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방법 논문

자유롭게 행동하는 마우스의 편도체에 있는 머리 산 소형 현미경을 가진 성공적인 생체 내 칼슘 화상 진찰

11.8K 조회수

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DOI:

10.3791/61659

⸱

2020년 8월 26일

 , 
1Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 2KAIST Institute for BioCentury (KIB), Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST)

이 논문에서

요약

생체 내 미세 엔도스코픽 칼슘 이미징은 자유롭게 행동하는 동물의 신경 활동을 실시간으로 모니터링 할 수있는 귀중한 도구입니다. 그러나, 편도체에 이 기술을 적용하는 것은 어려웠습니다. 이 프로토콜은 마우스에 있는 소형화된 현미경으로 편도체 세포를 성공적으로 표적으로 하기 위한 유용한 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다.

초록

자유롭게 움직이는 동물에서 신경 활동의 생체 내 실시간 모니터링은 행동에 신경 활동을 연결하는 주요 접근 법 중 하나입니다. 이를 위해, 유전자 인코딩된 칼슘 지표(GECIs), 소형형 형광 현미경, 그라데이션 굴절지수(GRIN) 렌즈를 사용하여 뉴런의 칼슘 과도를 검출하는 생체 내 이미징 기술이 개발되어 많은 뇌 구조1,2,3,4,5,6에성공적으로 적용되었다. 이 화상 진찰 기술은 최대 몇 주까지 장기 기간 동안 유전으로 정의된 세포 집단의 만성 동시 화상 진찰을 가능하게 하기 때문에 특히 강력합니다. 유용하지만, 이 화상 진찰 기술은 편도체, 정서적 처리 및 연관 공포 기억 기억7을위한 필수적인 두뇌 구조물과 같은 두뇌 내깊은 찾아내는 두뇌 구조물에 쉽게 적용되지 않았습니다. 편도체에 이미징 기술을 적용하는 것을 어렵게 만드는 몇몇 요인이 있습니다. 예를 들면, 운동 유물은 일반적으로 두뇌에 있는 깊은 이식된 헤드 마운트 현미경이 상대적으로 불안정하기 때문에 더 깊은 두뇌 지구에서 실시하는 화상 진찰 도중 더 빈번해 깁니다. 또 다른 문제는 측면 심실이 이식된 GRIN 렌즈에 가깝게 위치하고 호흡 도중의 움직임이 쉽게 교정할 수 없는 고불규칙한 동작 아티팩트를 유발할 수 있어 안정적인 이미징 뷰를 형성하기가 어렵다는 것입니다. 더욱이, 편도체내의 세포는 일반적으로 휴식 또는 마취 상태에서 조용하기 때문에, 나중에 이미징을 위한 기질도금 절차 도중 편도체에서 GECI를 발현하는 표적 세포를 찾아 서 집중하기 어렵다. 이 프로토콜은 이러한 깊은 뇌 영역에서 생체 내 칼슘 이미징을 성공적으로 위해 헤드 마운트 소형 현미경으로 편도체에서 GECI를 발현하는 세포를 효율적으로 표적으로 하는 방법에 대한 유용한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 특정 시스템(예: Inscopix)을 기반으로 하지만 제한되지는 않습니다.

서론

칼슘은 거의 모든 세포 기능8에서중요한 역할을하는 유비쿼터스 두 번째 메신저입니다. 뉴런에서, 작용 잠재력 발사 및 시냅스 입력은 세포내 무료 [Ca2+]9,10의급격한 변화를 일으킨다. 따라서 칼슘 과도를 추적하면 신경 활동을 모니터링 할 수있는 기회를 제공합니다. GECI는 정의된 세포 인구 및 셀룰러 내구획(11,12)에서[Ca2+]모니터링을 허용하는 강력한 도구입니다. 단백질 기반 칼슘 표시기의 많은 다른 모형 중, GCaMP, 단일 GFP 분자13에근거를 둔 Ca2+ 프로브는, 가장 최적화되고 이렇게 널리 사용되는 GECI입니다. 여러 차례의 엔지니어링을 통해 GCaMP의 여러 변형이12,14,15,16을개발했습니다. 우리는 이 프로토콜16에서최근에 개발된 GCaMPPs, GCaMP7b 중 하나를 사용합니다. GCaMP센서는 개발 17 동안 Ca2+ 과도의 이미징, 특정 피질층(18)에서의생체 이미징, 모터 작업 학습19의 회로 역학 측정 및 해마및 대미20의 연관 공포 기억과 관련된 세포 앙상블 활동의이미징과 같은 다수의 모델 유기체에서 신경 회로 기능의 연구에 크게기여했다.

GECIs의 광학 이미징은 몇 가지 장점이있습니다 22. 유전 인코딩을 통해 GECI는 유전자 프로파일 또는 해부학 적 연결의 특정 패턴에 의해 정의되는 세포의 특정 하위 집합에서 장기간 안정적으로 표현 될 수 있습니다. 광학 이미징은 살아있는 동물에서 수백에서 수천 개의 뉴런을 생체 내에서 만성 동시 모니터링할 수 있게 합니다. 몇몇 광학 이미징 시스템은 헤드 마운트 소형형 광소 현미경21,23,24,25로마우스를 자유롭게 행동하는 뇌 내에서 GECIs의 생체 이미징 및 분석을 위해 개발되었다. GECIs, GRIN 렌즈 및 헤드 마운트 소형 현미경을 기반으로 한 생체 내 광학 이미징 기술이 신경 회로 활동과 행동 사이의 연관성을 연구하는 강력한 도구임에도 불구하고, 편도체에 이 기술을 적용하는 것은 GRIN 렌즈를 미막도라에서 GEC를 표현하는 세포에 표적화하는 것과 관련된 몇 가지 기술적 문제로 인해 어려웠으며, 이는 GEC의 이미지를 심각하게 저하시키는 동작 아티팩트를 유발하고 이미지를 저하시키는 데 방해가 되고 있다. 이 프로토콜은 편도체에서 생체 내 광학 칼슘 이미징에서 성공적인 단계를 위한 중요한 단계인 베이스플레이트 부착 및 GRIN 렌즈 이식의 외과 적 절차에 유용한 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 편도체를 대상으로하지만, 여기에 설명 된 대부분의 절차는 일반적으로 다른 깊은 뇌 영역에 적용됩니다. 이 프로토콜은 특정 시스템(예: Inscopix)을 기반으로 하지만 다른 대체 시스템에서동일한 목적을 쉽게 달성할 수 있습니다.

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프로토콜

모든 절차는 한국과학기술원 동물윤리위원회의 승인을 받았습니다. 모든 실험은 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 수행되었다.

참고: 이 프로토콜은 바이러스 주입 수술, GRIN 렌즈 임플란트 수술, GRIN 렌즈 이식 검증, 베이스플레이트 부착, 행동 테스트 중 GCaMP 신호의 광학 기록 및 데이터처리(그림 1A)의6가지 주요 단계로 구성됩니다. 수술을 제외하고 상업용 소프트웨어 패키지(Inscopix)가 사용됩니다.

1. 스테레오 탁스 수술 – AAV 바이러스 주입

참고 : 이 수술 에 사용되는 마우스 변형은 C57BL6 / J입니다. 동물의 몸은 수술 중 멸균 커튼으로 덮여 있으며 프로토콜의 모든 단계는 멸균 장갑을 착용하여 수행됩니다. 여러 수술은 일반적으로 같은 날에 수행되지 않습니다. 그러나, 다중 마우스가 같은 날에 동일한 수술을 해야 하는 경우, 각 마우스에 대 한 자동 성형 수술 도구의 별도 세트를 사용 하 여 70% 에탄올 마우스 사이 수술 기구를 소독. 수술 시 마우스를 따뜻하게 유지하기 위해 마우스는 스테레오 탁스 프레임에 고정 된 후 맞춤형 수술 담요로 덮여 있습니다.

  1. 필요한 모든 수술 도구를 70% 에탄올로 소독하고 해밀턴 주사기와 유리 파이펫을 준비합니다. 유리 파이펫을 증류수로 채웁니다.
    참고: 프로토콜에 사용되는 모든 수술 도구는 자동 분석됩니다. GRIN 렌즈와 두개골 나사는 살균을 위해 자동 절제를 할 수 없기 때문에 70 % 에탄올은 염증을 예방하기 위해 소독제로 사용됩니다. 시도되지는 않았지만 다른 형태의 살균(예: 가스 또는 화학 살균)을 사용할 수 있다.
  2. 관면 주사에 의해 펜토바르비탈 (83 mg∙kg-1 체중)으로 마우스를 마취시킵니다. 마우스가 의식이 없게 되면 두개골의 털을 면도합니다.
  3. 70% 에탄올로 두개골 위의 피부를 청소하고 마우스를 스테레오탁스 프레임에 고정시하십시오. 면 팁 어플리케이터를 사용하여 35% 과산화수소 용액으로 피부를 조심스럽게 제거하고 두개골 표면을 닦아냅니다. 윤활유 눈 연고를 적용하여 수술 중 각막 건조를 방지하십시오.
    참고: 일반적으로 무균 피부 제제에만 70%에탄올을 사용하는 데는 문제가 없지만 요오도프또는 클로르헨시딘 용액과 70%의 에탄올등 3개의 소독제를 번갈아 사용하는 것이 좋습니다.  과산화수소의 높은 농도는 마우스 두개골의 결합 조직이 두개골에 베이스 플레이트의 단단한 부착을 방해하기 때문에 나중에 이미징 하는 동안 모션 아티팩트를 감소시키는 데 중요한 가능한 한 완전히 제거되도록이 프로토콜에 사용됩니다. 과산화수소의 35%가 일반적으로 사용되는 것보다 훨씬 높다는 점에 유의해야 합니다(3%).
  4. 스테레오탁스 프로브 홀더로 핀을 고정합니다. 브레그마와 람다의 높이를 핀과 정렬합니다.
  5. 두개 내비절제술을 위해 마우스 두개골의 특정 위치를 찾습니다.
    참고: 바이러스 주입을 위한 측면 편도체(LA)의 좌표는 이 프로토콜에서 브레그마로부터 (-1.6mm, -3.5mm, -4.3 mm)입니다(AP; 전방 후방, ML; 내측 측측, DV; 등쪽-벤트랄, 각 약어는 브레그마로부터상대축 거리를 나타낸다)26. 좌표는 각 실험 조건에 맞게 최적화되어야 합니다.
  6. 두개골 표면을 드릴(그림 1B). 인산염 완충식식염(PBS)으로 두개골 분획을 세척합니다. 집게 또는 27 G 바늘을 사용하여 나머지 층을 제거합니다.
    1. 두개골을 드릴링 할 때, 뇌 조직 표면에 손상을 피하기 위해 마지막 듀라 층을 만지지 않도록하십시오. 손상된 뇌 표면은 렌즈 주위의 염증을 일으켜 기록 중에 심한 모션 아티팩트와 높은 자동 형광을 유발합니다. 두개골 절제술의 크기는 1.6 mm입니다. 드릴 속도는 18,000 rpm이며 비트 크기는 0.6 mm입니다.
  7. 드릴된 부위의 뇌 조직 표면에서 표적 편도체 부위로 GRIN 렌즈를 낮추기 위해, 렌즈 이식의 DV 좌표에서 도모마와 노출된 뇌 표면 사이의 DV 차이를 빼서 "밸류 A"로 명명된 거리를 계산하여, 이는 브레그마(이 경우 4.2 mm, 도 1C)에기초하여 설정된다.
  8. 미네랄 오일 3 μL및 유리 파이펫에 AAV 바이러스 용액의 0.7 μL을 적재합니다.
    참고: 미네랄 오일은 바이러스 솔루션과 물을 분리하는 데 도움이 됩니다. 0.7 μL은 LA바이러스 주입에 최적화된 부피로 LA를 완전히 커버할 수 있다.
  9. 스테레오탁스 프로브 홀더에서 핀을 제거하고 유리 파이펫을 고정합니다.
  10. 1.5단계에서 언급된 주입 부위에서 유리 파이펫을 찾습니다. 출혈이 완전히 중단된 후 유리 파이펫을 뇌 조직에 삽입합니다.
  11. 사출 펌프를 사용하여 유리 파이펫을 통해 바이러스를 전달합니다.
    참고: 바이러스의 티터는 충분한 수의 GCaMP 발현 세포를 얻기 위해 1 x10 13 vg/mL보다 높아야 합니다. 사출 속도는 0.1 μL/min이며 10분 동안 확산됩니다. 출혈이 있는 경우 PBS로 뇌 표면을 씻으시면 됩니다. 이 단계에서 뇌 표면을 적시십시오.
  12. 주입을 마친 후 유리 파이펫을 천천히 제거합니다.

2. 스테레오 탁스 수술 - GRIN 렌즈 이식

참고: GRIN 렌즈 임플란트 수술은 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. GRIN 렌즈 움직임의 일관된 느린 속도는 성공적인 GRIN 렌즈 이식에 매우 중요하기 때문에 전동 수술 팔이 유용할 수 있습니다. 전동 수술 팔은 컴퓨터 소프트웨어에 의해 제어되는 스테레오 탁스 조작기입니다. 전동 팔은 이 프로토콜에 사용되지만, 이식 중에 렌즈가 일관되고 느리게 움직이는 한 다른 방법도 사용할 수 있습니다. 장치에 대한 자세한 정보는 재료 표에 있습니다.

  1. 두개골을 뚫고 두 개의 두개골 나사를 이식합니다. PBS로 모든 두개골 분수를 씻으시다.
    참고: 이후 광학 이미징의 모션 아티팩트를 줄이려면 적어도 두 개의 나사가 필요합니다. 두 개의 두개골 나사와 GRIN 렌즈 임플란트 위치는 동등한삼각형(도 1B)을형성합니다. 두개골 절제술의 크기는 나사의 직경에 단단히 맞아야합니다. 출혈이 있는 경우 PBS로 출혈 표면을 씻으시면 됩니다. 드릴 속도는 18,000 rpm이며 비트 크기는 0.6 mm입니다.
  2. 염증을 방지하기 위해 70 % 에탄올로 나사를 소독하십시오. 나사를 가능한 한 깊이 이식합니다.
    참고: 나사는 시멘트와 같은 추가 접착 없이 단단히 고정되어야 합니다.
  3. 스테레오탁스 프레임에 전동 수술 팔을 설치합니다. 소프트웨어 제어가 설치된 랩톱 컴퓨터에 필요한 하드웨어를연결합니다(재료 표).
  4. GRIN 렌즈를 낮추기 전에 26 G 바늘로 바늘 트랙을 준비하십시오.
    참고: 바늘 트랙은 주사 경로를 따라 뇌 구조의 심각한 왜곡을 일으키지 않고 편도체와 같은 깊은 뇌 영역에 상대적으로 두꺼운 GRIN 렌즈를 이식하는 데 도움이되는 일종의 가이드 트랙입니다. 이 가이드 트랙은 상대적으로 얇은 26 G 바늘의 하강 및 상승 절차에 의해 만들어지기 때문에 바늘 트랙이라고합니다.
  5. 캐뉼라 홀더를 부착하여 스테레오탁스 프레임에 바늘을 안정적으로 고정합니다.
  6. 26 G 바늘을 캐뉼라 홀더와 잡고 바늘 삽입 부위의 좌표를 계산합니다.
    참고: 본 프로토콜에서, 바늘 삽입 부위의 좌표는 바이러스 주입 부위로부터 50 μm 측면(AP, ML, DV) = (-1.6 mm, -3.55 mm, -3.7 mm)이다.
  7. 제어 소프트웨어에 액세스하고 바늘 위치를 조작하기위한 완전한 준비.
    1. 제어 소프트웨어를 실행하고 세션 제어를 시작하려면 새 프로젝트 시작 단추를 선택합니다.
      참고: 제어 세션에는 여러 개의 빈 상자와 메뉴 버튼이 있습니다. 빈 상자는 좌표에 대한 입력 공간입니다. 빈 상자에 좌표를 입력한 후 이동 버튼을 클릭하여 전동 스테레오탁스 암이 이동합니다. 세로 팔로 이동 버튼은 스테레오탁스 암이 움직일 때 STOP 버튼으로 변경됩니다. 여러 메뉴 단추 중이 프로토콜에 도구 버튼만 필요합니다.
    2. 도구 버튼을 클릭합니다. 프레임 메뉴 보정 단추를 클릭하여 제어 소프트웨어를 보정합니다. 교정은 조작기의 실제 위치가 스테레오드라이브 소프트웨어의 값으로 설정된 프로세스입니다.
  8. 스테레오탁스 조작기로 두개골 표면에 노출된 뇌 표면에서 바늘 끝을 찾습니다.
    참고: 도구 메뉴의 마이크로드라이브 속도 메뉴를 사용하여 바늘의 속도가 설정됩니다. 기본 속도는 3.0mm/s입니다. 그러나 이 단계에서는 0.5mm/s 의 속도를 권장합니다. 바늘의 움직임은 화살표 키에 의해 제어됩니다.
  9. 뇌 표면을 습하게 유지하기 위해 PBS 2-3 방울을 추가합니다. LA의 적절한 DV 좌표로 컴퓨터 화면의 빈 상자를 채웁니다. 뇌 표면이 건조하면 바늘이 뇌 조직으로 침투하는 것을 방해합니다.
  10. 이동 버튼을 클릭하여 26G 바늘을 낮춥다. 바늘이 DV 좌표에 의해 설정된 대상 부위에 도달하면 자동으로 중지됩니다. 바늘의 속도는 100 μm / 분입니다. 출혈이 있는 경우 STOP 버튼을 클릭하여 바늘을 멈추고 PBS로 뇌 표면을 씻어내십시오. 이 단계에서 뇌 표면을 적시십시오. 출혈이 멈춘 후 다시 내리기 시작합니다.
  11. 바늘이 완전히 움직이지 않는 후 컴퓨터 화면의 빈 상자에 45.00mm를 입력합니다.
    참고: 45.00 mm는 바늘이 시작 위치로 복귀하게 하는 DV 좌표값입니다.
  12. 이동 버튼으로 클릭하여 바늘을 높이게 합니다. 바늘 이동 속도는 100-200 μm/분입니다.
  13. 바늘이 움직이지 않는 후에, 두뇌 표면에 PBS를 제거합니다. 스테레오탁스 프레임에서 바늘과 캐뉼라 홀더를 제거합니다. 실험자는 필요할 때 STOP 버튼을 클릭하여 수동으로 바늘을 멈출 수 있습니다.
  14. 스테레오탁스 로드에 렌즈 홀더를 장착합니다. 렌즈 홀더에 GRIN 렌즈를 설치합니다.
    참고: LA 타겟팅에 최적화된 GRIN 렌즈(직경 0.6mm, 길이 7.3mm)가 이 프로토콜에 사용됩니다. 렌즈 홀더가 준비되지 않은 경우, 다른 방법은 GRIN 렌즈를 잡기 위해 불독 클립을 사용하는 것입니다.
  15. 렌즈를 70% 에탄올로 소독하고 스테레오탁스 로드를 스테레오탁스 프레임에 부착합니다.
  16. 두개골 표면에 지정된 부위에서 GRIN 렌즈의 끝을 찾습니다(2.8단계에서 설명된 동일한 방법).
    참고: GRIN 렌즈의 좌표는 (AP, ML, DV) = (-1.6 mm, -3.55 mm, -4.2 mm)(그림 1C)이다. 렌즈는 팁의 손상을 피하기 위해 두개골을 만져서는 안됩니다.
  17. 2.16 단계에 기재된 렌즈 이식의 DV 좌표로부터 "값 A"의 절대값을 빼서 DV 좌표를 계산한다.
  18. 뇌 표면에 PBS 2-3 방울을 떨어 뜨립니다. 컴퓨터 화면의 빈 상자에 렌즈를 들어 올리기 위해 1000 μm과 300 μm을 입력합니다.
  19. 목표 부위에 도달할 때까지 GRIN 렌즈의 하강(1000 μm 아래쪽)과 올리름(위쪽 300 μm)을 반복합니다. 이 상하 절차는 그렇지 않으면 이식 경로를 따라 뇌 구조의 왜곡을 일으킬 수있는 렌즈의 하강 절차로 인해 뇌 조직 내부에서 생성 된 압력을 해제하는 데 사용됩니다.
    참고: GRIN 렌즈 이동 속도는 100 μm/분입니다. 출혈이 있어도 GRIN 렌즈이동을 멈추고 PBS로 뇌 표면을 씻지 마십시오. 이 단계에서 뇌 표면을 적시십시오. 뇌 표면이 건조하면 뇌 조직이 GRIN 렌즈 표면에 달라 붙어 뇌 구조의 왜곡을 일으킵니다.
  20. GRIN 렌즈가 대상 부위에 도달하면 PBS를 제거하고 GRIN 렌즈, 나사 및 측벽(그림1D)주위에 수지 치과 시멘트를 조심스럽게 적용합니다.
    참고: 수지 시멘트를 두개골 전체에 적용하면 모션 아티팩트가 감소할 수 있습니다. 반대로 수지 시멘트가 실수로 두개골에 부착된 근육을 덮으면 모션 아티팩트가 증가합니다.
  21. 수지 치과 시멘트가 굳어진 후 렌즈 홀더에서 GRIN 렌즈를 분해하고 두개골 전체에 아크릴 시멘트를 적용합니다(도1D).
  22. 헤드 플레이트를 부착하려면 스테레오탁스로드에서 렌즈 홀더를 분해하고 테이프를 사용하여 막대 끝에 헤드 플레이트를 부착합니다. 헤드 플레이트가 수평인지 확인합니다.
    참고: 기울어진 헤드 플레이트는 기울어진 뷰를 유발합니다. 이동식 홈 케이지 시스템(베이스플레이트 부착 섹션에서)에서 마우스 헤드를 고정하려면 헤드 플레이트가 필요합니다. 실험자가 시스템을 사용하지 않는 경우 이 단계(2.22단계)와 다음 단계 2.23을 건너뜁니다.
  23. 헤드 플레이트가 렌즈 커프의 상단에 위치할 때까지 막대를 천천히 낮춥다. 헤드 플레이트를 1000 μm 더 낮춥시다. 이식된 GRIN 렌즈의 헤드 플레이트를 이동하여 헤드플레이트 내부 링의 오른쪽 가장자리에 위치합니다.
    참고: 헤드 플레이트는 이식된 GRIN 렌즈 표면보다 낮게 배치되어야 합니다. 그렇지 않으면, 미근도 스코프는 아크릴 시멘트로 인해 초점 평면을 조정하기 위해 이식 된 GRIN 렌즈에 충분히 가까이 접근 할 수 없습니다.
  24. 아크릴 시멘트를 적용하여 헤드 플레이트를 시멘트층(도 1D)에부착합니다.
  25. 이식된 GRIN 렌즈 표면에 파라핀 필름을 부착하여 렌즈 표면을 먼지로부터 보호합니다. 그런 다음 파라핀 필름에 이동식 에폭시 결합을 적용하여 파라핀 필름이 렌즈 표면에 유지하도록 합니다.
  26. 카프로펜, 진통제 (PBS에서 0.5 mg/mL), 및 덱사메타손, 항 염증 약물 (PBS에서 0.02 mg/mL) 용액, 마우스의 복막 구멍에 주입.
    참고: 약물의 복용량은 체중에 따라 달라 집니다: Carprofen (5 mg∙kg-1 체중) 및 덱사메타손 (0.2 mg∙kg-1 체중). 카프로펜과 덱사메타손은 수술 후 하루에 한 번, 수술 후 7일 동안 투여됩니다.
  27. 혼합 0.3 mg/mL amoxicillin, 항생제, 홈 케이지 물에 1 주 동안 약물을 관리.
  28. 홈 케이지에 마우스를 반환하고 복구 및 바이러스 변환에 대한 5-8 주를 허용합니다.
    참고: 마우스가 마취제에서 깨어날 때까지 마우스는 전기 담요에 미리 데워진 케이지에서 회수됩니다.

3. GRIN 렌즈 이식 의 검증

참고: GRIN 렌즈 이식의 유효성 검사는 이식된 GRIN 렌즈가 GCaMP발현 세포를 대상으로 하고 있는지 여부에 대한 정보를 제공합니다. 이 정보를 바탕으로 실험자는 비지 테스트 및 데이터 처리와 같은 시간이 많이 소요되는 프로세스에서 분리된 GRIN 렌즈 이식을 사용하는 동물을 제외하여 시간을 절약합니다. 유효성 검사 절차 중에 GCaMP 식을 사용하는 셀은 뷰 기록 필드에 집중해야 합니다. 이 단계에서는 모바일 홈 케이지가 사용됩니다. 모바일 홈 케이지는 GRIN 렌즈 이식 및 베이스 플레이트 부착의 검증 중에 머리 고정 마우스가 자유롭게 다리를 움직일 수 있도록 하는 특수 원형 장치입니다. 머리 고정 마우스의 다리가 배치되는이 장치의 공수 테이블은 머리가 고정되어 있지만 다리의 자유로운 움직임을 가능하게합니다. 편도체의 측면 핵에 있는 세포는 일반적으로 휴식 또는 마취 상태에서 조용하기 때문에 GCaMP 형광 신호는 이러한 조건에서 거의 검출되지 않으므로 GRIN 렌즈 이식 및 기판 부착의 검증 중에 GCaMP를 표현하는 세포를 찾기가 매우 어렵고 때로는 불가능합니다. 그러나, 다리의 움직임은 종종 편도체의 측면 핵의 세포에서 GCaMP 형광 신호를 생성하고 그로 인하여 현미경을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 이동식 홈 케이지는 이 프로토콜에 사용됩니다.

  1. 입체 조작기를 모바일 홈 케이지 시스템에 조립합니다.
  2. 1.5% 이소플루란 가스로 마우스를 마취시화합니다. 마우스가 완전히 무의식한 후, 이동식 홈 케이지 시스템의 헤드 바에 마우스를 놓습니다.
  3. 마우스 아래에 카본 케이지를 찾습니다. 카본 케이지를 닫고 공기 흐름을 켜서 케이지가 마찰없이 자유롭게 움직일 수 있도록 합니다. 마우스가 활성화될 때까지 몇 분 간 기다립니다.
    참고: 공기 흐름의 속도는 각 실험 상태(여기, 100 L/min)에 최적화되어야 합니다.
  4. 이식된 GRIN 렌즈 표면에 파라핀 필름과 에폭시 결합을 제거하고 렌즈 용지를 사용하여 70%에탄올로 렌즈 표면을 닦아냅니다.
  5. DAQ(데이터 수집) 소프트웨어(예: Inscopix)를 준비합니다. 이미징 조건을 설정합니다.
    참고: DAQ 소프트웨어는 현미경(LED 전원, 렌즈 포커스등)및 데이터 저장을 제어하는 데 사용됩니다.
    1. DAQ 상자를 켜고 현미경을 연결합니다. 그런 다음 케이블을 직접 사용하거나 무선 인터넷을 통해 랩톱 컴퓨터에 연결합니다.
      참고: DAQ 소프트웨어는 DAQ 상자(예: Inscopix)라는 추가 하드웨어에 설치됩니다. DAQ 상자를 랩톱 컴퓨터에 연결하면 랩톱 컴퓨터에서 DAQ 소프트웨어에 액세스할 수 있습니다.
    2. 인터넷 브라우저를 통해 DAQ 소프트웨어에 액세스하십시오(Firefox는 권장사항).
    3. 정의된 세션에서필요한 모든 세부 정보(날짜, 마우스 ID등)를설정합니다. 그런 다음 저장을 클릭하고 계속합니다. 저장 한 후 실행 세션에액세스합니다.
    4. Run 세션에서노출시간, 게인, 전자 초점 및 노출 LED 전력과 같은 이미징 조건을 설정합니다.
      참고: 게인 및 노출 LED 전력은 실험실 조건에 따라 변경할 수 있습니다. 전기 초점에 권장되는 값은 500이고 노출 시간은 50 ms입니다. LED 전력 및 게인을 변경하는 데는 제한이 없습니다. 그러나, 빛의 높은 강도 더 표백을 일으킬 수 있습니다. 녹화 의 노출 시간은 비디오 녹화의 프레임 속도를 결정합니다. 프레임 속도가 높을수록 신호 강도가 줄어듭니다. 프레임 속도는 이미징에 사용되는 GECI에 최적화되어야 합니다.
  6. 스테레오탁스 조작기에서 현미경을 유지하려면 현미경 그리퍼가 있는 스테레오탁스 로드를 스테레오탁스 조작기에 부착합니다.
    참고: 그리퍼는 표적 뇌 위치에 배치하기 위한 현미경 본체를 보유하기 위해 스테레오탁틱 장치에 부착할 수 있는 작은 액세서리이다.
  7. 현미경 그리퍼로 현미경을 그립. 현미경에 연결된 LED 라이트를 켜고 현미경을 수직으로 정렬합니다. 이식된 GRIN 렌즈의 표면이 나타나기 전까지 이미지를 관찰하면서 현미경을 낮춥춥시다.
  8. 이식된 GRIN 렌즈의 중심을 뷰의 중심과 정렬합니다.
    참고: GRIN 렌즈 이식의 유효성 검사는 이 단계에서 수행될 수 있다(결과 섹션, 도 2B, 도 2D, 도 2F)에서언급).
  9. 이식된 GRIN 렌즈 표면의 이미지를 캡처합니다(키보드의 Prt Sc 버튼을 클릭합니다). 이식된 GRIN 렌즈 표면의 이미지는 이후 데이터 처리(단계 6.8)에서 비신경 성분을 선택 해제하는 데 필요합니다.
  10. 현미경의 적절한 위치를 찾습니다. GCaMP7b 발현을 가진 세포를 검색하기 위하여 심상을 관찰하는 동안 현미경의 객관적인 렌즈를 천천히 상승시킵니다.
    참고: 이미지 획득 또는 노출 LED 전력의 게인을 조정해야 할 수도 있습니다. GRIN 렌즈 이식의 유효성 검사는 이 단계에서 수행될 수 있다(결과 섹션, 그림 2A, 도 2C, 도 2E)에서언급).

4. 베이스 플레이트 부착

참고: 베이스플레이트 부착 단계는 GRIN 렌즈 이식의 유효성 검사를 따릅니다. 베이스 플레이트는 마우스의 머리에 현미경을 장착하기위한 플랫폼입니다. 이전 섹션에서 설명한 대로 이 프로토콜에서 모바일 홈 케이지가 사용됩니다.

  1. GRIN 렌즈 이식을 검증한 후 현미경 그리퍼에서 소형 현미경을 분해합니다.
  2. 현미경에 베이스 플레이트를 부착합니다. 현미경에 베이스 플레이트의 안정적인 부착을 위해 육사 키를 사용하여 나사를 조입니다.
  3. 현미경 그리퍼로 현미경을 그립. 현미경에 연결된 LED 라이트를 켜고 현미경을 수직으로 정렬합니다. 이식된 GRIN 렌즈의 표면이 관찰될 때까지 현미경을 낮춥춥시다. 이식된 GRIN 렌즈의 중심을 뷰의 중심과 정렬합니다.
  4. 현미경의 적절한 위치를 찾습니다. GCaMP7b 발현(그림2A)을사용하여 세포의 최상의 이미지를 제공하는 초점 평면을 찾을 때까지 현미경의 객관적인 렌즈를 천천히 상승시킵니다.
    참고: 이 단계에서 이미지 수집 또는 노출 LED 전력의 게인을 조정해야 할 수도 있습니다.
  5. 아크릴 시멘트를 적용하여 베이스 플레이트를 헤드플레이트(도 2G)에안정적으로 부착합니다. 베이스 플레이트와 헤드 플레이트 사이에 아크릴 시멘트로 사이드월을 구축합니다.
    참고: 아크릴 시멘트가 굳어지면 수축됩니다. 이러한 이유로, 시멘트가 완전히 경화 될 때까지 현미경을 제거하지 마십시오 (이 단계는 적어도 30 분 소요). 시멘트는 아크릴 시멘트와 현미경과 객관적인 렌즈의 원치 않는 시멘트를 피하기 위해 매우 신중하게 수행해야합니다.
  6. 아크릴 시멘트가 완전히 굳어진 후 나사를 풀고 현미경 본체를 천천히 상승시킵니다.
  7. 측벽에 틈이 있는 경우 이식된 GRIN 렌즈를 먼지로부터 보호하기 위해 추가 시멘트를 다시 수행하십시오.
  8. 베이스 플레이트를 덮어 이식된 GRIN 렌즈를 먼지로부터 보호하고 베이스 플레이트의 나사를 조입니다.
  9. 헤드 바에서 헤드 플레이트를 놓습니다. 미래의 광학 이미징이 될 때까지 마우스를 홈 케이지로 반환합니다.

5. 행동 테스트 중 GCaMP 신호의 광학 기록

참고: 행동 중 GCaMP 신호 기록 절차는 광학 이미징, 실험 설계 및 실험실 환경에 사용되는 시스템에 따라 매우 다를 수 있습니다. 따라서 이 섹션에서간단한 방법으로 설명된다.

  1. 동작 테스트 전에 며칠 동안 처리합니다.
  2. 동작 장치(예: 공포 컨디셔닝 챔버, 동작 소프트웨어 및 쿨본 계측기) 및 랩톱 컴퓨터를 준비합니다.
  3. 현미경을 DAQ 상자에 연결하고 DAQ 상자를 켭니다.
  4. 무선 인터넷 연결을 통해 DAQ 박스를 랩톱 컴퓨터에 연결합니다.
  5. 랩톱 컴퓨터에서 DAQ 소프트웨어(Firefox 브라우저권장)를 시작합니다.  파일 관리자 버튼을 클릭하고 기록된 데이터를 저장하려면 DAQ 상자의 나머지 저장소 용량을 확인합니다.
    참고: 데이터 크기는 30분 동안 약 80GB입니다.
  6. 정의된 세션에서 필요한 정보(날짜, 마우스 ID등)를입력하고 실행 세션에입력합니다.
  7. 마우스를 부드럽게 잡고 머리에 베이스 플레이트 커버를 제거합니다. 베이스 플레이트 플랫폼에 현미경을 배치합니다.
  8. 베이스 플레이트 나사를 조이고 머리 탈 미세 한 소경으로 동물을 행동 챔버에 배치합니다.
    참고: 처리가 충분하지 않은 경우 마우스가 이 단계에서 탈출하려고 합니다.
  9. BNC 케이블을 사용하여 NI 보드를 DAQ 상자의 TRIG 포트에 연결합니다. NI 보드는 동작 소프트웨어(예: FreezeFrame)로부터 TTL 신호를 수신하고 GCaMP 신호 및 동물의 동작의 동시 기록 절차를 조정합니다.
  10. 초점 평면을 조정합니다.
    참고: 초점 평면은 현미경의 객관적인 렌즈와 뇌에 이식된 GRIN 렌즈 사이의 거리에 의해 결정됩니다. 초점 평면을 조정하기 위해 이미지를 관찰하는 동안 객관적인 렌즈 위치를 조작합니다. 세포와 혈관의 명확한 형태를 보여주는 그 두 렌즈 사이의 거리는 이미징을위한 초점 평면으로 설정됩니다. 이 프로토콜에서 DAQ 소프트웨어는 조정 중에 목표 렌즈의 움직임을 제어하는 데 사용됩니다.
  11. 실행 세션에서 최적화된 노출 시간, 게인, LED 전원을 설정합니다.
    참고 : 일반적으로 50 ms는 노출 시간에 사용됩니다. 게인 및 LED 전력은 이미지 히스토그램을 기반으로 설정됩니다. 히스토그램은 픽셀의 형광 강도의 분포를 나타냅니다. 육안 검사를 기반으로 히스토그램의 오른쪽 가장자리는 GCaMP7b의 경우 40%에서 60% 사이의 값을 가져야 합니다. 이미징에 사용되는 GECIs에 따라 변경됩니다.
  12. 녹화 옵션을 트리거된 레코딩으로 변경합니다. 레코드를 클릭하고 동작을 시작합니다.
    참고: 트리거된 레코딩 옵션은 레코딩 세션및 동작 세션의 일치하는 타임라인을 제공합니다. TTL 신호가 수신되면 TRIG 포트 위의 빨간색 표시등이 켜집니다.
  13. 행동 테스트를 마친 후 현미경을 분리하고 베이스 플레이트 커버를 부착하십시오.
  14. 마우스를 홈 케이지로 반환합니다. 그런 다음 DAQ 상자에서 파일 관리자를 선택하고 데이터를 내보냅니다.
  15. 행동 테스트 후, 사후 조직 학적 검증을 위해 마우스를 희생.

6. 데이터 처리

참고: 데이터 처리 절차는 이미징 실험에 사용되는 데이터 처리 소프트웨어 및 GECI에 따라 매우 다릅니다. 따라서 이 섹션에서간단한 방법으로 설명된다. 이 프로토콜은 상용 데이터 처리 소프트웨어를 사용합니다(재료 표참조). 또는 토론 섹션에 언급된 다른 오픈 소스 소프트웨어도 문제 없이 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 변수는 표 1에나열됩니다.

  1. DAQ 상자에서 데이터 처리를 위해 녹화 비디오 데이터 파일(1280픽셀 x 800픽셀)을 데스크톱 컴퓨터로 가져옵니다. 데이터 처리 소프트웨어를 시작합니다.
    참고: 데이터 처리 소프트웨어는 이전 단계의 DAQ 소프트웨어와 다릅니다. 데이터 처리 소프트웨어에는 다운 샘플링, 자르기, 공간 필터, 모션 보정, ΔF/F 계산, 녹화된 비디오에서 단일 셀 칼슘 과도 데이터를 추출하는 데 필요한 이벤트 감지 의 6단계가 있습니다.
  2. 다운샘플링 및 비디오를 자르기.
    참고: 데이터 처리 속도를 높이기 위해서는 다운샘플링 및 자르기가 필요합니다. GCaMP 신호가 관찰되는 관심 영역을 제외한 영역을 자르는 것입니다.
  3. 공간 필터를 적용합니다. 공간 필터를 적용한 후 평균 강도 투영 이미지를 만듭니다.
    참고: 공간 필터는 녹화된 비디오 이미지의 각 픽셀을 구별하고 고대비 이미지를 제공합니다. 컷오프 필터에는 저컷오프 필터와 높은 컷오프 필터의 두 가지 유형이 있습니다. 컷오프 필터의 값이 높을수록 이미지대비가 높아지지만 전체 회색 노이즈도 증가합니다. 높은 컷오프 필터의 값이 낮으면 이미지가 흐릿해집니다.
  4. 모션 보정을 적용합니다. 평균 강도 프로젝션 이미지를 모션 보정을 위한 참조 이미지로 사용합니다.
  5. 첫 번째 프레임의 이미지를 참조 이미지로 사용하여 모션 보정을 다시 적용합니다.
    참고: 모션 보정의 두 단계는 모션 아티팩트를 크게 줄입니다.
  6. ΔF/F 계산을 적용하여 밝기의 변화를 보여주는 픽셀을 시각화합니다.
    참고: 픽셀의 밝기 변화는 GCaMP의 형광 강도 변경에 기인하며 칼슘 과도를 나타냅니다.
  7. PCA/ICA 알고리즘을 적용하여 각 세포의 칼슘 과도 곡선을 시각화합니다.
    참고: PCA/ICA는 데이터 그룹을 단일 구성 요소 데이터 집합으로 정렬하기 위한 알고리즘입니다. 변수는 각 실험실 상태에 최적화되어야 합니다. 이 프로토콜에서 ICA 측두중량(0.4이 프로토콜에 사용)(27)를제외한 모든 변수는 기본값입니다.
  8. 다음 Note에 설명된 기준에 따라 식별된 구성 요소 간에 수동으로 비신경 성분을 선택 해제합니다.
    참고: 이 목적을 위해 두 가지 주요 기준이 사용됩니다. 첫째, 뉴런에서 유래된 GCaMP 신호는 명확한 구형 모양처럼 보입니다. 따라서 명확한 구형 형상을 가진 신호만 뉴런으로 선택된다. 둘째, 편도체 피라미드 세포의 세포 체체의 직경을 감안할 때 약 20 μm28,29,30으로알려져 있으며, 이 크기와 대략 일치하는 신호만이 뉴런으로 선택된다. GCaMP 신호의 크기를 결정하기 위해 단일 픽셀의 실제 크기는 렌즈 표면(3.9단계)의 캡처된 이미지(단계 3.9)와 단일 구형 형상의 최대 폭을 기준으로 계산됩니다. 예를 들어, 이 프로토콜에서 이식된 GRIN 렌즈의 직경은 600 μm이다. 따라서 렌즈의 직경이 800픽셀인 경우 단일 픽셀의 실제 크기는 1.5 μm(20μm은 약 7픽셀)입니다.
  9. 이벤트 감지 기능을 적용하여 칼슘 과도(칼슘 이벤트)의 현저한 증가를 감지합니다.
    참고: 이 단계에서는 이벤트 최소 감소 시간(θ)이라는 변수가 필요합니다. 이 프로토콜에서 1.18s는 GCaMP7b에 최적화된 변수로 사용됩니다. 평균 반 부패 시간(t1/2=0.82s)은 세포의 자발적인 활성 동안 ΔF/F 곡선을 기준으로 계산됩니다. GCaMP는 기하급수적 부패를 따르기 때문에 θ = figure-protocol-1 .

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결과

GRIN 렌즈 이식 의 검증
만성적으로 시멘트를 통해 뇌에 베이스 플레이트를 부착하기 전에 GRIN 렌즈 이식을 검증해야 합니다. 렌즈 이식이 성공한 동물의 경우, GCaMP 발현 세포와 혈관 모두 현미경의 객관적인 렌즈와 이식된 GRIN렌즈(그림 2A 및 B)사이의거리에 의해 결정된 초점 평면 범위 내에서 명확하게 관찰되었다. 대조적으로, 오프 타겟 이식을 가진 동물에서는, GCaMP 발현 세포의 명확한 심상이 초점 평면 범위 내에서 관찰되지 않았습니다 (초점이 외하거나 보이지 않는). 초점이 맞지 않는 경우, 잘 초점을 맞춘 혈관을 관찰할 수 있지만 초점 평면 범위 내의 세포에 대해서만 흐릿한이미지(그림 2C및 D). 보이지 않는 경우, 혈관은 대부분의 경우 관찰되지 않았으며 초점 평면 범위...

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토론

숙련된 수술 기술은 우리가 여기에서 설명한 편도체와 같은 더 깊은 두뇌 지구에 있는 헤드 마운트 소형 현미경 검사법을 가진 생체 내 광학 칼슘 화상 진찰에서 성공을 달성하기 위해 필수적입니다. 따라서 이 프로토콜은 베이스플레이트 부착 및 GRIN 렌즈 이식의 최적화된 수술 과정에 대한 지침을 제공하지만 중요한 단계에 추가 최적화 프로세스가 필요할 수 있습니다. 프로토콜 섹션에서 언급했듯이 수술의 편도체 좌표, 기류 부착 단계의 기류 속도, 칼슘 레코딩 및 변수(ICA 측두중량, 이벤트 가장 작은 감쇠 시간등)에서이미지 수집 설정(프레임 속도, LED 전원등)을데이터 처리에 최적화할 필요가 있다.

베이스 플레이트 부착 단계를 수정할 수 있습니다. 헤드 플레이트는 모바일 홈 케이지에서 실시베이스 플레이트 부착 중에 깨어있는 마우스의 머리를 고정하는 데 도움이되기 때문에 필요합니다. 그러나, 이동식 홈 케이지가 실험실에서 준비되지 않은 경우, 이소플루란...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다

감사의 글

이 사업은 삼성과학기술재단(프로젝트 번호 SSTF-BA1801-10)의 보조금으로 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
26G 바늘BD302002수술
AAV1-Syn-GCaMP7b-WPREAddgene104493-AAV1수술
AAV2 / 1-CaMKiiα -GFP맞춤형수술
아크릴 - 치과 시멘트 (오르토 제트 아크릴 핑크)Lang1334- 핑크수술 & 베이스 플레이트 어태치먼트
공기 흐름 매니퓰레이터NeurotarNTR000253-04베이스 플레이트 어태치먼트
AmoxicillinSIGMAA8523-5G수술
베이스 플레이트INSCOPIX1050-002192베이스 플레이트 어태치먼트
베이스 플레이트 커버INSCOPIX1050-002193베이스 플레이트 어태치먼트
행동 장치(챔버)Coulbourn 기기Testcage거동 테스트
행동 장치 (소프트웨어)Coulbourn 기기Freeze Frame거동 테스트
카본 케이지Neurotar180mm x 70mm베이스 플레이트 부착
CarprofenSIGMAPHR1452-1G
수술 데이터 처리 소프트웨어INSCOPIXINSCOPIX 데이터 처리 소프트웨어베이스 플레이트 첨부 파일 & 행동 테스트
DexamethasoneSIGMAD1756-500MG수술
드릴세양마라톤-4수술
드릴 버ELAUS1/2, 생크104
수술 유리 바늘WPIPG10165-4수술
그린 렌즈(INSCOPIX Proview 렌즈 프로브)INSCOPIX1050-002208수술
해밀턴 주사기해밀턴84875수술
헤드 플레이트Neurotar모델 5수술
육각 키INSCOPIX1050-004195베이스 플레이트 부착
노트북 컴퓨터삼성NT950XBV수술 및 베이스 플레이트 어태치먼트
렌즈 홀더, 입체 막대 (INSCOPIX proview 임플란트 키트)INSCOPIX1050-004223수술
현미경 그리퍼INSCOPIX1050-002199플레이트 어태치먼트
현미경, DAQ 소프트웨어, 하드웨어INSCOPIXnVista 3.0베이스 플레이트 어태치먼트 & 행동 테스트
모바일 홈 케이지NeurotarMHC V5베이스 플레이트 부착물
동력 화 된 팔Neurostar맞춤형수술
Moterized 팔 소프트웨어Neurostar맞춤형수술
NI 보드National instrument행동 테스트
탈착식 에폭시 본드WPIKwik-Cast수술
수지 시멘트 (Super-bond)Sun medicalSuper bond C& B수술
두개골 나사스톨팅51457수술
입체 전극 홀더ASIEH-600수술
입체 운동 프레임스톨 팅51600수술
입체 매니퓰레이터스톨 팅51600플레이트 부착
물 베이스 베이스

참고문헌

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