Method Article

단일 나노 입자 암장 현미경 검사를 사용하여 세포 막에 금 나노로드의 확산 역학 시각화

DOI:

10.3791/61603

⸱

March 5th, 2021

 ,  , 
1Department of Chemistry, Key Laboratory of Bioorganic Phosphorus Chemistry & Chemical Biology (Ministry of Education), Tsinghua University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서, 우리는 세포막에 금 나노로드 (AuNRs)의 역학을 감시하기 위하여 전통적인 암장 현미경 검사법의 사용을 보여줍니다. 단일 AuNR의 위치와 방향은 ImageJ 및 MATLAB을 사용하여 감지되며 AuNRs의 확산 상태는 단일 입자 추적 해석을 특징으로 합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포막에 나노 입자의 확산 역학을 분석하는 것은 세포 섭취 과정을 더 잘 이해하는 데 중요한 역할을하며 나노 의학 전달의 합리적 설계를위한 이론적 근거를 제공합니다. 단일 입자 추적(SPT) 분석은 세포막에 개별 나노 입자의 위치와 방향을 조사하고 그들의 번역 및 회전 상태를 나타낼 수 있었습니다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포막에 금 나노로드 (AuNRs)의 역학을 감시하기 위하여 전통적인 암장 현미경 검사를 사용하는 방법을 보여줍니다. 또한 ImageJ 및 MATLAB을 사용하여 AuN의 위치와 방향을 추출하는 방법과 AuNR의 확산 상태를 특성화하는 방법을 보여줍니다. 수백 개의 입자의 통계 적 분석은 단일 AuNRs가 U87 MG 세포막의 표면에 브라운 운동을 수행한다는 것을 보여줍니다. 그러나 개별 적인 긴 궤적 분석은 AuNRs가 멤브레인, 즉 장거리 운송 및 제한된 면적 감금에 두 가지 유형의 모션 상태를 가지고 있음을 보여줍니다. 우리의 SPT 방법은 잠재적으로 다른 생물학적 세포에 있는 표면 또는 세포내 입자 확산을 연구하기 위하여 이용될 수 있고 복잡한 세포 기계장치의 조사를 위한 강력한 공구가 될 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

멤브레인상 나노입자(NPs)의 역학은 세포 기능, 바이러스 또는 세균 감염 및 인공 나노 의료 전달 시스템의 개발에 필수적인 세포 섭취 과정과 밀접한 관련이 있다1,2. 단일 입자 추적(SPT) 기술은 NPs3,4의이기종 동작을 특성화하는 강력한 도구이다. 일반적으로, 세포막은 단백질 및 지질과 같은 성분이 혈장 막평면5,6,7에서측면으로 이동할 수 있음을 의미하는 유체이다. 멤브레인 조직과 구조의 현면복잡성은 NP와 멤브레인 간의 상호 작용의 현면적 이질성으로 이어질 수 있다. 따라서 멤브레인에서 의한 NPs 의 움직임을 직접 시각화하려면 높은 공간 및 시간적 해상도가 필요합니다.

수십 나노미터의 공간 분해능과 밀리초의 시간 분해능을 가진 살아있는 세포에서 개별 입자의 국소화를 모니터링하는 단일 입자 추적 현미경 검사법은 NPs 또는 멤브레인 분자 역학

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 세포 배양

  1. 태아소 혈청을 추가하여 U87 MG 세포에 대한 완전한 배지 준비(최종 농도 10%) 및 페니실린 연쇄 절제술 (최종 농도 1%) 최소 필수 매체(MEM)에. 세포 하위 문화에 플라스틱 세포 배양 접시를 사용합니다.
  2. 통로 세포는 일주일에 2 ~ 3 번.
    1. 배양 배지를 제거하고 덜벡코의 인산완충식염(D-PBS)으로 세포층을 헹구면 컨실루(80%~90%)가 2~3배 나 늘어서 있다.
    2. 세포 배양 접시에 Trypsin-EDTA 용액의 1.0 내지 2.0 mL을 추가하고 세포가 둥글게 될 때까지 반전된 현미경으로 세포를 관찰한다(3~5분).
    3. 준비된 완전한 배지의 3.0mL를 추가하고 부드럽게 파이펫팅하여 셀을 분산시십시오.
    4. 신선한 세포 배지 (3 mL)와 새로운 배양 접시에 셀 서스펜션 (1 mL)을 추가하고 세포를 다시 중단합니다.
  3. 가습된 대기에서 세포를 37°C 및 5% CO2로 유지한다.

2. 현미경 슬라이드 준비

참고: 높은 활성을 가진 3~10세대의 U87 MG 세포는 SPT 실험에 사용된다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

프로토콜에서 수정되지 않은 40 x 85 nm CTAB-AuNR이 사용되었습니다. 도 2B에도시된 바와 같이, 세로 플라스모닉 최대값은 ~650nm(적색 영역)이며 횡방향 공명은 520nm(녹색 영역)이다. 이전 문헌은 플라스모닉 AuNR의 광학 특성(예: LSPR 강도)이 직경20,22로크게 변화할 것이라고 밝혔다. 도 2C에서,U87 세포막에 CTAB-AuNRs에서 산란 강도는 좁은 폭으로 전형적인 가우시안 분포를 보였으며 유리에 CTAB-AuNRs의 분포와 일치했으며, 이는 이 실험에서 추적된 CTAB-AuNRs가 잘 단분산되었다는 것을 나타낸다.

멤브레인에 CTAB-AuNRs의 동적 DFM (12 fps)에 의해 모니터링되었다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

제시된 프로토콜은 세포막에 AuNRs의 역학을 연구하기 위하여 이용됩니다. 이 프로토콜은 현미경 이미징, 데이터 추출, 동적 매개 변수 계산 및 데이터 분석 방법을 포함한 4개의 부분으로 구성되어 있으며 각 부품은 유연하고 보편적입니다. 따라서, 예를 들어, 멤브레인에 NP 연결 멤브레인 분자의 움직임을 연구하는 많은 가능한 미래의 응용 프로그램, NP 라벨 수용체의 내분비역학, 세포 내 NPs및 소포 코팅 NPs 수송의 동적 분석 등등.

기본 단계는 DFM을 사용하여 세포막에서 AuNRs의 움직임을 이미지화하는 것입니다. 현재, 세포막 역학의 분석을 위한 많은 화상 진찰 기술이 개발되고 있으며, 그 중 형광 현미경 검사법은24로널리 사용되고 있다. 그러나 형광 프로브의 광표백 특성은 오랜 시간 동안 입자 역학을 추적할 수 없게 됩니다. 여기서, 빛 안정 플라스모닉 AuN이 사용되었다. 여러 이미징 기술은 플라스모닉

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 21425519, 91853105 및 21621003의 보조금 번호로 중국의 국립 자연 과학 재단에 의해 지원되었다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CTAB 코팅 금 나노로드(CTAB-AuNR)NanoseedzNR-40-65085 nm * 40 nm
컬러 CMOS 카메라올림푸스DP74일본
CoverslipsCitoglasz10212222C22*22 mm
암시야 현미경Nikon80i정립 현미경
태아 소 혈청 (FBS)Gibco10099141
피지국립 보건원2.0.0-rc-69/1.52 pImageJ
그루브 유리 슬라이드돛 브랜드7103단일 오목
이미지 J국립 보건원1.52 j
MATLABMathWorksR2019b
MATLAB 코드https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020
최소 필수 배지(MEM)Gibco10-010-CVRwith phenol red
최소 필수 배지(MEM)Gibco51200038페놀 레드
없음 OriginOriginLabOrigin Pro 2018C
페니실린-스트렙토마이신Gibco15140122
플라스틱 세포 배양 접시Falcon353002
플라스틱 세포 배양 접시팔콘35300135*10 mm
U87 MG 세포미국형 배양 컬렉션ATCC HTB-14인간 1차 교모세포종 세포주

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells. Nature Communication. 10 (1), 2341(2019).
  2. Behzadi, S., et al. Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell. Chemical Society R....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Gold NanorodsCell MembraneSingle Particle TrackingDarkfield MicroscopyImageJ AnalysisMATLAB AnalysisMean Square DisplacementBrownian MotionLong Range TransportConfined Diffusion

Related Articles