스플릿 루시퍼라아제 보체 분석을 사용하여 골지-레지던트 타입 III 막 단백질에 의해 형성된 이종 복합체의 시연

요약

여기에 제시된 프로토콜은 분할 루시퍼라제 보체 분석의 가장 최근의 변이체를 사용하여 살아있는 포유동물 세포에서 세포질적으로 노출된 N- 및/또는 C-테르미니와 골지-상주 III형 막 단백질 사이의 이종 상호작용의 발생을 입증하기 위한 것이다.

초록

이 프로토콜의 목표는 뉴클레오티드 당 수송체 (NSTs)에 의해 형성된 이종 복합체를 입증하기 위한 분할 루시퍼라제 상보의 가장 최근의 변이체의 적용 가능성을 탐구하는 것이다. 이러한 ER- 및 골지-상주 다막횡단 단백질은 세포질적으로 합성된 뉴클레오티드 당을 소기관막을 가로질러 운반하여 그들의 기질과 함께 글리코실화를 매개하는 효소를 공급한다. NST는 이량체 및/또는 그 이상의 올리고머로서 존재한다. 서로 다른 NST 간의 이종 상호 작용도보고되었습니다. 이 기술이 NST 이량체화 현상을 연구하는 데 적합한지 여부를 확인하기 위해, 우리는 이전에 여러 가지 다른 방법으로 연관되는 것으로 밝혀진 두 골지 거주 NST의 조합에 대해 테스트했습니다. 루시퍼라아제 보체 분석은 높은 발현 수준을 요구하지 않기 때문에 골지-상주막 단백질 간의 상호작용을 연구하는 데 특히 적합한 것으로 보이며, 이는 종종 단백질 오국소화를 유발하고 위양성의 위험을 증가시킨다.

서론

이 원고는 분할 루시퍼라제 보체 분석의 가장 최근의 변이체를 사용하여 일시적으로 형질감염된 인간 세포에서 골지-레지던트 타입 III 막 단백질 사이의 이종 상호작용의 존재를 확인하기 위한 단계별 프로토콜을 기술한다. 이 절차는 뉴클레오티드 당 수송체 (NSTs)에 대해 가장 광범위하게 테스트되었지만 N- 및 / 또는 C- 테르미니가 세포질에 직면하고있는 다른 골지 상주 유형 III 막 단백질에 대해서도 긍정적 인 결과를 얻을 수있었습니다.

우리의 연구 그룹은 거대 분자의 글리코실화에서 NST의 역할을 탐구합니다. NSTs는 골지- 및/또는 ER-상주형 III 막 단백질이며, N- 및 C-테르미니는 오르가넬라 막의 세포질 측에 직면한다¹. NST는 뉴클레오티드 활성화 당을 소기관막을 가로질러 운반하여 글리코실트랜스퍼라제를 기질과 함께 공급하는 것으로 생각된다. NST는 이량체 및/또는 그 이상의 올리고머2,3,4,5,6,7,8,9,10^을 형성한다.

프로토콜

1. 발현 플라스미드의 생성

1. 토폴로지 예측 도구를 사용하여 관심 있는 단백질의 막 토폴로지를 검사합니다.
2. 융합 단백질이 골지 막에 삽입되면 더 크고 작은 단편이 세포질에 직면하도록 복제 전략을 설계하십시오. 여기에 제시된 경우와 같이, 관심있는 단백질의 N- 및 C-테르미니가 모두 세포질 지향적이라면, 여덟 가지 가능한 방법으로 단백질을 태그한다( 도 1B 참조). 관심있는 하나 또는 두 단백질 모두의 N- 또는 C 말단이 발광 지향적 인 경우, 태깅에서 제외하십시오.
3. 관심있는 유전자를 표준 클로닝 프로토콜에 따라 적절한 발현 벡터 내로 서브클로닝한다 ( 물질의 표 참조).
   참고: 일부 태그 지정 옵션은 불충분한 근접성, 차선의 방향 또는 공간 제약으로 인해 작동하지 않을 수 있으므로 가능한 모든 방향을 테스트하는 것이 좋습니다.

2. 발현 플라스미드를 세포내로의 일시적 형질감염

1. 트립신화에 의해 부착성 HEK293T 세포 배양물을 수확하고, 세포를 전용 완전 성장 배지에 재현탁시킨다. 세포(2 x ¹⁰⁴/100 μL/웰)를 투명한 바닥, 흰색 측면 96웰....

결과

이 방법에서 가장 신뢰할 수 있는 데이터를 얻으려면 가능한 모든 조합을 테스트해야 합니다( 그림 1 참조). 동시에 양성 및 음성 대조군이 포함되어야합니다. 양성 대조군은 상호 작용하는 것으로 알려진 두 개의 단백질로 구성되어야하며, 그 중 하나는 더 큰 단편과 융합되고 다른 하나는 더 작은 단편과 융합됩니다. 이상적으로 음성 대조군은 유사하게 태그된 두 개의 상호작용하지 않는 유형 III 막 단백질로 구성되어야 한다. 그러나, 이러한 조절을 확립하는 것은 어려울 수 있는데, 이는 두 대조군 단백질의 상호작용의 결여가 몇 가지 대안적인 접근법을 사용하여 철저하게 확인되어야 하기 때문이다. 따라서, 임의의 인간 단백질(예를 들어, HaloTag)과 상호작용할 것으로 예상되지 않는 비인간 기원의 세포질 단백질을 음성 대조군으로 사용할 수 있는데, 만약 상호작용이 결정될 단백질의 N- 및/또는 C-테르미니가 여기에 제시된 경우와 같이 세포질적으로 노출된다면. 우리는 상응하는 플라스.......

토론

여기서 우리는 분할 루시퍼라제 보체 검정을 사용하여 NSTs와 같은 골지-상주 유형 III 막 단백질 사이에 형성된 이종 복합체의 시연을 가능하게 하는 상세한 프로토콜을 제공한다. 데이터 분석 및 해석에 대한 제안된 접근법은 관심있는 단백질 조합에 대해 수득된 발광을 상응하는 대조 조합에 대해 수득된 발광과 관련시키는 것을 포함하며, 이는 더 작은 단편과 융합된 박테리아 기원의 더 큰 단편 및 대조 단백질과 융합된 관심있는 단백질 중 하나로 구성된다. 후자는 포유동물 세포의 세포질에서 발현되고; 따라서, 이를 참고문헌으로 사용하려면 상호작용을 분석해야 하는 단백질의 N- 및/또는 C-테르미니가 골지막의 세포질 측면에 있어야 한다.

프로토콜의 중요한 단계는 플라스미드 설계, 형질감염 될 세포 도금, 자체 형질감염, 배지 교환, furimazine 작업 용액의 준비 및 세포에 첨가하는 것입니다. 플라스미드 설계는 루시퍼라제 단편이 모두 세포질에 직면하는 방식으로 이루어져야하며, 그렇.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.25% 트립신-EDTA 용액
부착 포유류 세포주
BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC 처리 마이크로플레이트, 뚜껑	포함 Corning	356651
세포 배양 원심분리기
세포 배양 보조제(열 비활성화 소 태아 혈청, L-글루타민, 페니실린, streptamycin)
CO2 incubator
NanoBiT 단편
FuGENE HD Transfection 시약	Promega	E2311
GloMax Discover Microplate Reader(또는 다른 발광 마이크로플레이트 리더)	Promega	GM3000
표준 분자 복제를 위한 재료 및 시약(박테리아, 내열성 중합효소, 제한 효소, DNA 리가제, 핵산 정제를 위한 재료 및 시약)
사용하는
NanoBiT MCS 스타터 시스템	Promega	N2014	이 키트에는 SmBiT 및 양성 대조군 플라스미드 쌍과 융합된 HaloTag 단백질을 인코딩하는 대조 플라스미드뿐만 아니라 다양한 방향에서 NanoBiT 단편으로 관심 단백질을 태깅할 수 있는 벡터가 포함되어 있습니다.
Nano-Glo Live Cell Assay System	Promega	N2011	이 키트에는 살아있는 세포에서 NanoLuc 활성을 검출할 수 있는 기질인 furimazine과 전용 희석 버퍼가 포함되어 있습니다.
Opti-MEM I 저감 혈청 매체, 페놀 레드	없음 Gibco	11058021
Oribital shaker
데이터 분석용 소프트웨어(예: GraphPad Prism)
Thermocycler

으로 태그가 지정되지 않은 관심 단백질을 인코딩하는 발현 플라스미드을 세포주 전용 성장 배지