생체 발광 대장균 O1:K1:H7을 가진 신생아 마우스의 감염은 중요한 폐 염증 및 폐 병리를 가진 패혈증 감염을 초래합니다. 여기서는 전신 세균성 부담, 염증 성 프로파일링 및 폐 조직 병리학의 열거와 병행하여 세로 내 인트라비셔널 이미징을 사용하여 신생아 패혈증을 모델링하고 추가로 연구하는 절차를 설명합니다.
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방법 논문
그람 음성 세균 패혈증의 신생아 화상 진찰 모형
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
신생아는 삶의 첫 달에 표시되는 독특한 면역 프로필로 인해 세균 성 패혈증의 위험이 증가합니다. 우리는 신생아의 높은 사망률을 담당하는 혈청형 인 대장균 O1:K1:H7의 병인을 연구하기위한 프로토콜을 설립했습니다. 우리의 방법은 감염의 진행 도중 다른 시점에서 신생아 새끼의 인탈 화상 진찰을 이용합니다. 혈액에 있는 박테리아의 측정에 의해 병렬된 이 화상 진찰, 선동적인 프로파일링 및 조직 조직 조직 병리학, 패혈증 도중 감염 역학을 이해하는 엄격한 접근을 의미합니다. 현재 보고서에서, 우리는 세균성 부담과 질병의 엄격의 비교를 위한 2개의 전염하는 접종을 모델링합니다. 우리는 잠복 감염이 10 시간 감염에 의하여 보급된 감염으로 이끌어 내는 것을 것을을 발견합니다. 24시간까지 발광 대장균의 감염은 혈액, 폐 및 기타 말초 조직에 풍부했습니다. 폐에서 염증성 사이토카인의 발현은 24시간에서 중요하며, 이는 세포 침투와 전염성 투여량으로 증가하는 조직 손상의 증거에 선행된다. 인트라바이탈 이미징에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이것은 발광 신호 임계값 및 마취 도중 신생아로 생길 수 있는 몇몇 합병증을 포함합니다. 몇 가지 제한에도 불구 하 고, 우리는 우리의 감염 모델 신생아 뮤린 패 혈 증 동안 세로 감염 역학을 이해 하기 위한 통찰력을 제공 발견, 그 철저 하 게 현재까지 검사 되지 않은. 우리는 이 모형이 또한 초기 생활 도중 그밖 중요한 세균성 감염을 공부하기 위하여 적응될 수 있기를 기대합니다.
서론
세균성 패혈증은 감염1로부터적당한 보호를 제공하지 않는 생활의 첫번째 일에 있는 유일한 면역 단면도를 전시하는 신생아를 위한 중요한 관심사입니다. 신생아 패혈증은미국에서만매년 75,000건 이상의 사례를 차지하는 중요한 미국 의료 문제입니다. 심층에서 이 감염을 공부하기 위하여는, 인간적인 질병의 양상을 회상하는 새로운 동물 모형이 요구됩니다. Escherichia 대장균,O1:K1:H73을사용하여 신생아 마우스 감염 모델을 확립했습니다. 대장균은 미국에서 신생아 패혈증의 두 번째 주요 원인이지만 패혈증 관련 사망률4,5의대다수에 대한 책임이 있습니다. 그러나, 그것은 pre-term 및 매우 낮은 출생 체중 (VLBW) 아기가독립적으로5로 간주될 때 주요 한 원인입니다. K1 혈청형은 신생아6,7에서침습적 혈류 감염 및 뇌막염과 가장 자주 연관된다. ....
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프로토콜
모든 절차는 웨스트 버지니아 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었고 국립 연구위원회18에의해 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 가이드의 권고에 따라 수행되었습니다.
1. 세균 이노컬룸 준비
- 트립틱 대두 한충 (TSA) 플레이트를 일선 대장균 O1:K1:H7-lux의 냉동고 주식으로부터 단일 식민지의 격리를 위한 접종 루프와 함께 루시파라제를 안정적으로 표현하고 가나마이신 저항3을운반한다. 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
- 다음 날 루리아 국물(LB)이 생물안전 캐비닛에서 실온(25°C)에 들어올 수 있게 한다.
- 생물 안전 캐비닛 후드에서, 줄무늬 플레이트에서 단일 식민지를 식별하고 카나마이신 (30 μg / mL)로 보충 된 LB의 3 mL에서 접종. 37°C에서 하룻밤 동안 흔들어서 배양합니다(220rpm). 이것은 스타터 문화입니다.
- 스타터 배양 1:100을 생물안전 캐비닛 후드 아래 LB의 신선한 3mL로 희석하고 37°C에서 2-3h의 인큐베이터로 되돌리세요(220 rpm). 이것은 주식 문화입니다.
- 분광광계를 사....
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결과
이 프로토콜은 신생아 마우스에서 세균 패혈증을 유도하고, 우리는 경도 내 근위 화상 진찰, 혈액내 박테리아의 열거, 병리학의 조직학적 평가 및 염증성 사이토카인 발현 프로파일을 사용하여 질병의 과정을 연구했습니다. 이환의 표시는 시간이 지남에 따라 E.coli의 낮은 (~7 x 106 CFU) 및 높은 (~7 x 106 CFU)에 감염된 신생아 새끼에서 관찰되었습니다. 더 큰 접종을 받은 새끼는 이동성 감소, 자세를 교정할 수 없음, 24시간 후 감염(hpi)으로 직립 위치를 유지하는 장애가 있는 고통을 더 두드러지게 표시했습니다. 그러나 일부 새끼들이 다른 새끼보다 더 나빠진 것처럼 보였기 때문에 다양한 이환율이 있었습니다. 감염 직후, 저용량 동물 1명은 기준선을 확립하기 위해 이미징 세션 중 이소플루란 노출로 인해 사망했습니다. 24 마치에 의해, 6 개의 고용량 동물 중 2 개는 전신 감염에 굴복 (33.3% 사망). 고용량 또는 저용량 접종을 받은 감염된 새끼는 2.......
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토론
신생아 마우스에서 세균 패혈증을 유도하기 위한 당사의 견갑골 감염 모델은 세균 병원체의 세로 확산을 실시간으로 연구하는 새로운 방법입니다. 인트라바이탈 이미징은 신생아에서 실시간으로 세균 보급을 탐구할 수 있는 기회를 제공합니다. 이것은 세균성 보급의 운동학을 이해하고 질병의 적당한 단계에서 호스트 반응 및 손상을 추가로 연구하기 위하여 중요합니다. 마우스 새끼는 세균 성 무접종의 피하, 피하 주입을 투여한다. 이 주입 기술은 주사 부위 내에서 덜 정밀도를 필요로하기 때문에 꼬리 정맥 및 복강 내 감염과 같은 다른 일반적으로 사용되는 대안보다 간단합니다. 이것은 새끼의 작은 크기를 감안할 때 중요합니다. 인트라바이탈 이미징은 동물을 희생할 필요 없이 시간이 지남에 따라 주변 조직및 중추 신경계로 세균증 및 보급의 세로 평가를 허용합니다. 유사한 화상 진찰 접근 및 기술은 암 생물학 및 전이의 연구 결과에 이용되었습니다20,21.
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 C.M.R에 기관 자금에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1mL 인슐린 주사기 | Coviden | 1188128012 | 접종 또는 PBS 주입 |
| 10% 중립 완충 포르말린 | VWR | 89370-094 | 조직병리학 |
| ACK 용해 완충액 | Gibco | LSA1049201 | 세균 제거 분석 |
| 동물 문신 잉크 페이스트 | Ketchum | KI1482039 | 동물 식별 |
| 동물 문신 잉크 녹색 페이스트 | Ketchum | KI1471039 | Animal identification |
| Anti-Ly-6B.2 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | Cell isolation |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
| Escherichia coli O1:K1:H7-lux (루시페라아제를 표현) | N/A | /A | WVU |
| 에서 자체 제작E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit | Omega Bio-tek | R6812 | RNA extration |
| DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton, Dickinson and Company | 236950 | Bacterial growth |
| IL-1 beta Primer/probe (Mm00434228)Thermo | Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| IL-6 Primer/probe (Mm00446190) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | 사이토카인 발현 qPCR |
| iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | Real-time quantitative PCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| Isolation Buffer | Miltenyi Biotec | N/A | Bacterial clearance assay |
| IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software | Perkin Elmer | N/A | Intravital imaging |
| LB Broth, Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | Bacterial growth |
| EASYstrainer (Nylon Basket) | Greiner Bio-one | 542 040 | Cell strainer |
| SpectraMax iD3 | Molecular Devices | N/A | Plate reader |
| Pellet Pestle Motor | Grainger | 6HAZ6 | Tissue homogenization |
| Polypropylene Pellet Pestles | Grainger | 6HAY5 | 조직 균질화 |
| 프라임 열 순환기 | Techne | 3PRIMEBASE/02 | cDNA synthesis |
| TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| TriReagent (GTCP) | Molecular Research Center | TR 118 | RNA extration |
참고문헌
- Qazi, S. A., Stoll, B. J. Neonatal sepsis: a major global public health challenge. Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).
- Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. Early-onset neonatal sepsis. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014). <....
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재인쇄 및 허가
