근적외선 광면역요법(NIR-PIT)은 항체-광흡수제(IR700Dye) 컨쥬게이트와 NIR 라이트를 활용하여 암세포를 파괴하는 신흥 암 치료 전략이다. 여기서, 우리는 생물발광 이미징을 사용하여 흉막 전파폐암 및 악성 흉막 중피종의 마우스 모델에서 NIR-PIT의 항종양 효과를 평가하는 방법을 제시한다.
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이 논문에서
요약
초록
광면역요법의 효능은 피하요법보다 치열식 마우스 모델로 보다 더 정확하게 평가될 수 있다. 흉막 보급 모델은 폐암 또는 악성 흉막 중피종과 같은 내트라토라시질환에 대한 치료 방법의 평가를 위해 사용될 수 있다.
근적외선 광면역요법(NIR-PIT)은 NIR 광에 노출된 후 광흡수제(IR700Dye)에 의한 독성과 종양 표적화 항체의 특이성을 결합한 최근 개발된 암 치료 전략이다. NIR-PIT의 효능은 다양한 항체를 사용하여 보고되고 있다; 그러나, 단지 몇몇 보고는 치열 교정 모형에 있는 이 전략의 치료 효력을 보여주었습니다. 본 연구에서는 NIR-PIT를 사용하여 치료된 흉막 전파폐암 모델의 효능 평가의 예를 시연한다.
서론
암은 수십 년간의 연구에도 불구하고 사망률의 주요 원인 중 하나입니다. 한 가지 이유는 방사선 요법과 화학 요법이 매우 침습적 인 기술이며 치료 혜택을 제한 할 수 있기 때문입니다. 덜 침습적인 기술인 세포 또는 분자 표적 치료는 증가된 주의를 받고 있습니다. 광면역요법은 면역요법과 광선요법을 결합하여 치료 효과를 시너지효과를 향상시키는 치료 방법입니다. 면역 요법은 종양 미세 환경의 면역원성을 증가시키고 면역 조절 억제를 감소시켜 종양 면역력을 향상시켜 신체에서 종양이 파괴됩니다. 광요법은 광광원과 광선의 조합으로 1차 종양을 파괴하고, 종양 세포에서 방출되는 종양 특이적 항원들은 종양 면역력을 향상시킵니다. 종양은 표적 세포에 대해 구체적이고 선택적이기 때문에 광광합성제를 사용하여 선택적으로 치료될 수 있다. 광요법의 양면에는 광역학 치료(PDT), 광열 요법(PTT), 광화학 계 치료1이포함된다.
근적외선 광면역요법(NIR-PIT)은 광화학계 치료와 면역요법1,2를결합한 최근 개발된 항종양 광요법 방법입니다. NIR-PIT은 근적외선 실리콘 프탈로시아닌 염료, IRdye 700DX(IR700....
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프로토콜
모든 생체 내 실험은 나고야 대학 동물 관리 및 사용 위원회의 실험실 동물 자원 관리 및 사용에 대한 가이드를 준수하여 수행되었습니다 (승인 #2017-29438, #2018-30096, #2019-31234, #2020-20104). 나고야 대학의 동물 센터에서 6 주 된 호모자고테 자티믹 누드 마우스를 구입하고 유지했습니다. 마우스에서 절차를 수행할 때, 그들은 이소플루란으로 마취하였다 (소개: 4-5%, 유지 보수 2-3%); 발은 마취의 깊이를 확인하기 위해 핀셋으로 눌렀습니다.
1. MAb와 IR700의 컨쥬게이션
- IR700 NHS 에스테르(66.8 mg, 34.2nmol, DMSO의 5mmol/L)를 1h에 대해 15-25°C에서 0.1 몰/L Na2HPO4(pH 8.6)로 인큐베이션멜(1 mg, 6.8nmol)을 장착했다.
- 컬럼(예: 세바덱스)을 사용하여 혼합물을 정화합니다. PBS로 컬럼을 준비하고 씻으시다. 이어서, 혼합물을 컬럼에 적용하고 정제된 IR700-공주 항체를 포함하는 방울을 수집한다. 이러한 IR700-공주 항체는 항체 광합성기 컨쥬게이트(APC)라고 한다.
- APC에서 단백질 ....
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결과
안티 포도플라닌 항체 NZ-1은 NZ-1-IR700을 생성하기 위해 IR700과 결합되었다. 우리는 SDS-PAGE(도 8)에NZ-1 및 IR700의 바인딩을 확인했다. 루시파아제 발현 H2373(H2373-luc)은 악성 중피종 세포(H2373)를 루시파아제유전자(10)로이식하여 제조하였다.
우리는 8-12 주 된 여성 homozygote athymic 누드 마우스를 마취하고 흉부 구멍에 105 H2373 luc 세포를 × 주입했습니다. 마우스내 종양 세포를 주입하는 날은 1일로 표시되었다.
4일째에 BLI 및 DLIT는 D-루시페린(15 mg/mL, 200 μL)을 주사한 후, 흉부 캐비티에서 충분한 루시파아제 활성을 가진 마우스를 추가 연구를 위해 선택하였다(그림9).
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토론
본 연구에서는, MPM의 흉막 보급 모델에 대한 NIR-PIT의 치료 효과를 측정하는 방법을 시연하였다. 매우 선택적 세포 살인은 NIR-PIT로 수행되었다; 따라서, 정상 조직은 거의손상되지 않았다 23,24,25. 이러한 유형의 선택적 세포 살인으로 NIR-PIT은 보급 된 모델9,26에서안전하다는 것이 입증되었습니다. 그러나 일부 단계에서는 대체 방법이 가능합니다. 흉막보급모델(27,28,29,30).......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na 페놀 함유 용액 세포 | 배양을 위한 | Wako | 209-016941 |
| 1mL 주사기 | TERUMO | SS-01T | 마우스 실험용 |
| 30G 바늘 | Nipro | 1907613 | 마우스 실험용 |
| BALB/cSlc-nu/nu | 일본 SLC | ||
| Collidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | 사용 겔 단백질 염색용 |
| Coomassie(Bradford) Plus 단백질 분석 | Thermo Fisher Scientific Inc(미국 매사추세츠주 월섬) | APC 농도 측정용 | PI-23200 |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Wako | 043-07216 | IR700 |
| D-Luciferin(칼륨염 | Cayman Chemical | 14681 | 생물 발광 이미징 및 DLIT |
| GraphPad Prism7 | 통계 분석을 위한 | ||
| 700nm 형광 이미지 분석을 위한 | Studio | Li-Cor Biosciences | |
| IRDye 700DX 에스테르 적외선 염료 | LI-COR Bioscience(Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| 이소플루란 | Wako | 095-06573 | 마우스 마취용 |
| IVIS Spectrum CT | 캡처용 PerkinElmer | 생물 발광 이미지 및 DLIT | |
| Living Image | PerkinElmer | 분석을 위한 DLIT | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | S9763 | IR700 |
| NIR 레이저 | 장춘 신산업 광전자 기술 | MRL-III-690R | NIR 방사선 조사용 |
| Novex WedgeWell 4-20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 well | Invitrogen | XP04202BOX | SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS 샘플 버퍼 (x4) | Invitrogen | NP0007 | SDS-PAGE |
| 광학 파워 미터 | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | NIR 레이저의 출력 측정 |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | |
| Pearl Trilogy 이미징 시스템 | Li-Cor Biosciences | 700nm 형광 이미지 캡처용 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액(x100) | 배양을 위한 | Wako | 168-23191 |
| 퓨로마이신 디하이드로클로라이드 | ThermoFisher | A1113803 | 루시페라제 형질주입 |
| RediFect Red-Fluc-Puromycin 렌티바이러스 Prticles | PerkinElmer | CLS960002 | 을 사용한 루시페라제 트랜스펙션 |
| RPMI-1640 Red | Wako | 189-02025 | 세포 배양을 위한 |
| Sephadex G25 컬럼 (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 17-0851-01 | APC 농도 측정을 위한 IR700 |
| UV-1900i | Shimadzu |
참고문헌
- Xu, X., Lu, H., Lee, R. Near Infrared Light Triggered Photo/Immuno-Therapy Toward Cancers. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
- Mitsunaga, M., et al. Cancer cell-selective in vivo near....
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