이 프로토콜의 목적은 RNA 염기서열 분석 데이터를 사용하여 후보 유전자의 진화 와 발현을 조사하는 것이다.
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이 논문에서
요약
초록
전체 게놈 또는 전사 데이터와 같은 대규모 데이터 집합을 증류하고 보고하는 것은 종종 어려운 작업입니다. 결과를 분해하는 한 가지 방법은 유기체와 연구에 중요한 하나 이상의 유전자 가족에 집중하는 것입니다. 이 프로토콜에서, 우리는 생물학적 단계를 설명하고 필로겐을 생성하고 관심있는 유전자의 표현을 정량화합니다. 필로유전학 나무는 유전자가 종 안팎에서 어떻게 진화하고 있는지, 그리고 종이학을 드러내는지에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이러한 결과는 RNA-seq 데이터를 사용하여 상이한 개인 또는 조직에서 이러한 유전자의 발현을 비교하는 것으로 향상될 수 있다. 분자 진화와 발현의 연구는 종 사이 유전자 기능의 진화 그리고 보존의 모드를 밝힐 수 있습니다. 유전자 가족의 특성화는 미래 연구를 위한 발판으로 봉사할 수 있고 새로운 게놈 또는 전사 종이에 있는 중요한 유전자 가족을 강조할 수 있습니다.
서론
시퀀싱 기술의 발전은 비모델 유기체의 게놈 및 전사의 시퀀싱을 용이하게 했습니다. 많은 유기체에서 DNA와 RNA를 시퀀싱하는 것의 증가된 타당성 이외에, 관심 있는 유전자를 연구하기 위하여 데이터의 풍부가 공개적으로 유효합니다. 이 프로토콜의 목적은 관심있는 유기체에서 중요한 역할을 할 수있는 유전자의 분자 진화 와 발현을 조사하기 위한 생물 정보 학적 단계를 제공하는 것입니다.
유전자 또는 유전자 가족의 진화를 조사하는 것은 생물학 시스템의 진화에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 유전자 가족의 구성원은 전형적으로 보존된 모티프 또는 동상적 유전자 서열을 식별하여 결정됩니다. 유전자 가족 진화는 이전에 먼 관련 모형 유기체1에서게놈을 사용하여 조사되었습니다. 이 접근에 제한은 이 유전자 가족이 밀접하게 관련된 종및 다른 환경 선택적인 압력의 역할에서 어떻게 발전하는지 명확하지 않다는 것입니다. 이 프로토콜에서는 밀접하게 관련된 종의 동종에 대한 검색이 포함됩니다. 필럼 수준에서 필로겐을 생성함으로써 보존 된 유전자 또는 혈통 별 복제와 같은 유전자 가족 진화의 동향을 주목할 수 있습니다. 이 수준에서, 우리는 또한 유전자가 정형 소또는 패러로그인지 여부를 조사할 수 있습니다. 많은 동형 모로그가....
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프로토콜
이 프로토콜은 UC 어바인 동물 관리 지침을 따릅니다.
1. RNA-seq 라이브러리 준비
- RNA를 다음과 같은 방법을 사용하여 분리한다.
- 샘플을 수집합니다. RNA를 나중에 추출하는 경우, RNA 저장용액(15)에 시료 또는 배치를동결한다(재료의 표).
- 관심 있는 조직을 분리하기 위해 유기체를 안락사시키고 해부한다.
- 추출 키트를 사용하여 총 RNA를 추출하고 RNA 정화 키트(재료 표)를 사용하여RNA를 정화합니다.
참고 : 다른 종 및 조직 유형16,17에더 잘 작동 할 수있는 프로토콜과 키트가 있습니다. 우리는 나비18과 젤라틴 히드라19의 다른 신체 조직에서 RNA를 추출했습니다 (토론 참조). - 각 시료의 RNA의 농도 및 품질을측정한다(재료표). RNA 무결성 번호(RIN)가 8보다 높은 샘플을 사용하여....
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결과
위의 메서드는 그림 1에 요약되어 있으며 히드라 저속조직의 데이터 집합에 적용되었습니다. H. 저속한 은 또한 산호, 해파리, 바다 말미잘을 포함하는 phylum Cnidaria에 속하는 담수 무척추 동물입니다. H. 저속한 신진에 의해 무성을 재현할 수 있으며 양분 시 머리와 발을 재생할 수 있습니다. 이 연구에서는 히드라7에서opsin 유전자의 진화와 발현을 조사하는 것을 목표로 했습니다. 히드라는 눈이 부족하지만, 그들은 빛 의존 적 행동(32)을나타낸다. Opsin 유전자는 빛의 다른 파장을 검출하고 광반 유도 폭포를 시작하는 비전에서 중요한 단백질을 인코딩합니다. 기저 종에서이 유전자 가족의 분자 진화와 발현을 조사하는 것은 동물의 눈과 빛 감지의 진화에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니.......
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토론
이 프로토콜의 목적은 RNA-seq 데이터를 사용하여 유전자 가족을 특성화하기 위한 단계의 개요를 제공하는 것이다. 이러한 방법은 다양한 종 및 데이터 집합4,34,35에대해 작동하는 것으로 입증되었습니다. 여기에 설립 된 파이프 라인은 단순화되었으며 생물 정보학의 초보자가 뒤따를 만큼 쉬워야합니다. 프로토콜의 중요성은 게시 가능한 분석을 완료하는 데 필요한 모든 단계와 필요한 프로그램을 간략하게 설명한다는 것입니다. 프로토콜의 중요한 단계는 제대로 전체 길이 성적 증명서를 조립하는 것입니다, 이것은 고품질 게놈 또는 전사에서 온다. 적절한 성적 증명서를 얻으려면 고품질 RNA 및 DNA 및 아래에 설명 된 좋은 주석이 필요합니다.
RNA-seq 라이브러리 준비를 위해, 우리는 히드라
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 우리의 워크 플로우에 이러한 단계의 일부를 통합에 조언과 지침을 아드리아나 브리스코, 길 스미스, 라비 무라드와 Aline G. Rangel 감사합니다. 우리는 또한 원고에 대한 의견에 캐서린 윌리엄스, 엘리자베스 렙보아, 나타샤 Picciani에 감사드립니다. 이 작품은 A.M.M 의학 연구 펠로우십을 위한 조지 E. 휴이트 재단에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Bioanalyzer-DNA 키트 | Agilent | 5067-4626 | 습식 실험실 재료 |
| Bioanalyzer-RNA 키트 | Agilent | 5067-1513 | 습식 실험실 재료 |
| BLAST+ v. 2.8.1 | 컴퓨터 클러스터* https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/ | ||
| Blast2GO(PC에서) | 로컬 컴퓨터에서 https://www.blast2go.com/b2g-register-basic | ||
| boost v. 1.57.0 | 컴퓨터 클러스터 | ||
| Bowtie v. 1.0.0 | 컴퓨터 클러스터 https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/ | ||
| 컴퓨팅 클러스터(적극 권장) | 참고: 게놈 데이터 분석은 파일이 매우 크기 때문에 고성능 컴퓨팅 클러스터에서 가장 잘 수행됩니다. | ||
| 커프스 단추 v. 2.2.1 | 컴퓨터 클러스터 | ||
| edgeR v. 3.26.8 (R) | Rstudio https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html | ||
| gcc v. 6.4.0 | 컴퓨터 클러스터 | ||
| Java v. 11.0.2 | 컴퓨터 클러스터 | ||
| MEGA7 (PC에서) | 로컬 컴퓨터 https://www.megasoftware.net | ||
| MEGAX v. 0.1 | 로컬 컴퓨터 https://www.megasoftware.net | ||
| NucleoSpin RNA II 키트 | Macherey-Nagel | 740955.5 | 습식 실험실 재료 |
| perl 5.30.3 | 컴퓨터 클러스터 | ||
| 파이썬 | 컴퓨터 클러스터 | ||
| Qubit 2.0 형광계 | ThermoFisher | Q32866 | 습식 실험실 재료 |
| R v.4.0.0 | 컴퓨터 클러스터 https://cran.r-project.org/src/base/R-4/ | ||
| RNAlater | ThermoFisher | AM7021 | 습식 실험실 재료 |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | 습식 실험실 재료 |
| RSEM v. 1.3.0 | 컴퓨터 소프트웨어 https://deweylab.github.io/RSEM/ | ||
| RStudio v. 1.2.1335 | 로컬 컴퓨터 https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download | ||
| Samtools v. 1.3 | 컴퓨터 소프트웨어 | ||
| SRA Toolkit v. 2.8.1 | 컴퓨터 cluster https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit | ||
| STAR v. 2.6.0c | 컴퓨터 cluster https://github.com/alexdobin/STAR | ||
| StringTie v. 1.3.4d | 컴퓨터 cluster https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/ | ||
| Transdecoder v. 5.5.0 | 컴퓨터 cluster https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases | ||
| Trimmomatic v. 0.35 | 컴퓨터 cluster http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Trinity v.2.8.5 | On computer cluster https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases | ||
| TRIzol | ThermoFisher | 15596018 | 습식 실험실 재료 |
| TruSeq RNA 라이브러리 준비 키트 v2 | Illumina | RS-122-2001 | 습식 실험실 재료 |
| TURBO DNA-free Kit | ThermoFisher | AM1907 | 습식 실험실 재료 |
| *컴퓨터 클러스터에서 다운로드 및 설치하려면 루트 액세스가 필요할 수 있습니다. 네트워크 관리자에게 문의하십시오. |
참고문헌
- Lespinet, O., Wolf, Y. I., Koonin, E. V., Aravind, L. The role of lineage-specific gene family expansion in the evolution of eukaryotes. Genome Research. 12 (7), 1048-1059 (2002).
- Gabaldón, T., Koonin, E. V. Functional and evolutionary implications of gene ortholo....
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