이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

그람 음성 세균 패혈증의 신생아 화상 진찰 모형

5.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/61609

⸱

2020년 8월 12일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, 2Vaccine Development Center at West Virginia University Health Sciences Center

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

생체 발광 대장균 O1:K1:H7을 가진 신생아 마우스의 감염은 중요한 폐 염증 및 폐 병리를 가진 패혈증 감염을 초래합니다. 여기서는 전신 세균성 부담, 염증 성 프로파일링 및 폐 조직 병리학의 열거와 병행하여 세로 내 인트라비셔널 이미징을 사용하여 신생아 패혈증을 모델링하고 추가로 연구하는 절차를 설명합니다.

초록

신생아는 삶의 첫 달에 표시되는 독특한 면역 프로필로 인해 세균 성 패혈증의 위험이 증가합니다. 우리는 신생아의 높은 사망률을 담당하는 혈청형 인 대장균 O1:K1:H7의 병인을 연구하기위한 프로토콜을 설립했습니다. 우리의 방법은 감염의 진행 도중 다른 시점에서 신생아 새끼의 인탈 화상 진찰을 이용합니다. 혈액에 있는 박테리아의 측정에 의해 병렬된 이 화상 진찰, 선동적인 프로파일링 및 조직 조직 조직 병리학, 패혈증 도중 감염 역학을 이해하는 엄격한 접근을 의미합니다. 현재 보고서에서, 우리는 세균성 부담과 질병의 엄격의 비교를 위한 2개의 전염하는 접종을 모델링합니다. 우리는 잠복 감염이 10 시간 감염에 의하여 보급된 감염으로 이끌어 내는 것을 것을을 발견합니다. 24시간까지 발광 대장균의 감염은 혈액, 폐 및 기타 말초 조직에 풍부했습니다. 폐에서 염증성 사이토카인의 발현은 24시간에서 중요하며, 이는 세포 침투와 전염성 투여량으로 증가하는 조직 손상의 증거에 선행된다. 인트라바이탈 이미징에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이것은 발광 신호 임계값 및 마취 도중 신생아로 생길 수 있는 몇몇 합병증을 포함합니다. 몇 가지 제한에도 불구 하 고, 우리는 우리의 감염 모델 신생아 뮤린 패 혈 증 동안 세로 감염 역학을 이해 하기 위한 통찰력을 제공 발견, 그 철저 하 게 현재까지 검사 되지 않은. 우리는 이 모형이 또한 초기 생활 도중 그밖 중요한 세균성 감염을 공부하기 위하여 적응될 수 있기를 기대합니다.

서론

세균성 패혈증은 감염1로부터적당한 보호를 제공하지 않는 생활의 첫번째 일에 있는 유일한 면역 단면도를 전시하는 신생아를 위한 중요한 관심사입니다. 신생아 패혈증은미국에서만매년 75,000건 이상의 사례를 차지하는 중요한 미국 의료 문제입니다. 심층에서 이 감염을 공부하기 위하여는, 인간적인 질병의 양상을 회상하는 새로운 동물 모형이 요구됩니다. Escherichia 대장균,O1:K1:H73을사용하여 신생아 마우스 감염 모델을 확립했습니다. 대장균은 미국에서 신생아 패혈증의 두 번째 주요 원인이지만 패혈증 관련 사망률4,5의대다수에 대한 책임이 있습니다. 그러나, 그것은 pre-term 및 매우 낮은 출생 체중 (VLBW) 아기가독립적으로5로 간주될 때 주요 한 원인입니다. K1 혈청형은 신생아6,7에서침습적 혈류 감염 및 뇌막염과 가장 자주 연관된다. 현재, 항생제와 지원 치료 이외의 다른 치료 옵션이 없습니다. 한편, 항생제 내성의 비율은 많은 병원성 박테리아에 대한 상승을 계속, 대장균의 일부 변종은 일반적으로 치료에 사용되는 항생제의 무리에 저항8. 따라서, 우리는 패혈증의 메커니즘과 신생아의 호스트 반응을 연구하는 방법을 생성하는 것이 필수적이다. 이러한 결과 현재 치료 및 감염 결과 개선 하는 데 도움이 수 있습니다.

신생아의 면역 상태는 성인에 비해 표현과 기능적 차이 모두 특징이다. 예를 들어, 인터류킨(IL)-10 및 IL-27과 같은 항염증 및 조절 세포카인의 높은 수준은, 코드 혈액 유래 대식세포에 의해 생성되는 것으로 나타났으며 뮤린 신네이트9,10,11의혈청에서 더 큰 수준에서 존재한다. 이는성인세포(10)와비교하여 신생아세포로부터 자주 보고되는 IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 및 TNF-α 낮은 수준과 일치한다. 또한, 신생아 면역 계통은 성인12와비교하여 Th2 및 규정 T 세포 반응으로 기울어져 있다. 호중구, T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 높은 숫자는 신생아에도 존재하지만, 중요한 기능 적 장애를 가진다. 여기에는 미성숙을 제안하는 세포 표면 마커 및 항원 프리젠 테이션의 발현에 결함이포함됩니다(13,14,15). 추가적으로, 신생아 호중구는 화학 계수 요인16로이동하는 그들의 능력에 있는 현저하게 결핍됩니다. 골수성 유래 억제제 세포(MDSC)는 또한 신네이트의 높은 수준에서 발견되며 최근에IL-2711의원천으로 나타났다. MDSC는 T세포(17)를향해 매우 억제된다. 전체적으로, 이 데이터는 감염에 증가한 감수성에 빌려주는 신생아 면제에 있는 한계를 보여줍니다.

신생아 패혈증 중 세균성 부담의 진행과 해부 보호 숙주 면역 반응의 진행을 연구하기 위해, 우리는 새로운 감염 모델을 개발했습니다. 생활의 일 3-4에 신생아 마우스는 복막 공간 또는 꼬리 정맥에서 주입하기 어렵다. 우리의 모형에서, 일 3 또는 4 새끼는 견갑각 성 지역으로 세균성 접종 또는 PBS를 피하로 관리됩니다. 전신 감염이 발생하고 발광 대장균 O1:K1:H7을 사용하여, 우리는 말초 조직에 전파된 세균 부담을 따르기 위하여 개별 신생아 마우스를 세로로 심상할 수 있습니다. 이것은 뮤린 신생아3에서패혈증 도중 박테리아의 보급의 운동을 이해하기 위하여 인트라베이티 이미징을 이용하는 첫번째 보고된 모형입니다.

여기서, 신생아 마우스에서 패혈증 대장균 감염을 유도하는 프로토콜을 설명한다3. 우리는 주입을 위한 세균성 접종을 준비하는 방법, 병리학평가를 위한 조직을 수확하는 방법, 유전자 발현 분석에 의한 염증성 마커의 측정, 세균부담의 열거를 기술합니다. 또한, 감염된 신생아의 인트랄트 이미징을 위한 발광 대장균의 사용과 신생아 면역 세포에 의한 세균성 살인의 정량화도 설명된다. 이 프로토콜은 또한 신생아에 있는 그밖 중요한 세균성 감염을 공부하기 위하여 적응될 수 있습니다. 여기에 제시된 데이터는 번역가능한 신생아 패혈증 모형에 있는 감염 역학을 이해하는 전반적인 새로운 접근을 나타냅니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

모든 절차는 웨스트 버지니아 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었고 국립 연구위원회18에의해 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 가이드의 권고에 따라 수행되었습니다.

1. 세균 이노컬룸 준비

  1. 트립틱 대두 한충 (TSA) 플레이트를 일선 대장균 O1:K1:H7-lux의 냉동고 주식으로부터 단일 식민지의 격리를 위한 접종 루프와 함께 루시파라제를 안정적으로 표현하고 가나마이신 저항3을운반한다. 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
  2. 다음 날 루리아 국물(LB)이 생물안전 캐비닛에서 실온(25°C)에 들어올 수 있게 한다.
  3. 생물 안전 캐비닛 후드에서, 줄무늬 플레이트에서 단일 식민지를 식별하고 카나마이신 (30 μg / mL)로 보충 된 LB의 3 mL에서 접종. 37°C에서 하룻밤 동안 흔들어서 배양합니다(220rpm). 이것은 스타터 문화입니다.
  4. 스타터 배양 1:100을 생물안전 캐비닛 후드 아래 LB의 신선한 3mL로 희석하고 37°C에서 2-3h의 인큐베이터로 되돌리세요(220 rpm). 이것은 주식 문화입니다.
  5. 분광광계를 사용하여 600 nm에서 빈 및 스톡 배양의 광학 밀도(OD)를 읽습니다. LB의 100 μL을 96개의 잘 평평한 바닥 분석 플레이트의 한 웰에 넣습니다. 이것은 빈입니다. 그런 다음 스톡 배양에서 100 μL을 별도의 우물에 추가합니다. 두 개의 추가 복제를 위해 반복합니다. 흡광도는 플레이트 판독기를 사용하여 읽습니다.
  6. 주식 배양 흡수값(OD 값)으로부터 빈 흡광도를 빼고, 이전에 생성된 및 검증된 성장 곡선과 비교하여 전염되는 용량의 제조를 위한 주식 배양에서 세균 밀도의 근사치를 결정한다.
  7. 연구 질문에 따라 표적 접종을 생성합니다. 표적 접종은 2 x 10 6(low) 및 7 x 106(high) 콜로니 형성 유닛(CFU)당 마우스(/mouse)를 이 연구에 사용하였다.
    1. 마우스당 표적 투여량(DoseT)을주식 배양(Stock)에서 박테리아의 추정 농도로 나누어 스톡튜브(VS)로부터필요한 박테리아의 양을 얻도록 한다.
    2. VS를 감염에 필요한 박테리아의 총량과 5-10추가 용량에 대해 5-10 개의 엑스트라에 대해 충분히 감염될 필요가 있는 마우스(NM)의수에 곱한다. 스톡 튜브에서이 볼륨을 제거하고 새로운 원심 분리 튜브에 추가합니다.
    3. 아래 방정식을 사용하십시오.
      투여량T/스톡= VS xNM = 스톡 튜브로부터 제거되는 박테리아의 총 부피(VT).
  1. 원심분리기 는 4°C에서 5분 동안 2,000 x g에서 박테리아를 재중단하고 감염될 마우스당 PBS(pH 7.2-7.6)의 50 μL(pH 7.2-7.6)에서 세균펠릿을 재중단합니다(예를 들어, 10회 투여량당 2 x 106 박테리아의 투여량, 2 x 107 박테리아의 펠릿은 PBS 50S에서 재중단될 것이다). 다시 말하지만, 필요한 것보다 더 많은 무분이 나는 것을 준비하는 것이 좋습니다. 제어 접종을 위해서만 PBS의 동일한 볼륨을 준비합니다. 감염될 때까지 얼음에 대한 전염성 접종및 PBS 제어를 유지합니다.
  2. 96개의 잘 플라스틱 바닥 희석 플레이트에서 PBS에 7개의 10배 연속 희석제를 수행하고, 카나마이신(30 μg/mL)으로 보충된 사분면 TSA 플레이트에 중복된 희석제 25 μL을 투여하여 투여된 박테리아의 실제 양을 열거한다. 열거하기 전에 식민지 형성을 위해 하룻밤 사이에 37 °C에서 배양하십시오.

2. 동물 식별

  1. 나이가 일치하는 새끼를 위해 쓰레기를 동기화 할 수 있도록 충분한 수의 번식 쌍을 정렬합니다. 1일 ± 연령 변동은 허용됩니다.
  2. 임신 한 C57BL/6 여성 마우스를 식별하고 정확하게 나이를 결정하기 위해 계획된 실험에 앞서 쓰레기의 탄생을 모니터링합니다.
  3. 대조군과 감염된 3일 또는 4일 된 새끼를 구별하려면 작고 미세한 홍채 가위를 사용하여 컨트롤 새끼의 꼬리 끝을 잘라낸다. 감염된 새끼는 꼬리 스니프를 받지 않습니다. 꼬리를 자르기 전에 70 % 에탄올에 사용되는 면공으로 피부를 소독하십시오. 필요에 따라 면공이나 거즈로 꼬리 끝에 압력을 가하십시오.
    참고: 이 절차는 생물 안전 캐비닛 후드에서 수행됩니다. 약 1/8 인치의 꼬리 스니핑으로 충분합니다.
  4. 대조군과 감염된 그룹 내의 새끼를 식별하려면 28 G x 1/2'의 영구 바늘로 1mL 인슐린 주사기를 사용하여 새끼의 꼬리를 문신하십시오. 문신하기 전에 70 % 에탄올에 사용되는 면공으로 피부를 소독하십시오. 이 절차는 생물 안전 캐비닛 후드에서 수행됩니다.
  5. 꼬리를 문신하려면 바늘 끝에 동물 문신 잉크를 바르습니다. 다음으로, 조심스럽게 한 손으로 새끼를 억제하고 꼬리가 완전히 노출됩니다. 표면적인 깊이 수준을 유지하면서 피부 밑에 바늘을 부드럽게 삽입하고 작은 마킹 또는 점이 생성 될 때까지 몇 밀리미터 의 피부와 바늘을 평행하게 움직입니다. 피부 아래에서 바늘을 천천히 제거하기 전에 몇 초 동안 기다립니다.
  6. 필요에 따라 면공이나 거즈로 상처에 압력을 가하십시오. 70%의 에탄올로 피부 표면에 과도한 문신 잉크를 제거합니다.
  7. 감염된 및 대조군에서 후속 마우스와 함께이 과정을 반복, 각 연속 강아지 문신과 추가 점을 추가하는 동안 (예를 들어, 강아지 1은 자신의 꼬리에 1 점을해야합니다, 강아지 2 는 자신의 꼬리에 두 개의 점이있을 것이다, 등).
    참고: 추가 식별 계층의 경우 대조군및 감염된 그룹에 별도의 동물 문신 잉크를 사용하는 것이 좋습니다.

3. 견갑골 접종

참고: 이 연구를 위해, 2 실험은 각 실험에 대해 지정된 저용량 및 고용량 그룹으로 수행되었다. 첫 번째 실험에서는 7마리의 새끼가 저용량 접종(4마리 새끼를 대조군으로 사용됨)을 투여하고, 별도의 쓰레기로부터 새끼 5마리가 고용량(3마리새끼를 대조군으로 사용하였다)을 받았다. 실험 1의 새끼는 24시간 시간점에 대해서만 데이터를 제공했습니다. 두 번째 실험에서, 8 새끼는 낮은 용량 의 접종을 주어졌다 (2 새끼는 대조군으로 사용되었다), 6 새끼는 고용량 무분비 (2 새끼는 대조군으로 사용되었다)를 부여했다. 실험 2의 새끼는 0, 10 및 24 시간 점에 대한 데이터를 제공했습니다.

  1. 나이 일치 새끼 는 1 일 ≤. 각 쓰레기를 저용량 또는 고용량 쓰레기로 할당합니다. 쓰레기 내에서 무작위로 제어 또는 감염된 새끼로 새끼를 할당합니다.
  2. 3 일 또는 4 산후, 대장균 럭스 또는 PBS 제어와 접종 하기 전에 모든 새끼의 무게를 기록. 이 시간 동안 새끼에서 댐을 분리하여 감염 중에 움직이지 않도록하십시오.
  3. 인슐린 바늘을 이용한 생물안전 캐비닛 내에서 PBS 또는 대장균 비통을 흡인합니다. 이 작업의 경우 마우스 당 2 x 106 및 7 x 106 CfCu의 접종이 사용되었습니다. 잠수 주입을 통해 투여 될 때까지 전염성 접종과 PBS를 얼음에 보관하십시오.
  4. 신생아를 생물안전 캐비닛 후드의 깨끗한 표면에 놓고 새끼를 덜어두는 것처럼 목의 목덜미에 피부를 올립니다.
  5. 지금 피부와 동물의 근육 사이에 생성 된 공간에서, 바늘을 삽입, 벨, 피부 바로 아래와 PBS 또는 대장균 의50 μL을 주입. 동시에 주입 역류를 방지하기 위해 피부의 꼬집은 부분을 방출합니다.
  6. 바늘을 천천히 제거하고 주의하십시오. 주사가 끝난 후 새끼를 댐으로 다시 놓습니다.
    참고: 개발에서 그들의 해부학 적인 단계 때문에, 그것은 기술적으로 3-4 일에 신생아 새끼에 꼬리 정맥 또는 복막 주사를 관리 하기 어려운. 따라서, 형갑피 감염 경로는 실행의 용이성으로 인해 이 연구를 위해 선택되었다.

4. 질병 및 종점 기준 평가

  1. 감염 기간 내내 매일 두 번 새끼를 모니터링하십시오. 외관의 이상에 유의하십시오.
  2. 이환율의 객관적인 측정으로 가중치를 기록합니다.
  3. 체중 변화 외에도 등쪽의 신생아를 배치하여 새끼의 능력을 바로 잡을 수 있도록 테스트합니다. 아픈 동물은 복부 측과 발에 넘길 수 없거나 어려움으로이 작업을 완료합니다.
  4. 종점 기준에 가까운 동물을 표시하기 위해 다음을 확인 : 정상 체중의 85 % 미만; 감소 된 움직임과 자신을 바로 무능력; 분홍색과 는 달리 피부의 변색과 더 회색 또는 투명한 외관; 터치에 시원한 느낌, 체온 감소 및 측면을 따라 출혈 타박상을 나타내는, 또한 사전 질병을 나타내는.
    참고: 신생아가 이틀 동안 체중을 증가시키지 못하고 4.4 단계의 설명에 맞추지 못하면 끝점 기준을 충족했습니다. 높은 복용량을 수신 하는 새끼는 종종 24 시간까지 끝점 기준을 충족. 저용량 및 고용량 쓰레기 내의 제어 새끼는 대조군과 실험 군 간의 비교 분석을 허용하기 위해 동시에 안락사될 것이다. 아래 안락사 섹션으로 이동하십시오.

5. 세균부담의 생체 내 이미징

  1. 이미징 및 후속 분석을 위해 마이크로CT 이미저 및 소프트웨어를 사용합니다.
    참고: 강아지 피부 색은 이미징 품질에 영향을 미치지 않습니다.
  2. 대장균-럭스-감염된신생아 마우스와 댐을 BSL-2 레벨 라미나르 플로우 후드에 넣습니다. 마우스를 제거하여 이미지화하고 후드 내의 투명한 이소플루란 챔버에 넣습니다. 필요한 이소플루란의 양을 측정하기 위해 감염되지 않은 컨트롤로 시작하는 것이 좋습니다.
  3. microCT에 연결된 컴퓨터에서 소프트웨어를 엽니다. 시스템을 초기화하고 CCD 온도가 -90 °C에서 잠글 때까지 기다립니다.
  4. 이소플루란 기화기를 켜고 다이얼을 5% 이소플루란 플로우로 조정합니다. 이 이소플루란 혼합물을 챔버에 마우스를 보관하여 이동을 멈출 때까지 20-30초간 유지하십시오. 더 이상 또는 짧은 마취 노출 시간은 몇몇 마우스를 위해 필요할 지도 모릅니다. 마우스가 움직이지 않으면 충분히 마취되고 이미지화 될 수 있습니다.
  5. 마우스를 마이크로CT 이미징 챔버로 이동시키고 코 콘에 수직으로 향하는 코가 있는 경향이 있는 위치에 있는 이미징 상자에 놓습니다. 치과 왁스를 사용하여 이미징 상자의 발을 부드럽게 억제하여 움직임을 제한하십시오. 최대 4개의 신생아 마우스는 한 번에 심화될 수 있다.
  6. 이소플루란 기화기를 2-4% 흐름으로 돌려 마우스가 이미징 중에 마취하도록 합니다. 마이크로CT 이미징 챔버 도어를 닫습니다. 몇 초 후에 마우스를 확인하십시오. 이동을 시작하면 이소플루란에 면공을 두어 5초 동안 움직이는 동물의 코에 고정하여 마취합니다. 이미징 하는 동안 동물 근처 면 공을 유지 합니다. 마우스를 마취하고 종료하지 않도록주의하십시오.
  7. 소프트웨어를 사용하여 이미징용 발광 옵션을 선택합니다. 블록으로 설정된 흥분 필터를 사용하여 500nm, 520 nm, 560 nm, 580 nm, 600 nm 및 620 nm로 설정된 방출 필터를 사용합니다. 발광을 위해 설정된 총 7개의 총 배출 필터가 있습니다.
  8. 각 시점에서 마우스를 이미지 (0, 10, 24 시간 감염 [hpi]) 각 시간 지점에 대한 폴더에 모든 이미지를 저장합니다. 새끼를 댐으로 케이지로 돌려보내 모든 새끼가 마취에서 회복된지 확인하십시오.
  9. 2D 이미지를 분석하려면 소프트웨어에서 이미지를 엽니다. 방광(광자)으로단위를 변경; 이것은 총 플럭스 (광자 / 초)로바뀝니다.
  10. 한 번에 여러 개의 배출 필터로 설정된 이미지 한 개만 분석합니다. 각 이미지 세트에서 각 이미지의 오른쪽 하단에 있는 최소 및 최대 광채 값을 기록합니다(예: 7개의 방출 필터가 있는 경우 7개의 이미지와 7개의 최소 값및 최소 값7개). 비교할 각 이미지 집합에 대해 반복합니다.
  11. 모든 이미지의 값과 발광을 포함하는 배율을 확인하려면 각 이미지 집합에 대해 가장 낮은 최소 값과 가장 높은 최대 값을 찾습니다. 이 스터디에서는 열기 필터 이미지가 대표로 사용되었습니다.
    1. 눈금을 표시하고 열어 선택한 이미지를 열어 축척을 변경합니다. 도구 팔레트에서 이미지 조정 탭을 클릭하고 색상 배율을 이전에 식별한 최소값과 가장 높은 최대 값으로 변경합니다. 각 이미지를 TIFF로 저장합니다. 이러한 방식으로 각 시간 지점을 개별적으로 분석하여 올바른 축척이 표시되도록 합니다.
  12. 각 개별 마우스에 대한 총 플럭스(마우스당 발광 신호의 양)를 정량화하려면 이전에 설명된 바와 같이 5.9-5.10 단계에 설명된 이미지를 엽니다. 도구 팔레트에서 ROI 도구 탭을 열고 원 도구를 선택합니다. 발광 의 한 영역을 분석하는 경우 1 원을 선택합니다.
  13. 발광 부위에 ROI를 오버레이로 이동합니다. 필요한 경우 ROI 크기를 조정합니다.
    참고: 조정이 필요한 경우 일관성을 유지하기 위해 다른 이미지에서 ROI를 비교적 조정합니다. 측정 ROI를 선택합니다. ROI 측정 창은 총 플럭스 (p /s), 평균 광도 (p / s / cm2/ sr), 광채의 표준 편차, 최소 광채 및 최대 광채를표시하는 열립니다.
  14. 각 이미지 집합에 대한 총 플럭스 측정값을 기록합니다. 이 숫자는 2D 이미지에서 마우스의 발광량의 정량화된 양입니다.
  15. 3D 재구성 된 마이크로 CT 이미지를 만들려면 도구 팔레트의 DLIT 3D 재구성 패널을 열고 분석 탭 아래에 포함 될 모든 파장을 확인합니다.

6. 안락사

  1. 부검 및 적절한 다운스트림 응용 프로그램에 대한 관심있는 조직 / 장기를 위한 튜브를 준비하고 라벨을 붙입니다.
  2. 신생아를 댐과 분리하여 생물안전 캐비닛에 있습니다.
  3. 수의학 등급의 이소플루란에 면공을 담그고 투명한 봉쇄 챔버 안에 놓습니다.
  4. 혈액을 수집하는 경우, 팁으로 P200 마이크로 파이프를 준비하고 항응고제로 5mM EDTA의 10 μL10mL와 1.5 mL 튜브를 가지고있다. 50-200 μL의 혈액부피가 예상됩니다.
  5. 신생아를 챔버에 놓고 새끼가 움직이지 않게 될 때까지 모니터링합니다.
  6. 빨리, 신전을 제거하고 가위로 참수. 장기간 신선한 공기를 호흡할 수 있다면 새끼는 의식을 되찾을 수 있습니다. 신생아는 성인 마우스에 비해 폐 용량을 감소, 따라서, 혼자 이소플루란에 의해 안락사에 대한 충분히 깊이 호흡하지 않습니다.
  7. P200 마이크로피펫을 사용하여 머리 밑의 트렁크에서 혈액을 채집합니다. 수집된 혈액의 양을 최대화하려면 참수 후 가능한 한 빨리 이 단계를 수행하십시오. 1.9단계에서 설명된 바와 같이 연속 희석 및 표준 플레이트 계수에 의해 혈액 내 세균을 열거한다.
  8. 조직 샘플을 절제하기 전에 70 % 에탄올로 전체 신생아를 살균하십시오.

7. 조직 수확

  1. 생물 안전 캐비닛 내에서 신생아를 70% 에탄올로 사용하여 오염을 방지하십시오. 동물을 오른쪽에 놓습니다.
  2. 집게를 사용하여 복부와 후면 왼쪽 다리 사이의 지점에서 피부를 잡고 미세 기울어진 수술 가위로 절개를합니다. 뒤쪽으로 위로 이동하는 피부를 계속 잘라냅니다. 전체 비장이 노출될 때까지 진행합니다.
  3. 집게를 사용하여 비장을 잡고 복부에서 제거하여 가위를 사용하여 결합 조직을 분리하십시오. 비장을 다운스트림 응용 프로그램에 적합한 솔루션에 배치합니다.
  4. 폐를 얻으려면 가슴의 피부를 완전히 벗겨냅니다.
  5. 가위를 수직으로 잡고 흉골 의 바닥에 입력, 늑골 케이지가 분할 될 때까지 위쪽으로 잘라.
  6. 집게를 사용하여 오른쪽과 왼쪽 폐를 개별적으로 잡고 흉부 구멍에서 제거하십시오. 가위로 절단하여 폐 조직에서 심장을 제거합니다.
  7. 폐를 다운스트림 적용에 적합한 용액에 배치합니다. RNA 절연의 경우, 구아니딘 티오야네이트/페놀(GTCP)의 500 μL을 사용하십시오. 조직 병리학의 경우 중립 완충 포머닌의 5 mL을 사용합니다.

8. 유전자 발현을 위한 폐 조직으로부터의 RNA 절연

  1. 마이크로센심분리기를 4°C로 미리 식힙니다.
  2. 가위로 GTCP에 폐 조직을 다진다. 다음으로, 배터리 구동 균질화로 조직을 균질화합니다. 솔루션이 가능한 한 균일 할 때까지 계속합니다. 실온에서 3-5분 동안 배양하십시오.
  3. 여과된 파이펫 팁을 사용하여 100μL의 클로로폼을 추가합니다. 튜브를 15초 로 반전시키고 실온에서 3-5분 동안 배양합니다.
  4. 원심분리기 는 12,000 x g에서15 분 동안.
  5. 스핀 동안 70 % 에탄올의 500 μL로 1.5 mL 튜브를 준비하십시오. RNA 격리 키트에서 컬럼 및 수집 튜브를 조립하고 라벨을 부착합니다.
  6. 원심분리 중에 형성된 상간 층을 방해하지 않고 위쪽, 수성 층을 조심스럽게 제거합니다. 70% 에탄올이 들어 있는 튜브에 수성층을 놓습니다.
  7. 에탄올을 이동하고 혼합물을 수집 튜브의 컬럼으로 이동합니다.
  8. 이 시점부터 RNA 절연 키트 상용 제품 프로토콜을 따라 RNA의 최종 용출까지.
  9. 순도 및 양을 위해 RNA를 분석합니다. 즉시 사용하거나 추가 사용이 될 때까지 -80 °C에 보관하십시오.

9. cDNA 합성

  1. PCR 튜브에 라벨을 부착하고 따로 둡니다.
  2. 각 샘플에 대한 cDNA 반응 혼합물에 RNA 1 μg를 추가합니다.
  3. cDNA 프로토콜에 설명된 대로 시약 및 템플릿을 PCR 튜브에 추가합니다. 혼합물에 마지막으로 효소를 추가합니다.
  4. 다음과 같은 실행 설정과 함께 열순환기에 PCR 튜브를 배치 : 25 °C에서 5 분, 42 ° C에서 40 분, 85 °C에서 15 분 및 4 ° C 최종 홀드.
  5. 열사이클러에서 PCR 튜브를 제거하고 즉시 사용하거나 추가 사용이 될 때까지 -20 °C에 보관하십시오.

10. 실시간 정량적 PCR(qPCR) 주기

  1. 분석될 각 유전자에 대한 반응 혼합 칵테일을 준비한다. 각 15 μL PCR 반응은 2배 시약 믹스7.5 μL, 20X 5'-FAM 표지 유전자 특이적 프라이머/프로브의 0.75 μL, 뉴클레아제 없는 물의 3.75 μL이 필요합니다. 앰플리슨은 일반적으로 60-120 bp범위입니다.
  2. 각 실험 그룹에 대한 3 μL의 cDNA 템플릿을 적절한 우물에 추가합니다.
  3. 유전자 특이 반응 혼합 칵테일의 12 μL을 적절한 우물에 추가합니다.
  4. 1,000 x g에서 광학 접착제 필름과 원심분리기로 플레이트를 덮어 우물에서 형성되었을 수 있는 거품을 제거합니다.
  5. PCR 플레이트를 실시간 PCR 열순환기에 배치합니다.
  6. 다음과 같이 실행 방법을 설정 : 95 °C에서 3 분, 15 초에 대한 95 ° C의 40 사이클, 1 분 동안 60 ° C.
  7. 2-ΔCt 수식 및 숫자의 로그2 변환을 사용하여 감염되지 않은 대조군 샘플에 비해 감염된 샘플로부터 의이해 유전자를 정상화하여 데이터를 분석한다.

11. 폐 조직병리학

  1. 위에서 설명한 바와 같이 신생아 새끼에서 폐를 제거하십시오.
  2. 조직에 대한 용액의 비율이 3-7 일 동안 약 20:1되도록 조직을 10 % 중성 완충 포르말린의 부피에 놓습니다.
  3. 파라핀 포함, 단면, 헤마톡슬린 및 에신(H&E) 염색에 적합한 조직학 서비스와 함께 조정한다. 이 작업을 위해, 웨스트 버지니아 대학 조직 병리학 코어를 활용했다. 또는 이전에 설명한프로토콜(19)을따르십시오.

12. 체외 세균 살인 분석

  1. 위에서 설명한 바와 같이 감염되지 않은 신생아 새끼에서 비장을 제거하고 멸균 60mm 페트리 접시 내에서 40 μm 나일론 바구니에 놓습니다. 이 것을 반복하고 풀은 함께 수확하고 균질화하기 위해 하나의 튜브로 비장.
  2. 10% FBS로 보충된 PBS 5mL를 추가합니다.
  3. 단일 세포 현탁액이 생성될 때까지 멸균 3 mL 주사기 플런저를 사용하여 조직을 분해합니다.
  4. 나일론 바구니 외부의 단일 셀 서스펜션을 수집하고, 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고, 펠릿 셀을 350 x g에서 5분 동안 이송한다.
  5. 적혈구 용해 완충제 (최대 7-8 비장2 mL)에서 세포를 중단하고 적혈구를 제거하기 위해 실온에서 5 분 동안 방치하십시오.
  6. 위와 같이 PBS와 펠릿으로 비장구를 씻으십시오.
  7. 예상 셀 수율에 따라 0.5% BSA 및 2mM EDTA로 보충된 PBS의 0.25 mL에서 비장구를 일시 중단합니다.
  8. 혈전계 또는 기타 적절한 응용 프로그램을 사용하여 비장구를 계산합니다.
  9. 제조 자 프로토콜에 따라 면역 자기 구슬을 가진 Ly6B.2+ (과립구/염증 성 단핵구의 골수성 인구) 세포를 분리합니다.
  10. 종자 Ly6B.2+ 세포는 10% FBS, 2mM 글루타민 및 25mM HEPES(완전한 매체)를 포함하는 DMEM의 0.1 mL의 부피에서 흑백 96-웰 플레이트에서 잘 1 x 105 세포의 밀도를 갖는다.
  11. 제1항에 설명된 바와 같이 생체발광 E. 대장균을 열거하고 0.1 mL의 최종 부피에서 원하는 복합감염(MOI)에서 세균성 접종을 준비한다. 이것은 일괄 처리에 있는 일반적인 MOI에서 모든 우물에 필요한 것을 만들어서 가장 잘 합니다.
  12. 세균 성 무분비의 0.1 mL을 추가하거나 대조군으로 혼자 완전한 매체를 추가합니다. 멀티웰 플레이트를 37°C, 5%CO2에서 1h로 배양한다.
  13. 미디어를 피펫으로 부드럽게 제거하고 새로운 파이펫 팁으로 신선한 미디어를 추가하여 젠타미신(100 μg/mL)을 포함하는 신선한 완전한 미디어0.2mL로 미디어를 대체하십시오. 문화를 인큐베이션으로 반품하여 2시간 추가로 보내보도록 한다.
  14. 감염 후 3h에서, 플레이트 판독기를 사용하여 바닥에서 뚜껑이 있는 배양 판의 각 우물에서 발광을 측정한 다음 배양을 배양으로 되돌려 놓습니다.
  15. 다른 원하는 시점에서 발광측정을 반복합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

이 프로토콜은 신생아 마우스에서 세균 패혈증을 유도하고, 우리는 경도 내 근위 화상 진찰, 혈액내 박테리아의 열거, 병리학의 조직학적 평가 및 염증성 사이토카인 발현 프로파일을 사용하여 질병의 과정을 연구했습니다. 이환의 표시는 시간이 지남에 따라 E.coli의 낮은 (~7 x 106 CFU) 및 높은 (~7 x 106 CFU)에 감염된 신생아 새끼에서 관찰되었습니다. 더 큰 접종을 받은 새끼는 이동성 감소, 자세를 교정할 수 없음, 24시간 후 감염(hpi)으로 직립 위치를 유지하는 장애가 있는 고통을 더 두드러지게 표시했습니다. 그러나 일부 새끼들이 다른 새끼보다 더 나빠진 것처럼 보였기 때문에 다양한 이환율이 있었습니다. 감염 직후, 저용량 동물 1명은 기준선을 확립하기 위해 이미징 세션 중 이소플루란 노출로 인해 사망했습니다. 24 마치에 의해, 6 개의 고용량 동물 중 2 개는 전신 감염에 굴복 (33.3% 사망). 고용량 또는 저용량 접종을 받은 감염된 새끼는 2...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

신생아 마우스에서 세균 패혈증을 유도하기 위한 당사의 견갑골 감염 모델은 세균 병원체의 세로 확산을 실시간으로 연구하는 새로운 방법입니다. 인트라바이탈 이미징은 신생아에서 실시간으로 세균 보급을 탐구할 수 있는 기회를 제공합니다. 이것은 세균성 보급의 운동학을 이해하고 질병의 적당한 단계에서 호스트 반응 및 손상을 추가로 연구하기 위하여 중요합니다. 마우스 새끼는 세균 성 무접종의 피하, 피하 주입을 투여한다. 이 주입 기술은 주사 부위 내에서 덜 정밀도를 필요로하기 때문에 꼬리 정맥 및 복강 내 감염과 같은 다른 일반적으로 사용되는 대안보다 간단합니다. 이것은 새끼의 작은 크기를 감안할 때 중요합니다. 인트라바이탈 이미징은 동물을 희생할 필요 없이 시간이 지남에 따라 주변 조직및 중추 신경계로 세균증 및 보급의 세로 평가를 허용합니다. 유사한 화상 진찰 접근 및 기술은 암 생물학 및 전이의 연구 결과에 이용되었습니다20,21.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 C.M.R에 기관 자금에 의해 지원되었다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1mL 인슐린 주사기Coviden1188128012접종 또는 PBS 주입
10% 중립 완충 포르말린VWR89370-094조직병리학
ACK 용해 완충액GibcoLSA1049201세균 제거 분석
동물 문신 잉크 페이스트KetchumKI1482039동물 식별
동물 문신 잉크 녹색 페이스트KetchumKI1471039Animal identification
Anti-Ly-6B.2 MicrobeadsMiltenyi Biotec130-100-781Cell isolation
Escherichia coli O1:K1:H7ATCC11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (루시페라아제를 표현)N/A/AWVU
에서 자체 제작E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA KitOmega Bio-tekR6812RNA extration
DPBS, 1XCorning21-031-CV
Difco Tryptic Soy AgarBecton, Dickinson and Company236950Bacterial growth
IL-1 beta Primer/probe (Mm00434228)ThermoFisher Scientific4331182Cytokine expression qPCR
IL-6 Primer/probe (Mm00446190)Thermo Fisher Scientific4331182사이토카인 발현 qPCR
iQ SupermixBio-Rad1708860Real-time quantitative PCR
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad1708891cDNA synthesis
Isolation BufferMiltenyi BiotecN/ABacterial clearance assay
IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 SoftwarePerkin ElmerN/AIntravital imaging
LB Broth, LennoxFisher BioReagentsBP1427-500Bacterial growth
EASYstrainer (Nylon Basket)Greiner Bio-one542 040Cell strainer
SpectraMax iD3Molecular DevicesN/APlate reader
Pellet Pestle MotorGrainger6HAZ6Tissue homogenization
Polypropylene Pellet PestlesGrainger6HAY5조직 균질화
프라임 열 순환기Techne3PRIMEBASE/02cDNA synthesis
TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258)Thermo Fisher Scientific4331182Cytokine expression qPCR
TriReagent (GTCP)Molecular Research CenterTR 118RNA extration
N

참고문헌

  1. Qazi, S. A., Stoll, B. J. Neonatal sepsis: a major global public health challenge. Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).
  2. Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. Early-onset neonatal sepsis. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014).
  3. Seman, B. G., et al. Elevated levels of interleukin-27 in early life compromise protective immunity in a mouse model of Gram-negative neonatal sepsis. Infections and Immunity. , (2019).
  4. Schrag, S. J., et al. Epidemiology of Invasive Early-Onset Neonatal Sepsis, 2005 to 2014. Pediatrics. 138 (6), 20162013(2016).
  5. Stoll, B. J., et al. Early onset neonatal sepsis: the burden of group B Streptococcal and E. coli disease continues. Pediatrics. 127 (5), 817-826 (2011).
  6. Weston, E. J., et al. The burden of invasive early-onset neonatal sepsis in the United States, 2005-2008. Pediatrics and Infectious Disease Journal. 30 (11), 937-941 (2011).
  7. Hornik, C. P., et al. Early and late onset sepsis in very-low-birth-weight infants from a large group of neonatal intensive care units. Early Human Development. , Suppl 2 69(2012).
  8. Vergnano, S., Sharland, M., Kazembe, P., Mwansambo, C., Heath, P. T. Neonatal sepsis: an international perspective. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90 (3), 220-224 (2005).
  9. Kraft, J. D., et al. Neonatal macrophages express elevated levels of interleukin-27 that oppose immune responses. Immunology. 139 (4), 484-493 (2013).
  10. Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune responses in neonates. Expert Reviews of Clinical Immunology. 10 (9), 1171-1184 (2014).
  11. Gleave Parson, M., et al. Murine myeloid-derived suppressor cells are a source of elevated levels of interleukin-27 in early life and compromise control of bacterial infection. Immunology and Cell Biology. 97 (5), 445-446 (2018).
  12. Adkins, B., Leclerc, C., Marshall-Clarke, S. Neonatal adaptive immunity comes of age. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 553-564 (2004).
  13. Kim, S. K., Keeney, S. E., Alpard, S. K., Schmalstieg, F. C. Comparison of L-selectin and CD11b on neutrophils of adults and neonates during the first month of life. Pediatrics Research. 53 (1), 132-136 (2003).
  14. Velilla, P. A., Rugeles, M. T., Chougnet, C. A. Defective antigen-presenting cell function in human neonates. Clinical Immunology. 121 (3), 251-259 (2006).
  15. Le Garff-Tavernier, M., et al. Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span. Aging Cell. 9 (4), 527-535 (2010).
  16. Weinberger, B., et al. Mechanisms underlying reduced responsiveness of neonatal neutrophils to distinct chemoattractants. Journal of Leukocyte Biology. 70 (6), 969-976 (2001).
  17. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nature Reviewss Immunology. 9 (3), 162-174 (2009).
  18. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  19. Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796(2017).
  20. Bayarmagnai, B., Perrin, L., Esmaeili Pourfarhangi, K., Gligorijevic, B. Intravital Imaging of Tumor Cell Motility in the Tumor Microenvironment Context. Methods in Molecular Biology. 1749, 175-193 (2018).
  21. Beerling, E., Ritsma, L., Vrisekoop, N., Derksen, P. W., van Rheenen, J. Intravital microscopy: new insights into metastasis of tumors. Journal of Cell Science. 124, Pt 3 299-310 (2011).
  22. Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. Bioluminescent Imaging Reveals Novel Patterns of Colonization and Invasion in Systemic Escherichia coli K1 Experimental Infection in the Neonatal Rat. Infection and Immunity. 83 (12), 4528(2015).
  23. Singh, K., et al. Inter-alpha inhibitor protein administration improves survival from neonatal sepsis in mice. Pediatric Research. 68 (3), 242-247 (2010).
  24. Pluschke, G., Pelkonen, S. Host factors in the resistance of newborn mice to K1 Escherichia coli infection. Microb. Patho. , 93-102 (1988).
  25. Mancuso, G., et al. Role of interleukin 12 in experimental neonatal sepsis caused by group B streptococci. Infections and Immunity. 65 (9), 3731-3735 (1997).
  26. Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus. Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).
  27. Andrade, E. B., et al. TLR2-induced IL-10 production impairs neutrophil recruitment to infected tissues during neonatal bacterial sepsis. Journal of Immunology. 191 (9), 4759-4768 (2013).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

신생아 패혈증 모델생체 내 영상 촬영세균 확산E. coli O1:K1:H7발광 세균 추적마이크로 CT 영상 촬영염증성 사이토카인 발현조직 조직병리학적 분석세균 부하 측정숙주 면역 반응
그람 음성 세균 패혈증의 신생아 화상 진찰 모형
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.