) 컨트롤에 이 믹스를 사용합니다.
  5. 혼합 시료 혈액의 100 μL을 각 튜브에 배관하여 6개의 FACS 튜브를 준비합니다. 3 튜브를 스테인드되지 않은 튜브로 표시하고 3 개의 튜브를 FMO-CD41, FMO-CD62P 및 FMO-CD162로 레이블을 지정합니다.
  6. 4% 파라포름알데히드 용액의 100 μL을 추가하고 실온에서 어둠 속에서 15분 동안 배양합니다.
    주의: 파라포름알데히드는 피부와 눈에 독성이 있습니다. 흡입시 심각한 폐 자극을 유발할 수 있으며 장시간 노출 후 폐 손상을 입을 수 있습니다. 더욱이, 발암물질 및 생식 독소로 분류된다. 항상 장갑과 안전 안경을 착용하고 연기 후드 아래에서 작동합니다.
  7. 각 튜브에 1mL의 워시 버퍼를 추가하고 원심분리기는 287 x g에서 5분 동안 추가합니다. 상체를 버리고 두 번 세척 단계를 반복하십시오.
  8. 적혈구(RBC) 용해의 경우, 1x 버퍼 RBC 용해 버퍼(희석 10x RBC 용해 버퍼를 탈온수에 희석)의 1mL을 넣고, 어둠 속에서 RT에서 5분 동안 천천히 배관하여 혼합합니다.
  9. 단일 얼룩에 대한 보상 구슬을 준비합니다. FACS 버퍼의 1mL에 각 양수 및 음수 구슬 의 4 방울을 추가합니다. 소용돌이철에 100 μL의 구슬 용액을 1mL FACS 튜브에 추가합니다.
  10. CD14-FITC, CD41-BV421, CD45-APC 및 CD62P-PE로 구슬과 라벨로 4개의 튜브를 준비합니다. 각 튜브에 FACS 버퍼 1mL을 추가하고 원심분리기는 287 x g에서 5분 동안 추가합니다. 상체를 버리고 얼음을 유지하십시오.
  11. RBC 리시스 후 각 튜브에 FACS 버퍼 1mL을 추가하고 12.7에 설명된 대로 세척합니다. 상신을 폐기하십시오.
  12. 항체 칵테일 준비:
    1. MPA 패널: CD45-APC 4μL, CD14-FITC 4 μL, CD41-BV421 ~ 388 μL의 4μL을 추가합니다.
    2. PA 패널: CD41-BV421의 1.6 μL과 12μL의 CD62P-PE를 FACS 버퍼의 386.4 μL에 추가합니다.
    3. LI 패널: CD45-APC 4μL과 8 μL의 CD162-BV421 ~ 388 μL의 FACS 버퍼를 추가합니다. 얼음을 유지합니다.
  13. 단일 얼룩 준비: CD14-FITC, CD41-BV421 및 CD45-APC에 대해 각각 0.5 μL에서 499.5 μL의 FACS 버퍼를 추가합니다. CD62P-PE의 경우 FACS 버퍼의 499.7 μL에 0.3 μL을 추가합니다. 얼음을 유지합니다.
  14. FMO 제어 준비: (i) MPA 패널(FMO-CD41): 1 μL CD14-FITC 항체와 CD45-APC 항체 1μL을 98 μL FACS 버퍼에 추가합니다. (ii) PA 패널(FMO-CD62P): FACS 버퍼의 CD41-BV421 ~ 99.6 μL의 0.4 μL을 추가합니다. (iii) LI 패널(FMO-CD162): FACS 버퍼의 99μL에 CD45-APC 1μL을 추가합니다. 얼음에 FMO 컨트롤을 유지합니다.
  15. 소용돌이 항체 칵테일과 12.3에 설명된 각 라벨튜브(MPA, PA 및 LI 패널)에 각각12.12로 제조된 바와 같이 각 항체 칵테일의 100 μL을 추가하고 위아래로 배관하여 부드럽게 섞는다. 어둠 속에서 RT를 유지합니다.
  16. 소용돌이 단일 얼룩 항체 희석제 및 12.13에 제조된 단일 얼룩 항체 희석제의 100 μL을 첨가한다. 12.7에 설명된 바와 같이 구슬이 있는 각각의 각 표지된 튜브에, 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 섞는다. 어둠 속에서 RT를 유지합니다.
  17. 소용돌이 FMO 항체 칵테일과 12.14에 준비된 각 FMO-1 항체 칵테일의 100 μL을 추가합니다. 각각의 표지된 튜브(FMO 컨트롤)에 대해 12.5에 기재된 바와 같이. 위아래로 파이프를 섞어 부드럽게 섞는다. 어둠 속에서 RT를 유지합니다.
  18. 어둠 속에서 RT에서 30 분 동안 염색 하는 항체와 모든 튜브를 배양.
  19. 스테인드 컨트롤(12.4 참조)을 위해 세 개의 튜브를 가져 와서 FACS 버퍼의 250 μL에서 펠릿을 다시 일시 중지합니다. 얼음을 유지합니다.
  20. 인큐베이션 시간 후, 12.7에 설명된 바와 같이 FACS 버퍼로 스테인드 컨트롤을 제외한 모든 튜브를 한 번 세척합니다. FACS 버퍼의 250 μL에서 펠릿을 다시 중단하고 유동 세포계에 대한 데이터를 수집합니다.
  21. STAINED 셀을 사용하여 부정적인 설정 및 보상 마우스 구슬을 사용하여 FACS 소프트웨어의 양수 설정에 적합합니다. 또한 FMO를 사용하여 MPA 패널에서 FMO-CD41이 사용되는 게이팅 전략을 제어하고, FMO-CD62P는 PA 패널에 사용되며 FMO-CD162는 LI 패널에 사용됩니다.
  22. FACS의 튜브당 거의 0.5 x 106 - 0.25 x 106 이벤트를 획득하십시오. 데이터를 저장하고 분석 소프트웨어(버전 9.9.6)로 분석합니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FACS 플롯을 제외한 모든 데이터는 통계 소프트웨어로 분석되었습니다. FACS 플롯은 유동 세포측정 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다.

전혈구 수의 분석은 모든 시험된조건(도 2)의적혈구에 대하여 어떤 유의한 차이를 보여주지 않았다. 그러나, 혈소판및 백혈구는 라텍스 단에서 급격하게 감소되어 라텍스의 생체 적합성이 매우 좋지 함을 나타냅니다. 이는 라텍스 군에서 자유 헤모글로빈의 수치가 증가하여 밑줄이 더 강조되어 라텍스 군을 제외하고는 다른 혈관 장치 나 조건 중 어느 것도 광범위한 용혈(도2)을초래하지 않는다는 사실을 나타낸다. 또한, 코팅된 PVC 튜브, 폴리PVC 및 hepPVC뿐만 아니라 테스트된 스텐트는 혈소판 및 백혈구 손실을 통해 혈전증으로 이어지지 않았으며, 라텍스는 가장 높은 혈소판과 백혈구 손실을 나타내었으며, 이어서 코팅되지 않은 PVC 튜브가 감소추세를 보였다.

모든 테스트된 혈관 장치는 응고 시스템(FPA) 및 보완 성분(sC5b-9)의 활성화가 증가했지만, hepPVC 루프는 특별히 폴리PVC루프(그림 3)에비해 FPA 및 sC5b-9의 감소된 수준에 대한 추세를 나타냈다. 흥미롭게도, 코팅되지 않은 PVC 및 갭 루프는 통계적 유의수준에 도달하지는 않았지만 폴리PVC에 비해 FPA 수준이 낮았습니다. 그럼에도 불구하고 라텍스 루프는 기준선 및 정적 조건에 비해 FPA 의 수치가 크게 증가했습니다.

전혈세포 수에 따라 라텍스 루프는TNF, IL-6 및 PMN 엘라스타제(도4)의최고 수준을 나타내었으며, TNF 및 IL-6(도 4A,B)의관점에서 나머지 그룹과 비교했을 때 통계적 유의수준에 도달하는 반면 PMN 엘라스테(그림4C)의관점에서 정적 및 기준 조건에 도달하였다. 이러한 결과는 라텍스에 의한 백혈구의 강력한 활성화를 나타낸다. 활성화 마커의 기준선 수준은 항상 혈액의 적절한 분리를 나타내는 정적 조건에 필적했다.

흥미롭게도, 갭 유도 루프에 대한 혈소판 및 백혈구 수는 응고 시스템(FPA)과 백혈구(PMN 엘라스타제)의 적당한 활성화로 약간 감소되었지만, 부적절한 루프 폐쇄는 코팅되지 않은 거친 절단 표면에 대한 흐류 난기류및 혈액 접촉으로 인해 매크로로 볼 수 있는clot(도1)로이어졌다. 전체 스플라이스 표면에 대한 혈전 및 분포는 μCT 및 SEM 이미지로 분명하게 드러났으며, 루프가 외부 클로징 장치로 닫히면 혈전이 발견되지 않았으며 루프 엔딩(그림5).

혈소판 특이적 마커, CD41 및 혈소판 활성화 마커 CD62P로 염색된 숙주 혈액 세포의 흐름 세포 측정 분석은 도 6A, B에도시된다. 여기서, 라텍스 튜브는 혈액 혈소판에 CD62P에 대한 매우 높은 중앙위형 형광 강도(MFI)를 나타내고, 그 다음에는 스텐트가 뒤따랐고, 헤파린 코팅 폴리PVC 튜브는 폴리PVC 튜브의 항혈전 특성을 나타내는 혈소판의 최소한의 활성화를 나타냈다. 더욱이, 백혈구는 CD45 및 SSC(측면 산란) 기반의 과립(i) 과립세포에 기초하여 분류되었다; (ii) 단핵구 및 (iii) 림프구(도7)와CD162 +인테그린의 발현은 혈소판(24)에서 CD62P와 상호작용하는 것으로 알려진백혈구의 각 하위 집단에서 검출되었다. 라텍스 루프의 과립구와 림프구에서 통합 된 표현이 크게 감소된 것으로 나타났습니다. 이 결과는 라텍스 루프에서 백혈구의 총 주파수의 낮은 수준에 부합하였다(그림2). 일반적으로, 통합 수준은 과립구 및 림프구에 비해 단핵구 사이에서 더 높았으며, 활성 혈소판과의 단일세포 상호 작용가능성을 나타낸다. 이와 관련하여, 단핵혈소혈소체는 또한 CD14(단화 마커로) 및 CD41(혈소판 마커로서)로 혈액세포를 염색하고 궁극적으로 이중 양성 세포 즉 CD14+CD41+MPA(도8)를식별하여 평가하였다. 여기서, 우리는 스텐트 그룹이 MPA에서 CD41 발현의 가장 높은 수준을 나타내고, 라텍스 그룹이 그 뒤를 이어, 단핵구의 빈도감소에도 불구하고 MPA를 형성하는 경향이 증가했음을 나타내는 것으로 나타났습니다(&1%) 라텍스 루프에서.

figure-results-1
그림 1: 체외 혈역학 루프 모델 및 수정 사항의 개요입니다. (A)외부 루프 닫기 시스템으로 갭 실험을 위한 루프, 스플라이스에 틈이 남지 않는다. (B)폴리PVC 코팅 PVC 튜브 및 내부 스텐츠로 만든 루프 (화살표). (C)라텍스 튜브로 만든 루프. (D)외부 루프 닫기 시스템이 없는 갭 실험을 위한 루프가 튜브 엔딩(arrow)사이의 간격을 두고 있다. (E)루프는 수조 내부의 루프 요람에 배치하고 피로 가득합니다. (F)회전 후 스플라이스(arrow)에서 간격을 형성한 혈전. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 혈액 세포 수 및 혈장 헤모글로빈에 대한 결과. (A)적혈구 수. (B)혈소판 수. (F)백혈구 수. (D)프리 플라즈마 헤모글로빈. 결과는 라텍스의 가난한 생체 적합성을 나타내며 과도한 용혈을 초래합니다. 데이터는 평균 값으로 표시됩니다. 오류 막대는 SEM. n=1을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 응고 및 보완 시스템의 활성화를 위한 결과. (A)응고 시스템 활성화, 피브리노펩타이드 A(FPA)(B)보완 시스템 활성화의 수준에 의해 측정된, sC5b-9의 수준에 의해 측정. 라텍스 튜브는 FPA의 상당한 높은 수준을 불러 일으켰지만, 모든 테스트 된 재료에 대한 보완 활성화가 강했습니다. 데이터는 평균 값으로 표시되며 오류 막대는 SEM을 나타냅니다. * p&0.05, n=1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 백혈구 활성화 마커. (A)종양 괴사 인자 알파(TNF). (B)인터류빈 6 (IL-6)(C)PMN 엘라스테아제. 결과는 분석된 마커의 높은 수준으로 인해 백혈구의 활성화가 증가하고, 스텐트 루프가 뒤따랐으며, 이는 PMN 엘라스타제에 대한 수치가 증가했지만 TNF 또는 IL-6은 아니라는 것을 나타낸다. 데이터는 평균 값으로 표시되며 오류 막대는 SEM을 나타냅니다. * p&0.5; **p&0.01, n=1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: 루프의 스플라이스의 이미징. (A)부적절한 폐쇄(gap)를 가진 루프의 컴퓨터 단층 촬영(μCT)μ. 빨간색 영역은 혈전 물질을 나타냅니다. (B)튜브의 발광 측 렌더링. 직사각형 선택은 전자 현미경 검사(SEM)(C)를스캔하는 영역을 나타낸다. (D)외부 루프 닫기 장치와 스플라이스에서 간격이 없는 루프의 μCT 및(E)발광 표면의 렌더링 및 뷰. 혈전 물질은 발견되지 않았습니다. (F)직사각형 선택의 SEM 이미지(E). 절단 표면에서 혈전 물질이 발견되지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 6: 혈소판 활성화를 위한 FACS 플롯(CD62P). (A)혈액 CD41+ 혈소판을 나타내는 대표적인 FACS 플롯(기본 상태). (b)정전기 RT 및 기준조건에 비해 다양한 유형의 혈관 장치의 평균 형광 강도(MFI)에 의해 반사되는 혈소판 활성화 상태를 나타내는 그래프. 데이터 막대는 단일 측정의 데이터를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-7
그림 7: 백혈구 에스테그린(CD162)에 대한 FACS 플롯. (A)대표적인 FACS 플롯(기본 상태)은 정적 및 기준 조건에 비해 다양한 유형의 혈관 장치의 백혈구 CD162 +인테그린 평균 형광 강도(MFI)를 나타내는 혈액 CD45+ 백혈구 및 하위 집단(B) 그래프를 나타낸다. 데이터 막대는 단일 측정의 데이터를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-8
그림 8: 혈소판 단화 골재에 대한 FACS 플롯(CD41/CD14). (A)대표적인 FACS 플롯(기본 상태)은 혈액 단핵구(CD45 +/CD14+),혈소판(CD41+)및 단핵혈소 집합체(CD41+/CD14+)(B)CD41+평균 형광 강도(MFI)를 나타내는 다양한 혈관 기재에 대한 단극식 및 비교된 단정체 조건에 대한 변성 강도(MFI)를 나타내는 게이팅을 나타내는 대표적인 FACS 플롯(기본 상태)을 비교하였다. 데이터 막대는 단일 측정의 데이터를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구는 시험관 내 혈역학 루프 모델이 ISO 10993-4 표준에 따라 의료 기기의 체외 혈액 호환성을 테스트하는 신뢰할 수있는 방법을 제공하는 것으로 나타났습니다.

프로토콜의 중요한 단계는 혈액의 도면과 혈액으로 관을 채우는 포함, 어디 과도한 진공 또는 동요 처리 절차에 의해 활성화에서 혈액 구성 요소를 방지하기 위해 피해야한다. 더욱이, 플라즈마 샘플을 즉시 동결하고 해동 후 얼음에 보관하는 것이 매우 중요하며, 보완 및 응고 시스템 활성화는 샘플을 실온상온에 오래 유지함으로써 변조될 수 있기 때문에.

이 모델은 다른 시험관 내 모델과 비교할 때 장점과 단점을 모두 가지고 있기 때문에 실험을 설계하는 동안 여러 가지 요소를 고려해야합니다.

첫째, 루프는 다양한 실험 설정에 맞게 길이와 직경이 다양할 수 있습니다. 설정이 다양한 내부 직경의 대조 튜브를 포함하는 경우, 직경의 차이가 다른 전단 힘을 초래할 것이라는 점을 명심하여 응고 및 보완 캐스케이드7에영향을 미칩니다. 둘째, 이 실험에서 회전 속도가 30rpm으로 설정되었습니다. 이것은 인간 관상 동맥 우회 접목 25에 있는 혈류 속도에 필적하는 대략25cm/s의 혈류귀 귀착될 것입니다. 루프의 회전에 의해 생성되는 균주 속도는 세포 및 세포 없는 단백질을 포함한 혈액 성분의 생화학적 폭포를 시작하는 주요 파라미터입니다. 그러나 혈액은 비 뉴턴 유체이기 때문에, 균주 율은 또한 루프10에닫힌 튜브의 길이각각, 튜브 곡률에 의해 영향을 받을 것이다. 회전 속도 또는 루프 크기가 변경될 때마다 스트레인 속도와 회전 속도 간의 상관 관계가 선형이 아니라는 점을 고려해야 합니다. 회전 속도와 균주 속도 사이의 상관 관계는 오늘까지 충분히 검사되지 않으며 이러한 특정 매개 변수(10,26,27)를조사하기 위해 추가 연구가 필요합니다. 그러나, 라미나르 경계층을 위한 모델을 기반으로, 주어진 튜브 직경 5mm 및 25cm/s의 회전 속도, 벽 전단 응력 (WSS)의 대략적인 추정은 혈액 밀도가 1060 kg * m -3로 추정되고 기네티컬 점도가 0.0025 파스칼 * 28로 설정될 때 튜브의 벽에 1,00-0,01mm의 거리에 대해2.20-22.00파스칼 사이의 값을 나타냅니다. 흥미롭게도, 또한 인간 관상 동맥의 곡률에서 유동 역학의 보다 상세한 계산 분석은혈액(30)의속도, 밀도 및 점도에 대한 대략 비교 가능한 파라미터에서 11.33에서 16.77 파스칼에 이르는 WSS 값을 보여주었다.

이러한 제한 외에도 제시된 루프 모델은 인간 혈관 시스템의 내래 혈압 비율을 모방하지 않는 압력이 적은 시스템입니다.

다음 중요한 제한은 혈액이 루프 내부의 공기와 접촉하여 추가 간섭을 가져온다는 것입니다. 이러한 혈액 공기 접촉은 튜브의 가스 투과성과 혈액으로 채우는 동안 루프 내부의 공기 의 유지를 포함하는 두 가지 매개 변수에 의해 영향을 미칩니다. 모든 튜브 물질은 튜브 내부의 가스 농도에 상당한 변화를 초래할 수있는 특정 가스 투과성을 가지고 있습니다. 일부 저자들은 혈액 성분의 활성화에 대한 가스 투과성의 결과 효과가 불분명한31로남아 있다고 명시하고 있지만, 혈액 응고제의 기능은 pH-shift에 매우 민감하며, 이는CO2 확산32,33,34로인해 발생할 수 있다. 여기에서, 우리는 초보적인 혈액 관류의 임상 시나리오에 필적하는 실내 공기 조건하에서 혈액 관의 생체 적합성을 시험했습니다. 제시된 모델의 향후 개선을 위해CO2 인큐베이터에서 전체 모델의 배양및 인큐베이션 전후의 혈액 pH 유효성 검사를 수행하는 것이 이 모델을 더욱 표준화하는 데 유용할 수 있다.

또한, 루프 내부의 혈액-공기 계면은 혈장 단백질과 혈중 분획의 활성화로 이어질 수있다(35,36). 튜브 내부의 공기가 없는 롤러 펌프 구동 장치는 혈액-공기 인터페이스의 문제를 피할 수 있지만, 여기에 제시된 루프 모델에 비해 헤모글로빈의 상당한 높은 수준으로 혈액 세포에 손상을 유도하고, 혈장의 헤모글로빈은 ELISA16에서테스트된 유리사의 감도를 방해할 수 있다. 이 연구에서는 헤파린 코팅 PVC 튜브와 같은 생체 적합성 물질을 사용하는 동안 루프 모델 자체의 용혈 효과가 최소화된 것으로 나타났습니다. 따라서, 모델은, 한편으로는, 펌프 구동 모델에 비해 과도한 세포 손상을 일으키지 않고, 한편으로 는 혈액 공기 접촉으로 인한 혈장 단백질을 유도한다. 참고로, 반 오베렌 등은루프(16)내부의 공기를 피하는 볼 밸브 기반 루프 모델을 개발했다. 본 제시된 루프 모델에 대한 이러한 유망한 대안은 혈액-공기 인터페이스의 문제를 극복할 수 있지만, 여기에 제시된 모델에 비해, 혈소판 접착력은 볼 밸브 기반 루프 모델에 대해 여전히 높다.

정적 제어와 관련하여 유리 자체가 응고시스템(37)의강력한 활성제로 나타났다는 점에 유의해야 합니다. 그러나, 제시된 설정에서, 유리 비커(static control)에서의 인큐베이션은 혈액을 끌어낸 후 기준선 수준에 비해 응고 시스템의 과도한 숙주 세포 활성화 또는 활성화로 이어지지 않았다. 결론적으로, 정적 제어가 높은 수준의 활성화를 표시하는 경우 폴리 프로필렌 튜브와 같은 용도로 사용하는 것이 유용할 수 있습니다.

루프 기반이든 펌프 구동 모델이든 관계없이, 이러한 체외 모델은 주로 이상적인 혈액 접촉 표면인 온신구에 의해 주로 기여하는 본격적인 생물학적 상호 작용이 완전히 결여되어 있습니다. 이 문제의 근거는 스텐트와 같은 의료 기기가 시험될 때, 활성화 및 혈장 단백질의 관점에서, 내피 성분과의 상호 작용 중에 다른 결과를 부여할 수 있을 때 더 분명합니다. 이것은 순환 시스템을 모방하는 시험관 내 시스템에서 논의된 모든 것의 주요 단점이라고 선언합니다. 따라서,이 문제를 극복하기 위해, 완전히 내피로 덮여 새로운 미세 유체 시스템은 엄청난 관심을 얻고있다, 그러나 그럼에도 불구하고 여기에 제시 루프 모델에 비해, 그들은 여전히 작은 혈액 볼륨과 최소 유량을 수용제한38,39

따라서, 우리는 챈들러 루프 모델이 심혈관 연구 분야에서 혈관 의료 기기의 혈액 생체 적합성에 대한 표준화된 테스트를 수행하기위한 견고한 모델로 남아 있다고 결론을 내립니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

펀더 [에보 쿤즈 인더스트리 디자인, 임 덴텔 17, 72639 니우펜, 독일]은 이 원고 [맥스 바커]의 저자에게 소모품 및 출판 수수료의 형태로 재정 지원을 제공했다. 펀더는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 추가적인 역할을 하지 않았습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 엘레나 덴크스 씨의 기술 지원에 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
5ml 튜브, K3 EDTASarstedt32332
안티 마우스 Ig, κ/음성 제어 보상 입자 세트Becton Dickinson BioSciences552843
APC 안티 휴먼 CD45 항체BioLegend368512
BD LSR Fortessa II 세포 분석기Becton Dickinson647465
BD Vacutainer Citrate TubesBecton Dickinson369714
BD Vacutainer 일회용 홀더Becton Dickinson364815
BD Vacutainer Safety-Lok 버터플라이 캐뉼라 21 GBecton Dickinson367282
비커 유리 ROTILABO 쇼트 10 mlCarl Roth GmbH + Co. KGX686.1
비커 유리 ROTILABO 쇼트 50 mlCarl Roth GmbH + Co. KGX688.1
Brilliant Violet 421 anti-human CD162 항체BioLegend328808
Brilliant Violet 421 anti-human CD41 항체BioLegend303730
원심분리기 ROTINA 420 | 420 RHettich Zentrifugen4701 | 4706
원심분리기 튜브, 50 mlGreiner Bio-One GmbH227261
CHC Super modified, 5mm PVC tubingCorline Sweden1807-148hepPVC 튜브
원형 정밀 절단기ebo kunze industriedesign, Neuffen, 독일CLS 007-20
폐쇄 장치 (텐션 밴드 포함)ebo kunze industriedesign, Neuffen, GermanyCLS 008-20
전기 테이프 스카치 슈퍼 33 +VWRMMMA331933
ELISA MAX 디럭스 세트 인간 IL-6BioLegend430504
ELISA MAX 디럭스 세트 Human TNF-aBioLegend430204
Eppendorf Pipette Research plus, 단일 채널, inkl. epT.I.P.S. 상자, 0,1 – 2,5 &마이크로; L, 회색Eppendorf AG3123000012
Eppendorf Pipette Research plus, 단일 채널, inkl. epT.I.P.S. 상자, 0,5 – 10 &마이크로; L, 회색Eppendorf AG3123000020
Eppendorf Pipette Research plus, 싱글 채널, inkl. epT.I.P.S. 상자, 10 – 100 & 마이크로; L, 노란색Eppendorf AG3123000047
Eppendorf Pipette Research plus, 싱글 채널, inkl. epT.I.P.S. 상자, 100 – 1,000 & 마이크로; L, 파란색Eppendorf AG3123000063
Eppendorf Pipette Research plus, 싱글 채널, 잉크 epT.I.P.S. 상자, 20 > 200 & 마이크로; L, 노란색Eppendorf AG3123000055
Eppendorf Pipette Research plus, 싱글 채널, 잉크 epT.I.P.S. 시료 백, 0,5 – 5 mL, 보라색Eppendorf AG3123000071
Ethylenediaminetetraacetic acid solutionSigma-Aldrich03690-100ML
FACS 튜브 폴리스티렌 5.0 ml 둥근 바닥Corning BV352052
Fetal bovine 세럼 골드 플러스바이오 셀FBS. GP.0500
FITC 항-인간 CD14 항체BioLegend367116
Fluency plus 스텐트 13.5 x 60 mmAngiomed GmbH & CoFVM14060
Free Hemoglobin fHb ReagentBioanalytics GmbH004001-0250
Gibco PBS 정제Thermo Fisher Scientific18912014
장갑 Vasco Nitril white LB. Braun Deutschland GmbH & Co.KG9208437
장갑 Vasco Nitril white MB. Braun Deutschland GmbH & Co.KG9208429
글루 타르 알데히드 25 % aequous 용액시그마 AldrichG6257-100ML
헤파린, 25.000 IE 5 mlRotexmedica, Trittau, GermanyPZN 3862340
인간 피브리노펩티드 A (FPA) ELISA 키트H & ouml; lzel Diagnostikaabx253234
Kodan 팅크 포르테 무색Schü LKE & Mayr GmbH104012
라텍스 튜브, ID 5mmLaborhandel24 GmbH305 0507
루프 스탠드ebo kunze industriedesign, Neuffen, 독일CLS 009-20
Medimex 정맥 지혈대 클래식ROESER Medical GmbH310005
마이크로플레이트 리더 Infinite 200 Pro M PlexTecanTEC006418I
마이크로플레이트 쉐이커 PMS-1000i VWR444-0041
Nalgene Metric non-phthalate PVC tubing, ID 5 mmVWRNALG8703-0508PVC 튜브로 언급
NexTemp (Standard) 일회용 임상 온도계의료 지표2112-20
Nunc MaxiSorp ELISA 플레이트, 코팅되지 않은BioLegend423501
Osmium tetroxide 용액Fisher Scientific
10256970 파라포름알데히드 용액, PBS ThermoFisher ScientificAAJ19943K2
PE anti-human CD16항체BioLegend302008
PE anti-human CD62P (P-Selectin) 항체BioLegend304906
피펫 컨트롤러, pipetusVWR612-1874
피펫 팁 epT.I.P.S. 0.2 - 5 mlOMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG5186480
피펫 팁 epT.I.P.S. 표준 0,1 - 10µ lTh. Geyer GmbH & Co. KG9409410
피펫 팁 epT.I.P.S. 표준 2 - 200µ lTh. Geyer GmbH & Co. KG0030 000.870
피펫 팁 epT.I.P.S. 표준 50 - 1000µ l blueTh. Geyer GmbH & Co. KG0030 000.919
PMN (호중구) Elastase Human ELISA KitFisher ScientificBMS269
프로브 스탠드 ROTILABO 콤비CARL ROTHK082.1
회전 장치 용 랙 (가변 슬롯 너비 3/8 '')ebo kunze industriedesign, Neuffen, GermanyCLS 011-20
RBC 용해 버퍼 (10X)BioLegend420301
시약 저장 탱크VWR613-1184
회전 장치ebo kunze industriedesign, Neuffen, GermanyCLS 010-20
Safe-Lock 마이크로 시험관 0.5 mlOMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG5409320
Safe-Lock 마이크로 시험관 1.5 mlOMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG5409331
sc5b9 Human ELISA KITTECOmedicalGroupA029
메스 no 10Fisher ScientificNC9999403
주사 전자 현미경 XL30 ESEM-FEGPhilipsn.a.
나사 상단 병 ROTILABO 투명 유리, 1000ml, GL 45Carl Roth GmbH + Co. KGX715.1
나사 상단 병 ROTILABO 투명 유리, 500ml, GL 45Carl Roth GmbH + Co. KGX714.1
세미 마이크로 큐벳 1.6 mlSarstedt67.746
혈청학적 피펫 10.0 mlCorning BV4488
혈청학적 피펫, 25.0 mlCorning BV4489
혈청학적 피펫, 5.0 mlCorning BV4487
실리콘 튜브, 내경 8 mm, 외경 12 mmVWRBURK8803-0812
TMB 기질용Biozym
면봉, 멸균Fuhrmann GmbH32055
주사기, 10mlBecton Dickinson300296
CLS 020-20
tert-Butanol, 99.5%, 엑스트라 퓨어, ACROS OrganicsFisher Scientific10000730
TMB 기판 세트BioLegend421101
Trillium PVC 튜브, 5mm IDMedtronic161100107100103폴리PVC 튜브라고 함
Tween 20AppliChemA4974,0250
UV-Vis Spektrometer Lambda 2Perkin Elmer33539
Vornado Mini VortexerBiozym55BV101-B-E
XN-3000 워크스테이션 혈액 분석기Sysmex Europen.a.
μ-CT Phoenix Nanotom SGE Sensing & 검사, Wunstorf, 독일n.a.
새싹 미니 원심분리기 552034 정지 솔루션 BioLegend 77316 온도 조절 수조 ebo kunze industriedesign, Neuffen, 독일

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