뉴런에 다양한 시냅스 입력의 통합은 자연 타이밍과 회로 가소성을 위해 모든 사전 시냅스 핵을 보존하는 준비에서 가장 잘 측정되지만, 뇌 슬라이스는 일반적으로 많은 연결을 끊습니다. 우리는 생체 외 실험 능력을 유지하면서 생체 내 회로 활동을 모방하는 수정 된 뇌 조각을 개발했습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
체외 슬라이스 전기 생리학 기술은 정확한 전기 및 측두성 해상도로 단일 세포 활동을 측정합니다. 뇌 슬라이스는 패치 클램핑 이나 이미징을 위해 뉴런을 적절히 시각화하고 액세스하기 위해 상대적으로 얇아야하며 뇌 회로의 체외 검사는 급성 슬라이스에 물리적으로 존재하는 것으로만 제한됩니다. 시험관 내 슬라이스 실험의 이점을 유지하면서 시냅스 핵의 더 큰 부분을 보존하기 위해, 우리는 새로운 슬라이스 준비를 개발했다. 이 "웨지 슬라이스"는 뇌의 내측 올리고 올리고(MOC) 뉴런에 대한 다양한 모노알, 사운드 구동 입력을 특성화하기 위해 패치 클램프 전기 생리학 기록을 위해 설계되었습니다. 이러한 뉴런은 콘트라탈 귀및 상응하는 달팽이관 핵(CN)에서 자극에 의해 활성화된 뉴런으로부터 그들의 1차 발포성 흥분및 억제 입력을 수신한다. 비대칭 뇌 슬라이스는 한 반구의 측면 가장자리에서 로스트로 -caudal 도메인에서 가장 두꺼운 다음 반대 반구의 측면 가장자리를 향해 얇게 설계되었습니다. 이 슬라이스에는 청각 자극에 대한 정보를 뇌에 전달하는 청각 신경 뿌리, 본질적인 CN 회로, 및 모순된 MOC 뉴런에 수렴하는 소멸 흥분 및 삼중 억제 성 포렌티드 경로가 모두 포함되어 있습니다. 레코딩은 슬라이스의 얇은 면에 있는 MOC 뉴런에서 수행되며, 여기서 일반적인 패치 클램프 실험을 위해 DIC 광학을 사용하여 시각화됩니다. 청각 신경의 직접적인 자극은 청각 뇌간에 들어갈 때 수행되며, 내식 CN 회로 활동과 시냅스 가소성이 MOC 뉴런의 상류시냅스에서 발생할 수 있도록 합니다. 이 기술을 사용하면 조각 내에서 가능한 한 가깝게 생체 내 회로 활성화를 모방할 수 있습니다. 이 쐐기 슬라이스 준비는 회로 분석이 생체 외 슬라이스 생리학의 기술적 이점과 함께 업스트림 연결 및 장거리 입력의 보존의 혜택을 누릴 수있는 다른 뇌 회로에 적용됩니다.
서론
신경 회로의 활동의 관찰은 이상적으로 네이티브 감각 입력 및 피드백, 그리고 뇌 영역 사이의 그대로 연결, 생체 내에서 수행된다. 그러나 신경 회로 기능의 단일 세포 해상도를 제공하는 실험을 수행하는 것은 여전히 뇌의 기술적 과제에 의해 제한됩니다. 생체 외 세포 외 전기 생리학 또는 다광화상 방법은 그대로 신경계에서 활동을 조사하는 데 사용될 수 있지만, 다른 입력이 어떻게 통합되는지 해석하거나 하위 임계 값 시냅스 입력을 측정하는 것은 여전히 어렵습니다. 생체 내 전세포 기록은 이러한 한계를 극복하지만 쉽게 접근 할 수있는 뇌 영역에서도 수행하기가 어렵습니다. 단일 세포 분해 실험의 기술적 과제는 뇌 깊숙이 위치한 특정 뉴런 집단또는 생체 내에서 세포를 찾기 위해 유전 적 도구가 필요한 공간적으로 확산되는 집단(예: 옵트로드 레코딩과 결합된 채널로돕신의 유전적 발현) 또는 기록 사이트 라벨링 후 의학적 식별(예: 신경 전달 마커)에서 더욱 증폭됩니다. 뇌간의 복부 표면 근처에 확산되는 내측 올리고엽아(MOC) 뉴런은 위의 한계1로인해 생체 내 실험에 액세스하기가 매우 어렵다.
뇌 슬라이스(~100-500 μm 두께)는 동일한 슬라이스2,
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
모든 실험 절차는 청각 장애 및 기타 통신 장애 동물 관리 및 사용위원회에 신경 장애 및 뇌졸중 / 국립 연구소의 국립 연구소에 의해 승인되었다.
1. 실험 적 준비
참고: 슬라이스 용액, 슬라이스 온도, 슬라이스 인큐베이션 온도 및 장치(등)를 포함한 슬라이스 제제에 대한 세부 사항은 이 실험에서 수행된 뇌간 제제에 특이적이다. 슬라이스 인큐베이션 세부 사항은 실험실 경험당 변경할 수 있습니다.
- 패치 클램핑을 위한 내부 솔루션을 준비합니다.
- (mM) 76 Cs-메탄술포네이트, 56CsCl, 1 MgCl2,1 CaCl2,10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na2-인포크레아틴, 5 QX-314, 및 0.01 알렉사 플루오드를 함유하는 전압 클램프 솔루션을 준비합니다. PH를 CsOH로 7.2로 조정합니다.
- 현재 클램프 용액(mM) 125 K-글루코네이트, 5KCl, 1 MgCl2,0.1 CaCl2,10 HEPES, 1 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na 2-인포크레아틴, 및 0.01 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
웨지 슬라이스의 조직학적 검사
청각 뇌간 뉴런 기능에 대한 당사의 조사를 위해, 웨지 슬라이스 제제는 기록(도 1B에도시된 예시 슬라이스)을 표적으로 한 MOC 뉴런에 청각 신경 근과 CN 모순을 포함하도록 설계되었다. 초기 조직학적 검사는 슬라이스가 회로 활성화에 필요한 핵을 포함하고 축축투영이 손상되지 않음을 확인하는 것이 중요하다. CN 내의 두 세포 유형은 MOC 뉴런에 사운드 정보를 제공합니다. T-stellate 세포는 MOC 뉴런39,40,41,58에흥분 입력을 제공하기 위해 가설된다. 구형 부시 세포(GBC)는 금단반구에서 MNTB 뉴런을 자극한다(개최 시냅스의 전문 칼립스를 통해)
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
여기에 설명된 슬라이스 절차는 웨지 슬라이스라고 불리는 것은 그대로 사전 시냅스 뉴런 회로를 유지하기위한 강력한, 하지만 신경 기능의 분석을위한 뇌 슬라이스 실험의 접근성. 회로 분석 준비의 유용성을 극대화하기 위해 몇 가지 초기 단계에서 세심한 주의를 기울여야 합니다. 웨지의 치수는 조직학적 검사를 사용하여 확인되어야 하며, 이는 사전 시냅스 핵과 축삭 투영이 준비된 쐐기 슬라이스 내에 포함되어 있음을 확인하는 데 필수적입니다. 슬라이스 형상은 프로젝션이 절단되거나 몇 개의 축삭이 표적 핵에 도달하면 수정이 필요할 수 있습니다. 더 일반적으로 웨지 슬라이스의 진동에 마무리 컷이 매우 중요합니다. 최적의 웨지 슬라이스 준비는 알려진 뇌 랜드마크를 기반으로 설정 조정과 함께 스테이지 베이스에 동심 원 표시를 사용하는 것을 포함하여 진동 구성의 일관된 사용의 조합이 필요합니다. 슬라이스 형상을 최적화한 후, 18개의 쐐기 슬라이스 중 8개에서 청각 신경 근을 전기적으로 자극하여 불러일으킨 MOC 뉴런에서 일관된 PSC를 기록했습니다.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Experimental Preparations | |||
| Agar, powder | Fisher Scientific | BP1423500 | 진동 절편 중 뇌 조직을 안정화하는 데 사용되는 4% 한천 블록 |
| AlexaFluor Hydrazide 488 | Invitrogen | A10436 | Fluorophore는 성공적인 MOC 뉴런 패치를 확인하기 위해 내부 용액에 사용됩니다 |
| . 분석 균형 | 유전자 Scientific (Intramalls) | AV114 | 계량 화학 물질 |
| 양날 면도날 | Ted Pella | 121-6 | Vibratome 절단 날 |
| Kynurenic acid (5g) | Sigma Aldrich | K3375-5G | 슬라이싱 ACSF 첨가제 패치 클램핑을 위한 조직 건강을 개선하기 위해 해부 및 슬라이싱 중 뉴런 활동을 줄이는 데 사용 |
| pH 측정기 | Fisher Scientific (Intramalls) | 13-620-451 | 용액 pH 테스터 |
| 플라스틱 페트리 접시 100mm 직경 X 20mm | Fisher Scientific (Intramalls) | 12-556-002 | 4% 한천 |
| 준비 교반 핫플레이트 | Fisher Scientific (Intramalls) | 11-500-150 | 4% 한천 준비 |
| <강한>해부 및 슬라이싱 | |||
| Biocytin | Sigma Aldrich | B4261-250MG | 축삭 추적에 사용되는 화학 물질 (Streptavidin 488에 접합) |
| 해부 현미경 | Amscope | SM-1BN | 뇌 제거 중 정밀 해부 |
| Dumont # 5 집게 | 미세 과학 도구 | 11252-20 | 미세 집게 해부 도구 |
| 이코노미 핀셋 # 3 | WPI | 501976 | 집게 해부 도구 |
| 유리 페트리 접시 150mm dia x 15mm H | Fisher Scientific (Intramalls) | 08-747E | 해부 접시 |
| 인터페이스 종이 (203 X 254mm PCTE 멤브레인 10um) | Thomas Scientific | 1220823 | 슬라이스 배양 / 바이오 사이틴 응용 |
| 라이카 VT1200S Vibratome | Leica | 1491200S001 | 쐐기 슬라이스 절단 용 Vibratome |
| Mayo 가위 | Roboz | RS-6872 | 해부 도구 |
| 외날 탄소강 블레이드 | Fisher Scientific (Intramalls) | 12-640 | 해부용 면도날 |
| 표본 디스크, 오리엔테이션 | 라이카 | 14048142068 | 재현 가능한 틸팅을 위한 특수 비브라톰 스테이지 |
| Spoonula | FisherSci | 14-375-10 | 해부 도구 |
| Super Glue | Newegg | 15187 | 비브라톰 스테이지 |
| 에 조직을 접착하는 데 사용Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | 해부 도구 |
| Electrophysiology | |||
| A1R 직립 컨포칼 현미경 | Nikon Instruments | 전기생리학 및 이미징 현미경은 전기생리학과 | |
| 호환되는 모든 현미경이 될 수 있습니다.전극 붕규산 유리 w/ 필라멘트 OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10cm 길이 | Sutter Instrument | BF150-110-10 | 패치 클램핑 피펫 유리 |
| 전극 필러 전극 필러 MicroFil | WPI | CMF20G | 패치 전극 피펫 필러 |
| 인라인 용액 히터 | Warner Instruments (GSAdvantage) | SH-27B | 슬라이스 관류 시스템 히터 |
| 다중 마이크로 매니퓰레이터 시스템 | Sutter Intruments | MPC-200 | 패치 클램프 및 자극 전극 배치용 MP285 마이크로 매니퓰레이터 |
| P-1000 유리 마이크로피펫용 수평 피펫 풀러 | 셔터 기기 | FG-P1000 | 패치 클램프 피펫 풀러 |
| 패치 클램프 증폭기 및 소프트웨어 | HEKA | EPC-10 / Patchmaster 다음 | 모든 증폭기/소프트웨어가 될 수 있습니다 |
| 녹음 챔버 | Warner Instruments | RC26G | 녹음 중 슬라이스 "목욕" |
| 녹음 챔버 하프 | 워너 악기 | 640253 | 전기생리학 녹음 중 슬라이스 안정화 |
| 슬라이스 배양 챔버 | 맞춤형 빌드 | 슬라이스 절단 후 복구 중 슬라이스를 위한 가열되고 산소가 공급된 홀딩 챔버 | |
| 자극 격리 장치 | A.M.P.I. | 전기 생리학을 위한 | Iso-Flex |
| 주사기 60CC | Fischer Scientific (Intramalls) | 14-820-11 | 전기 생리학 관류 유체 취급 |
| 온도 컨트롤러 | Warner Instruments (GSAdvantage) | TC-324C | 슬라이스 관류 시스템 온도 컨트롤러 |
| 튜빙 1/8 OD 1/16 ID | Fischer Scientific (Intramalls) | 14-171-129 | 전기생리학 관류 유체 취급 |
| Tugsten 동심원 양극성 미세 전극 | WPI | TM33CCINS | 전기생리학 |
| Histology | |||
| 24 well Plate | Fisher Scientific (Intramalls) | 12-556006 | 조직학 슬라이스 수집 및 면역 염색 |
| Alexa Fluor 488 Streptavidin | Jackson Immuno labs | 016-540-084 | 바이오사이틴 시각화를 위한 2차 항체 |
| Corning Orbital Shaker | Sigma | CLS6780FP | Shaker 면역조직화학 교반을 위한 |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich (Intramalls) | C5042-10G | 조직학을 위한 세포 염색 |
| 일회용 마이크로톰 블레이드 | Fisher Scientific | 22-210-052 | 슬라이딩 마이크로톰 블레이드 |
| 필터-주사기 Nalgene 4mm 셀룰로오스 아세테이트 0.2um | Fisher Scientific (Intramalls) | 09-740-34A | 내부 용액으로 기록 피펫을 채우기 위한 주사기 필터 |
| Fluoromount-G 슬라이드 장착 매체 | Fisher Scientific | OB100-01 | 면역조직화학 형광 장착 매체 |
| 유리 슬라이드 염색 접시(랙 포함 | Fisher Scientific ( Intramalls) | 08-812 | Cresyl Violet staining chamber |
| Microm HM450 슬라이딩 마이크로톰 | ThermoFisher | 910020 | 조직학을 위한 동결 마이크로톰 |
| 현미경 커버 안경: 직사각형 50mm x 24mm | Fisher Scientific (Intramalls) | 12-543D | 조직화학 슬라이드 커버 유리 |
| Permount 장착 매체 | Fisher Scientific | SP15-100 | Cresyl 바이올렛 섹션 장착 미디엄 |
| Superfrost 슬라이드 | Fisher Scientific | 22-034980 | 조직학 슬라이드 |
참고문헌
- Campbell, J. P., Henson, M. M. Olivocochlear neurons in the brainstem of the mouse. Hearing Research. 35 (2-3), 271-274 (1988).
- Grothe, B., Sanes, D. H. Synaptic inhibition influences the temporal coding properties of medial superior ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
