생체 내 신경 회로 연결성 모방을 위한 체외 쐐기 슬라이스 준비

신경 회로의 활동의 관찰은 이상적으로 네이티브 감각 입력 및 피드백, 그리고 뇌 영역 사이의 그대로 연결, 생체 내에서 수행된다. 그러나 신경 회로 기능의 단일 세포 해상도를 제공하는 실험을 수행하는 것은 여전히 뇌의 기술적 과제에 의해 제한됩니다. 생체 외 세포 외 전기 생리학 또는 다광화상 방법은 그대로 신경계에서 활동을 조사하는 데 사용될 수 있지만, 다른 입력이 어떻게 통합되는지 해석하거나 하위 임계 값 시냅스 입력을 측정하는 것은 여전히 어렵습니다. 생체 내 전세포 기록은 이러한 한계를 극복하지만 쉽게 접근 할 수있는 뇌 영역에서도 수행하기가 어렵습니다. 단일 세포 분해 실험의 기술적 과제는 뇌 깊숙이 위치한 특정 뉴런 집단또는 생체 내에서 세포를 찾기 위해 유전 적 도구가 필요한 공간적으로 확산되는 집단(예: 옵트로드 레코딩과 결합된 채널로돕신의 유전적 발현) 또는 기록 사이트 라벨링 후 의학적 식별(예: 신경 전달 마커)에서 더욱 증폭됩니다. 뇌간의 복부 표면 근처에 확산되는 내측 올리고엽아(MOC) 뉴런은 위의 한계^1로인해 생체 내 실험에 액세스하기가 매우 어렵다.

뇌 슬라이스(~100-500 μm 두께)는 동일한 슬라이스^{2,3,4,5,6,7,8,9}내에 포함된 연결된 뉴런의 물리적 분리로 인해 청각 뇌간 회로를 포함한 뇌 회로를 연구하는 데 오랫동안 사용되어 왔다. 훨씬 두꺼운 슬라이스(>1mm)를 이용한 실험은 내측 우수한 올리브^10,11을포함한 우수한 올리보리 복합체(SOC)의 영역에서 양자 입력이 어떻게 통합되는지 이해하기 위해 다른 실험실에서 사용되고 있다. 이러한 슬라이스는 청각 신경(AN)의 축삭이 슬라이스 내에서 그대로 유지되고 CN에서 시냅스 신경 전달 물질 방출을 시작하기 위해 전기적으로 자극되어 소리에 반응할 것처럼 1차 청각 뉴런의 활성을 모방하도록 제조하였다. 이러한 두꺼운 조각의 한 가지 주요 단점은 패치 클램프 전기 생리적 기록 ("패치")에 대한 뉴런의 가시성입니다. 이 지역의 수많은 축축이^{12세,13세,14세,15세로}발근해지면서 전형적이고 얇은 뇌 슬라이스에서도 조직이 광학적으로 조밀해지고 모호한 뉴런을 만들기 때문에 패치가 점점 더 어려워집니다. 우리의 목표는 생체 내 레코딩의 회로 연결성과 더 밀접하게 유사한 체외 제제를 만드는 것이지만, 뇌 슬라이스에서 시각적으로 유도된 패치 클램프 전기생리학의 고처리량 및 고해상도 레코딩 능력을 가지고 있습니다.

우리의 실험실은 MOC 신경세포를 포함하여 청각 efferent 시스템의 뉴런의 생리학을 조사합니다. 이러한 콜린성 뉴런은 외부 모발 세포(OHCs)^{16,17,18,19,20의}활성을 조절함으로써 달팽이관에 대한 효과적인 피드백을 제공한다. 이전 연구는 이 변조가 달팽이관^{21,22,23, 24,25,26} 및 음향 외상으로부터 의보호^{27,28,29,30,31,32,33에서}이득 제어에 중요한 역할을 한다는^것을보여주었다. 마우스에서, MOC 뉴런은 청각 뇌간^1에서사다리꼴 본체(VNTB)의 복부 핵에 확산적으로 위치한다. 우리 그룹은 tdTomato 리포터 마우스 라인과 교차하는 ChAT-IRES-Cre 마우스 라인을 활용하여 상피 조명 아래 뇌간 슬라이스에서 MOC 뉴런을 표적으로 삼았습니다. 우리는 MOC 뉴런이 트라페조이드 체의 ipsilateral 내측 핵으로부터 발포성 억제 입력을 수신한다는 것을 보여주었습니다 (MNTB), 이는 차례로, 반대로 달팽이관 핵 (CN)^{34,35,36,37, 38에서}구형 부시 세포 (GBC)에서 축삭에 의해 흥분된다. 추가적으로, MOC 뉴런은 아마도 반대로 CN^{39,40,41에서}T-stellate 세포로부터 그들의 흥분^입력을수신합니다. 종합, 이러한 연구는 MOC 뉴런이 동일한 (contralateral) 귀에서 파생된 흥분성 및 억제 입력을 모두 수신하는 것으로 나타났습니다. 그러나, 전시냅스 뉴런, 그리고 MOC 뉴런에 수렴하는 그들의 축축은, 일반적인 관상 슬라이스 준비에서 완전히 손상될 만큼 서로 충분히 가깝지 않습니다. MOC 뉴런에 시냅스 입력의 통합이 그들의 작용 잠재적인 발사 패턴에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기 위하여, 새로 설명한 억제에 초점으로, 우리는 우리가 가능한 가장 생리적으로 현실적인 방법으로 한 귀에서 MOC 뉴런에 다양한 흡수를 자극할 수 있는 준비를 개발했습니다, 그러나 체외 뇌 슬라이스 실험의 기술적 이점.

웨지 슬라이스는 MOC 뉴런의 회로 통합을 조사하도록 설계된 수정된 두꺼운 슬라이스 제제입니다(도 1A에서스키마화). 슬라이스의 두꺼운 측면에, 웨지는 청각 신경의 절단 된 축삭을 포함 (이하 "청각 신경 뿌리"라고) 그들은 CN에서 주변과 시냅스에서 뇌간을 입력으로. 청각 신경 근은 완전히손상된 CN^{42,43,44,45, 46의}세포의 신경 전달물질 방출 및 시냅스 활성화를 연상시키는 전기적으로 자극될 수 있다. 이 자극 형식은 회로 분석에 몇 가지 이점이 있습니다. 첫째, MOC 뉴런에 대한 포심 입력을 제공하는 T-stellate 및 GBC 축축을 직접 자극하는 대신 CN에 풍부한 본질회로의 활성화를 허용하도록 AN을 자극합니다. 이러한 회로는 MOC 뉴런^{46,47,48,49,50,51을}포함하여 뇌 전체의 표적에 CN 뉴런의^출력을조절한다. 둘째, MOC 뉴런의 CN 업스트림을 통해 AN으로부터 포퍼런트 회로의 다형성 활성화를 통해 청각 자극 중에 생체 내에서와 마찬가지로 이러한 시냅스에서 보다 자연스러운 활성화 타이밍과 가소성이 발생할 수 있습니다. 셋째, 자극 패턴을 다양하게 하여 AN 활동을 모방할 수 있습니다. 마지막으로, MOC 뉴런에 대한 흥분성 및 억제 모년 투영은 쐐기 조각에 그대로 있으며, 이들의 통합은 패치 클램프 전기생리학의 정밀도로 MOC 뉴런에서 측정될 수 있다. 전체적으로, 이 활성화 계획은 일반적인 두뇌 슬라이스 준비에 비해 MOC 뉴런에 더 온전한 회로를 제공합니다. 이러한 뇌간 쐐기 슬라이스는 측면 우수한 올리브, 우수한 올리보리 핵 및 내측 우수한 올리브^{10,11,52,53,54,55,56을}포함하는 ipsilateral MNTB로부터 억제 입력을 받는 다른 청각^영역을조사하는 데 에도 사용될 수^있다. 우리의 특정 준비를 넘어, 이 슬라이스 방법은 장거리 입력의 연결을 유지하고 다양한 단세포 해상도 전기 생리학 또는 이미징 기술에 대한 뉴런의 시각화를 개선하는 이점을 가진 다른 시스템을 평가하기 위해 사용하거나 수정할 수 있습니다.

이 프로토콜은 진동 단계 또는 플랫폼을 사용하여 약 15°기울어질 수 있어야 합니다. 여기서 우리는 "스테이지"가 오목한 자기 "스테이지 베이스"에 구부러진 바닥이있는 금속 디스크인 상업적으로 사용 가능한 2 피스 자기 단계를 사용합니다. 그런 다음 스테이지를 이동하여 슬라이스 각도를 조정할 수 있습니다. 스테이지 베이스의 동심 원은 각도를 재현적으로 추정하는 데 사용됩니다. 스테이지 및 스테이지 베이스는 자력 스테이지 베이스를 회전할 수 있는 슬라이싱 챔버에 배치됩니다.

모든 실험 절차는 청각 장애 및 기타 통신 장애 동물 관리 및 사용위원회에 신경 장애 및 뇌졸중 / 국립 연구소의 국립 연구소에 의해 승인되었다.

1. 실험 적 준비

참고: 슬라이스 용액, 슬라이스 온도, 슬라이스 인큐베이션 온도 및 장치(등)를 포함한 슬라이스 제제에 대한 세부 사항은 이 실험에서 수행된 뇌간 제제에 특이적이다. 슬라이스 인큐베이션 세부 사항은 실험실 경험당 변경할 수 있습니다.

1. 패치 클램핑을 위한 내부 솔루션을 준비합니다.
   1. (mM) 76 Cs-메탄술포네이트, 56CsCl, 1 MgCl_2,1 CaCl_2,10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na₂-인포크레아틴, 5 QX-314, 및 0.01 알렉사 플루오드를 함유하는 전압 클램프 솔루션을 준비합니다. PH를 CsOH로 7.2로 조정합니다.
   2. 현재 클램프 용액(mM) 125 K-글루코네이트, 5KCl, 1 MgCl_2,0.1 CaCl_2,10 HEPES, 1 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na 2-인포크레아틴, 및 0.01 알렉사 플루어-488 하이드라를 준비한다. KOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정합니다.
2. 100mL의 뜨거운 물(끓는 근처)에 100mL의 한고4 g를 첨가하여 100mL의 100mL를 준비합니다. 가열 된 교반 접시에 놓고 온도를 유지하고 완전히 녹을 때까지 저어줍니다. 100mm 플라스틱 페트리 접시에 약 1cm 깊이를 붓고 식힙니다. 필요할 때까지 냉장 보관하십시오.
3. mM에 함유된 L 인공 뇌척수액(ACSF) 1L준비: 124 NaCl, 1.2 CaCl_2,1.3 MgSO_4,5 KCl, 26 NaHCO_3,1.25 KH₂PO_4,및 10 덱스트로스. 카보겐(5% CO 2/95%_O2)을10분 이상 거품한 다음, 필요한 경우 최종 pH를 7.4로 조정합니다. 실험 전반에 걸쳐 카보겐을 지속적으로 버블링하여 용액의 산소화와 pH를 유지합니다.
4. ACSF에 1mM 키누레닉 산을 추가하여 200mL 슬라이싱 용액을 준비하십시오. 키누레닉 산이 용해될 때까지 10분 동안 초음파 처리 수조에서 용액을 초음파 처리합니다. 지속적으로 카르보겐으로 거품을 내고 얼음 위에 놓습니다.
   주의: 키누레닉 산을 취급할 때 적절한 개인 보호 장비를 사용하십시오.
5. 제조업체의 지시에 따라 진동에 적절한 블레이드를 장착합니다. 얼음으로 둘러싸고 진동을 자르는 챔버를 식힙니다.

2. 자극을위한 손상되지 않은 청각 신경 루트로 뇌 제거

참고: 이러한 실험을 위한 마우스는 tdTomato 리포터 마우스(Ai14)를 가진 C57BL/6J 배경에서 ChAT-IRES-Cre 형질전환 마우스를 교차시킴으로써 얻어졌다. 히스토로지와 전기생리학에 사용되는 마우스는 마우스에서 P12 의 주위에 청력 개시 (P14-P23) 이었습니다. 사다리꼴 본체(VNTB)의 복부 핵에서 tdTomato을 발현하는 뉴런은 이전에 이 마우스^{라인(57)에서}MOC 뉴런으로 특징지어졌다.

1. 안락사 (예를 들어, CO₂ 질식) 승인 된 기관 절차를 사용하여 동물을 참수.
2. 면도날을 사용하여 두개골 의 중간선에서 코에서 목 뒤쪽으로 피부를 자른다. 두개골을 노출하기 위해 피부를 다시 껍질을 벗깁니다.
3. 작은 가위를 사용하여 두개골의 기지 (척수 근처의 caudal end)에서 시작하여 코를 향해 계속 하는 중간선을 통해 두개골에 절개를합니다.
4. 람다 봉합사에서, 양쪽의 귀를 향해, 중간라인에서 두개골에 상처를. 두개골을 벗겨 뇌를 노출시합니다.
5. 로스트랄 끝에서 시작하여 작은 실험실 주걱이나 무딘 집게로 두개골에서 뇌를 부드럽게 들어 올립니다. 시신경을 자르고 뇌표면을 노출하여 뇌를 뒤로 부드럽게 작동시합니다.
6. 뇌간의 복부 표면 근처의 미세 한 집게로 꼬집어 삼차 신경을 잘라.
   참고 : 현관 신경이 바로 이 아래에 놓여 있고 최종 자극을 위해 그대로 유지되어야하므로주의 깊게하십시오.
7. 차가운 슬라이스 용액으로 채워진 유리 페트리 접시에 준비하십시오. 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 카보겐으로 부드럽게 거품을 냅니다.
8. 뇌간 에 가까운 얼굴 신경을 손질하고 현관 신경을 노출.
9. 미세 한 집게를 사용 하 여, 현관 신경 가능한 한 두개골을 종료 하 고 그것을 절단 하는 신경을 꼬집어 foramina에 팁을 밀어, 뇌간에 부착 된 신경 루트를 떠나. 다른 쪽에서 이것을 반복합니다.
10. 두 신경 뿌리가 모두 무료되면 사다리꼴 몸 근처의 뇌줄기의 복부 표면에서 수막과 혈관을 제거하십시오.
11. 가능한 경우 나머지 척수를 보존하기 위해 주의하는 나머지 두개골 신경과 결합 조직을 꼬집어 두개골에서 뇌를 완전히 풀어 보십시오.

3. 무대에서 뇌를 차단하고 장착 (자기 디스크)

1. 광학 치아의 수준에서 뇌를 차단하여 무대에 고정하는 뇌의 표면을 준비합니다.
   1. 복부 표면위로, 뇌가 다음 단계에서 기울지 않도록 부드럽게 척수를 고정하는 무딘 도구를 사용하여 뇌를 안정시다.
   2. 광학 치아의 수준에서, 접시의 바닥에 뇌를 삽입하여 뇌를 차단하기위한 평면을 만들기 위해 열린 집게를 사용합니다. 팁이 뇌 의 등쪽 표면을 광학 치아즘으로 종료하도록 수직에서 약 20 ° 각도로 집게를 삽입합니다.
   3. 면도날을 사용하여 집게를 따라 자른다.
2. 무대 의 표면에 뇌를 접착제.
   1. 뇌를 지원하기 위해 4 %의 천의 작은 블록 (~1cm^3)을준비합니다.
   2. 무대에 접착제의 작은 방울을 놓고 뇌와 한천 블록을 모두 접착 할 수 있도록 사각형으로 확산.
   3. 집게를 사용하여 조심스럽게 뇌를 들어 올리고 종이 타월 가장자리를 사용하여 여분의 액체를 부드럽게 두드려. 차단된 표면을 접착제에 놓고, 복부 표면은 슬라이스 하는 동안 블레이드쪽으로 있을 것입니다.
   4. 슬라이스 하는 동안 그것을 지원 하 고 적절 한 두뇌 위치(즉, 각도)를 보장하기 위해 뇌의 등대 표면에 대해 천막 블록을 부드럽게 밀어 넣습니다.

4. 쐐기 조각을 만들기 위해 뇌를 슬라이스

참고: 두꺼운 측면에 달팽이신경 뿌리가 있는 진동체와 내측 올리고성 폴리보코클레아(MOC) 뉴런과 사다리꼴 본체(MNTB)의 내측 핵을 얇은 면에 사용하여 뇌 슬라이스를 준비한다.

1. 연결된 뇌가 있는 마그네틱 디스크를 무대 베이스에 놓고 블레이드를 향하도록 뇌의 복부 표면을 사용하여 슬라이스 챔버에 놓습니다.
2. 얼음 차가운 슬라이스 용액으로 챔버를 채우고 카보겐으로 거품을 낸다.
3. 블레이드를 용액으로 낮추고 슬라이스를 관심 영역으로 잘라 내어 슬라이스가 대칭인지 확인합니다. 슬라이스가 비대칭으로 나타나면 스테이지를 약간 기울여 대칭을 얻습니다.
   참고: 0.05-0.10mm/s 사이의 블레이드 속도는 건강한 슬라이스를 절단하는 데 효과적이었으며 동물의 나이와 뇌 부위에 따라 달라질 수 있습니다.
4. 슬라이스가 대칭이되면 스테이지 ~15°(스테이지 베이스의 약 3개의 동심링에 해당)를 한쪽으로 이동합니다.
   참고: 슬라이스에 보존하려는 청각 신경 뿌리에서 스테이지를 멀리 이동합니다.
5. 청각 신경 뿌리가 한쪽면에 표면에 가까워질 때까지 조심스럽게 슬라이스를 계속하고, 얼굴 신경은 다른 쪽의 표면에서 볼 수 있습니다.
6. 스테이지를 원래 위치로 15°로 다시 이동합니다.
7. 블레이드를 조직에서 멀리 이동하고 스테이지 베이스를 90° 회전하여 얇은 면의 측면 가장자리가 블레이드를 향합니다. 블레이드를 수백 미크론으로 낮추고 천천히 블레이드를 조직의 가장자리에 가깝게 가져옵니다. 블레이드가 측면 가장자리에 닿을 때까지 반복합니다. 슬라이스의 얇은 가장자리의 원하는 두께로 블레이드를 낮추고, 여기에 추가 200 미크론.
   참고: 결과 슬라이스는 패치 클램핑이 일어나는 측면에 있는 사다리꼴 본체(VNTB)의 복부 핵 수준에서 이상적으로 ~300mm 두께입니다.
8. 블레이드를 조직에서 다시 멀리 이동하 고 다시 단계 베이스를 회전 하 고 복부 표면이 그것을 직면 하는 있도록.
9. 웨지 슬라이스의 장죽 표면을 지정하는 컷을 만듭니다. 슬라이스를 인터페이스 용지(1cm^2)로옮기는 소달 표면을 아래로 옮느라 옮김합니다. 회복을 위해 배양실 또는 기타 적합한 인큐베이션 장치로 슬라이스를 이동합니다(35°C에서 30분).
   참고: 얼굴 신경은 장밋빛 표면의 슬라이스의 두 반구에서 볼 수 있어야 합니다(그림 1B참조).

5. 전기 생리학 설정 및 기록

1. 웨지 슬라이스를 레코딩 챔버에 놓고 하프 또는 안정화 시스템으로 슬라이스를 고정합니다. 카보겐으로 거품을 낸 따뜻한 (35°C) ACSF로 7-10 mL/min의 속도로 조직을 지속적으로 퍼퓨즈한다.
2. 패치 클램프 레코딩을 위한 561nm 방출 필터를 사용하여 VNTB에 유전자 표지된 MOC 뉴런을 식별합니다. 잠재적으로 패치 가능한 셀이 없는 경우 슬라이스를 뒤집습니다.
3. DIC 광학을 사용하여, 슬라이스의 두꺼운 측면에 청각 신경 뿌리에 초점을 맞추고 양극성 텅스텐 자극 전극을 청각 신경 뿌리로 이동하고 부드럽게 조직의 표면에 이동미세 조작기를 사용합니다.
   참고 : 흡입 전극은 다른 실험실에서 청각 신경 자극 실험에 사용되었습니다. 테타 유리 전극, 또는 광학 자극 방법은 다른 특정 제제에 적용 가능한 경우 사용될 수있다.
4. 시야를 VNTB로 다시 이동하여 패치 클램프 전기생리학을 대상으로 하는 MOC 뉴런을 선택합니다.
5. 제안된 실험에 적합한 내부 솔루션으로 레코딩 파이펫을 채웁니다.
6. 전체 셀 구성에서 MOC 뉴런에서 패치 및 기록. 필요한 경우 멤브레인 정전 용량 및 계열 저항을 보상합니다.
7. 청각 신경 근의 전기 자극 진폭을 조정하여 MOC 뉴런에서 일관된 포스트냅틱 이벤트를 얻습니다.
   참고: 자극 전극을 이동해야 할 수도 있습니다.
8. 적절한 자극 프로토콜을 실행하여 MOC(전압 클램프) 또는 동작 잠재적 패턴(현재 클램프)에서 호출된 시냅스 전류를 관찰합니다.
   참고: 웨지 슬라이스 제제는 느슨한 패치 기록, 약리학, 광유전학, 칼슘 이미징, 신경 전달 물질 미수 등과 같은 일반적인 패치 클램프 도구와 함께 사용할 수 있습니다.

6. 뇌간 핵의 조직학적 확인

참고 : 이것은 고정 된 재단면 쐐기 슬라이스에 크레실 바이올렛 염색으로 수행됩니다. 이 방법은 슬라이스에 포함 되는 핵의 시각화를 허용 합니다.

1. 쐐기 슬라이스를 준비 한 후 하룻밤 고정 (PBS에서 4 % PFA)에 슬라이스를 잠급니다. PBS에서 10분 동안 슬라이스 3x를 헹구고(셰이커의 실온)를 한 다음, PBS에서 하룻밤 사이에 30% 자당에 넣고 저온 보호합니다.
2. 동결 마이크로토메(40-70mm)의 슬라이스를 다시 섹션화하고 PBS의 24웰 플레이트에서 직렬 섹션을 수집합니다.
3. 젤라틴 코팅 슬라이드에 섹션을 마운트하고 완전히 건조하자. 슬라이드 캐리지에 슬라이드를 배치합니다.
4. 크레실 바이올렛 솔루션 준비
   1. 500 mL dH₂O에 5 g 크레실 바이올렛 아세테이트를 혼합하여 1 % 크레실 바이올렛 아세테이트를 준비하십시오.
   2. 먼저 90mL 용액 A(540mL 빙하 아세스틱산 + 89.46 mL dH_2O)및 10mL 용액 B(10mL dH_2O)를준비하여 아세테이트 버퍼를 준비한다. 아세테이트 버퍼를 산출하는 솔루션 A와 솔루션 B를 결합합니다.
   3. 아세테이트 버퍼1:1과 1% 크레실 바이올렛을 아세테이트 버퍼에 결합합니다. 사용하기 전에 필터링합니다.
   4. dH₂O의 적절한 볼륨으로 100 % 에탄올을 희석하여 95 % 및 70 % 에탄올을 준비합니다.
5. 크레실 바이올렛 염색 프로토콜을 수행합니다. 솔루션 트레이를 통해 슬라이드 캐리지를 이동하여 트레이 사이의 종이 타월에 과도한 용액을 블롯합니다: 자일렌 – 5분; 95% 에탄올 – 3 분; 70% 에탄올 – 3분; dH₂O – 3 분; 0.5% 크레실 바이올렛 용액 – 핵 염색이 짙은 보라색이 될 때까지 자주 모니터링하는 8-14분; dH₂O – 3 분; 70% 에탄올 – 3분; 95% 에탄올 – 1-2 분; 100% 에탄올 – 딥 슬라이드두 번; 자일렌 – 5 분; 자일렌: 장착이 수행될 때까지 25분.
   주의: 연기 후드 아래에서만 자일렌을 사용하십시오.
6. 자일렌에서 슬라이드를 한 번에 하나씩 제거하고 장착 매체를 사용하여 슬라이드에 덮개 슬립을 즉시 놓습니다. 장착 매체를 건조(하룻밤)합니다.
7. 이미지 섹션입니다.

7. 생체 시 틴 라벨 라이브에서 축 축 의 영양 추적에 대 한 라벨, 고정 되지 않은 조직

1. 위와 같이 쐐기 조각을 준비합니다(2-4단계).
2. 슬라이스를 인터페이스 용지(~1cm^2)로옮기습니다. 해부 현미경에서, 슬라이스의 두꺼운 측면에 CN을 찾습니다.
3. 조직에서 ACSF를 멀리 그리는 티슈 페이퍼의 모서리를 비틀어 슬라이스를 둘러싼 영역에서 과도한 ACSF를 조심스럽게 제거합니다. 이것은 CN 외부 세포로 uptake로 이끌어 낼 수 있던 슬라이스의 주변 지역으로 퍼지는 에서 biocytin를 방지합니다.
4. 미세 한 집게로, 생생물의 작은 결정을 선택하고 CN의 표면에 배치. 부드럽게 신경세포와의 접촉과 소마타로의 후속 섭취를 촉진하기 위해 조직으로 결정을 누릅니다. 이 경우 T-stellate 및 GBC 뉴런을 포함하는 CN 영역이 있는 원하는 관심 영역을 커버하기 위해 이 단계를 반복합니다.
5. 슬라이스를 인큐베이션 챔버에 놓습니다. 슬라이스가 35°C에서 2-4h의 배양하여 생생물의 섭취 및 수송을 허용하도록 허용한다. 인큐베이션 후 ACSF에서 슬라이스를 헹구어 생생물 입자를 제거합니다.
6. 하룻밤 동안 고정 (PBS에서 4 % PFA)에 슬라이스를 배치합니다. PBS에서 10분 동안 3배 헹구고 있습니다.
7. Cryoprotect 는 PBS에서 하룻밤 사이에 4 °C또는 슬라이스가 가라 앉을 때까지 30 % 자당으로 슬라이스합니다.
8. 70-100mm에서 동결 마이크로토메에 횡횡단 섹션을 생성하기 위해 조직을 제부.
9. 형광으로 결합 된 연쇄상 구균을 가진 표준 면역 조직 화학 적 방법을 사용하여 조직을 공정합니다.
   참고: 회로 시각화에 중요한 전시냅스 세포 체, 축축함, 수용체 또는 기타 시냅스 분자를 표시하는 데 도움이 되는 경우 추가 면역 집중화학은 단면도에서 수행될 수 있다(즉, 1차 항체 단계는 생체시틴 이차 시각화에 부정적인 영향을 미치지 않아야 함).
10. 조직을 이미지화합니다.

웨지 슬라이스의 조직학적 검사
청각 뇌간 뉴런 기능에 대한 당사의 조사를 위해, 웨지 슬라이스 제제는 기록(도 1B에도시된 예시 슬라이스)을 표적으로 한 MOC 뉴런에 청각 신경 근과 CN 모순을 포함하도록 설계되었다. 초기 조직학적 검사는 슬라이스가 회로 활성화에 필요한 핵을 포함하고 축축투영이 손상되지 않음을 확인하는 것이 중요하다. CN 내의 두 세포 유형은 MOC 뉴런에 사운드 정보를 제공합니다. T-stellate 세포는 MOC 뉴런39,40,41,58에흥분 입력을 제공하기 위해 가설된다. 구형 부시 세포(GBC)는 금단반구에서 MNTB 뉴런을 자극한다(개최 시냅스의 전문 칼립스를 통해)34,36,37,38,59,60, 차례로, MOC 뉴런에 억제 입력을 제공합니다57 (회로도 1A). T-stellate 세포와 GBC의 존재를 확인하기 위해, 우리는 4 % PFA에 침수에 의해 고정 된 쐐기 슬라이스 (50 μm)를 다시 단면하고 소마타라벨크레실 바이올렛 염색을 수행했습니다. 쐐기 슬라이스의 두꺼운 측면(그림 2,왼쪽 반구) CN은 거의 전체 로스트로 - caudal 범위에서 존재했다. 또한, CN의 등쪽 및 복부 세분화는 손상되지않았다(도 2;화살표 및 S19의 화살촉). 청각 신경(도2;S17의 화살표)이 CN61,62,63,64,65로진입하는 곳 근처의 복부 인공와우 핵에 T-stellate 뉴런 및 GBCs 클러스터가 들어있다. 웨지 슬라이스는 또한 MNTB ipsilateral의 뉴런을 포함하며, 이 중 MOC 뉴런은 녹음이 수행됩니다(원래 쐐기 슬라이스의 얇은 반구, 그림 2의오른쪽). 이것은 MOC 뉴런에 대한 억제 입력의 적어도 일부가 손상되지 않은 것을 확인(도 2,슬라이스 1-15, S11에서 대시 타원형에 의해 강조).

별도의 실험에서, 우리는 CN 뉴런의 축축및 사전 시냅스 말기가 바이오시틴으로 영양 라벨링을 사용하여 웨지 슬라이스에 그대로 있음을 확인했습니다. 첫째, 라이브 웨지 슬라이스를 준비하고 인터페이스 용지에 배치하였다. 웨지 슬라이스를 준비한 직후, 생체 시틴 결정은 인큐베이션 기간 동안 축축을 따라 섭취 및 전방 수송을 허용하는 CN에 배치되었다. 그런 다음 조직(70mm 단면)의 고정 및 재단면이 수행되었다. 형광으로 표기 된 streptavidin을 가진 단면도의 염색은 biocytin로 표지된 축소를 시각화하기 위하여 수행되었습니다. 이 섹션의 공초점 이미지는 결정이 배치되고 세포 체로 채택된 CN에서 밝은 라벨을 보여줍니다(그림 3A,왼쪽 반구, 점선 영역). 복부 음향 스트리아(그림3A,흰색 화살촉)를 따라 CN을 빠져나가는 축축산은 명확하게 표지되어 종료 지점을 따를 수 있었다. 금탈 MOC 뉴런을 둘러싼 바이오시틴 양성 말장난은 우리의 준비가 CN(도 3B)에서유래시 냅 틱 접촉을 보존 제안. 마찬가지로, 금단의 MNTB에서 개최된 칼리세스는 GBC에서 MNTB 뉴런으로 투사되는 축삭이 쐐기슬라이스(도 3C)에보존되어 있음을 나타낸다. 이러한 조직학적 검사는 쐐기 슬라이스가 MOC 뉴런에 대한 포퍼런트 입력 회로의 세포 몸과 축삭 투영을 모두 포함하고 있으며, 따라서 청각 신경의 자극과 상승 회로를 통한 활동의 후속 전파에 의해 유발된 포스트냅틱 반응을 측정할 수 있습니다.

쐐기 슬라이스의 시냅스 생리학
흥분성 및 억제 시냅스 입력의 통합은 비판적으로 신경 활동을 형성한다. 우리는 최근에 MNTB57의뉴런에서 MOC 뉴런에 억제 입력을 설명했습니다, 그러나 MOC 신경 활동에 흥분 입력과 이 입력의 통합의 효력은 알려지지 않았습니다. ChAT-IRES-Cre x tdTomato 마우스의 웨지 슬라이스에서 MOC 뉴런에서 전압 클램프 레코딩이 수행되었습니다. 전류는 자극 성 텅스텐 자극 전극을 통해 적용되어 자극 격리 장치에 의해 구동되어 사전 시냅스 축소에서 신경 전달 물질 방출을 연상시킵니다. 먼저 미드라인의 복부 음향 슬라리아(VAS)는 GBC 축축자극(도 4A)을통해 T-stellate 축축및 MNTB 뉴런을 직접 활성화하도록 전기적으로 자극하여 일반적인 박슬라이스 실험(그림4B),예추적, 그레이 60)을 모방한 기록 구성에서 시냅스 후 반응에 대한 대기 시간을 측정하였다. 별도의 실험에서, 청각 신경 뿌리는 위에서 설명한 바와 같이 MOC 뉴런에서 측정된 모C 오름차순 회로 및 시냅스 후 반응을 활성화하도록 자극되었다. 어느 위치에서의 전기 자극은 빠른 전기 아티팩트를 불러 일으켰고 다중 피크 전류 응답(그림 4C의자극, 검은 색 추적, 잠재적인 -60 mV 보유)의 반응입니다. 우리는 청각 신경 자극으로 불러 와 청각 신경 자극으로 불러 와 그 와 VAS의 직접적인 자극으로 불러 일으킨 첫 번째 포스트 냅틱 전류 (PSC)의 개시 대기 시간 측정을 비교하고 자극 이벤트에 상당히 더 긴 대기 시간을 발견했습니다. 이는 AN/CN 시냅스(AN 자극: 5.27 ± 0.43 ms, 중앙값 ± 중앙분리대 절대편차(MAD), 범위 4.26-5.93 ms, n=8; VAS 자극: 1.98 ± 0.28 ms, 중간 ± MAD, 범위 0.75-3.46 ms, n = 17; 윌콕슨 서명 순위 테스트, p = 0.014, 그림 4D). 이러한 결과는 청각 신경 루트의 자극이 CN 뉴런과 후속 회로 활동의 시냅스 활성화를 초래한다는 것을 확인하며, T-stellate 또는 GBC/MNTB 축삭의 직접적인 자극보다 타이밍과 같이 생체 내에서 더 밀접하게 표현됩니다.

우리의 세슘 기반, 높은 [Cl-]전압 클램프에 사용되는 내부 용액, 흥분성 (글루타마테르기크) 및 억제제 (GABA 및 글리시너기닉) PSC는 모두 휴식 막 전위 (-60 mV)에서 안쪽에 있으므로 구별 할 수 없습니다. AN-자극 구성에서 회로 활성을 연상시키는 동안, 우리는 AMPA 중재 글루타미터제전류에 대한 대략적인 반전 잠재력인 0 mV로 유지 전위전을 이동하여 추정된 억제 입력을 전기적으로 격리시켰습니다. 우리의 예뉴런에서, 외후 전류 반응은 염화물 전도도를 나타내는 0 mV(도4Ci,적색 흔적)에서 관찰되었다. 이들은 GABA- 또는 글리시너지시냅틱 반응일 가능성이 높습니다. 이러한 데이터는 후속 포구성 회로의 활성화와 함께 청각 신경 뿌리를 자극하여 MOC 뉴런에 대한 흥분 성 및 억제 입력을 모두 활성화하는 쐐기 슬라이스의 유용성을 보여줍니다. 또한, 시냅스 후 반응의 다양한 패턴은 AN 자극에 의해 연상되었으며, 이는 AN 축축의 동일한 자극 조건에서도 전체 회로의 활동이 역동적이고 복잡하다는 것을 시사한다. 이 실험 패러다임은 복잡한 청각 자극이 뇌간을 통해 전파되고 MOC 뉴런에 통합되는 방법의 상세한 분석을 허용하고 MOC efferent 시스템의 출력과 달팽이관에 대한 최종 영향을 결정합니다.

그림 1: 쐐기 슬라이스 회로도 및 예제 이미지입니다. (A)내측 올리고성 골수 자극피드백 회로의 회로. 파란색 화살표는 MOC 뉴런과 검은 화살표에 발포성 상승 경로를 나타냅니다 외부 헤어 세포의 기지에 MOC 뉴런에서 내림차순 피드백 경로를 나타냅니다 (OHC). (B)고변 신경 근(ANR)과 달팽이관 핵(dashed 윤곽)의 라벨이 있는 쐐기 슬라이스의 브라이트필드 이미지. 별표는 MOC 뉴런이 쐐기 슬라이스의 얇은 면에 패치 클램핑을 목표로 하는 사다리꼴 본체의 복부 핵의 대략적인 위치를 나타낸다. 대시 된 검은 선은 장활 표면에 슬라이스의 두 반구에서 볼 수있는 얼굴 신경을 나타냅니다. IHC - 내부 모발 세포, GBC - 구형 부시 세포, SPN - 우수한 파라올리바리 핵, MNTB - 사다리꼴 본체의 내측 핵, VNTB - 사다리꼴 본체, LSO - 측면 우수한 올리브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 50 μm에서 다시 단면된 쐐기 슬라이스에서 크레실 바이올렛 얼룩섹션. 다른 모든 섹션이 이미지화되었습니다. 섹션은 번호가 매겨진 장밋랄 --> 코달입니다. 웨지 슬라이스는 등쪽 CN(S19의 화살표) 및 복부 CN(S19의 화살표촉), 청각 신경 근(S17의 열린 화살촉) 및 MNTB(S3-S15의 복부 표면 근처의 어두운 영역)를 모두 포함하는 달팽이핵(CN)의 전체를 포함하는 경향이 있었다. D 및 V 온 스케일 막대는 슬라이스 방향으로 등및 복부를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3: 반대로 달팽이관 핵으로부터 MOC 뉴런에 오름차순 입력의 축삭은 쐐기 슬라이스에 그대로 남아 있다. (A)P23 ChAT-IRES-Cre x tdTomato(적색 형광) 마우스로부터 가져온 쐐기 슬라이스로부터 의 장중 가장 많은 섹션이 재단면(70 μm)으로 재단면되고 바이오시틴 시각화를 위해 처리하였다. 공초점 이미지는 타일, 최대 강도 프로젝션 z 스택입니다. 복부 음향 스트리아의 축축은 흰색 화살촉으로 강조 표시됩니다. 대시 된 윤곽은 이 장밋빛 가장 슬라이스에 남아있는 달팽이관 핵의 작은 부분을 나타냅니다. 스케일 바 500 μm.(B)주변 신경필에서 바이오시틴 양성 말장난을 가진 VNTB의 ChAT-IRES-Cre x tdTomato 양성 뉴런의 공초점 이미지. 스케일 바 50 μm.(C)바이오시틴은 중간선을 넘어 금방 MNTB에서 단종되는 축삭을 헬드의 칼리스로 표시하였다. 세로 파선선은 슬라이스의 중간선을 나타냅니다. 배율 막대 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 전압 클램프에서 포퍼런트 입력의 전기 자극은 MOC 뉴런에서 다중 피크 포스트냅틱 전류를 산출합니다. (A)MOC에 대한 발포성 입력의 복부 음향 부트리아(VAS) 자극(회색 자극 전극) 및 청각 신경(AN) 자극(BLACK 자극 전극)에 대한 기록 설정이 있는 웨지 슬라이스의 회로도. (B)-60 mV에서 중간선 근처의 단일 전기 자극으로 발생되는 개별 P17 뉴런으로부터의 포스트냅틱 전류(PsC)의 예. (C)P15 뉴런에서 -60 mV에서 자극 중에 PSC가 발생하였다. (Ci)0 mV 보유 잠재력(당사의 녹음 설정에서 AMPA 중재 전류에 대한 대략적인 반전 잠재력, 빨간색)에서 C가 불러일으킨 것과 동일한 셀의 예 PSC. (D)VAS 및 자극에 대한 첫 번째 PSC에 대한 대기 시간의 정량화를 위한 인구 데이터. 상자 : 사분위수, 라인 인셋 : 중앙값, 사각형 인셋 : 평균, 수염 : 중앙 절대 편차. * p & 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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