방법 논문

LQ α 및 β 매개 변수, 방사선 투하 스키마 및 생체 내 용량 증착평가를 위한 조사기 및 시메트리

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DOI:

10.3791/61692

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2021년 3월 11일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, West Virginia University, 2Radiation Oncology, West Virginia University, 3School of Medicine, West Virginia University, 4Department of Neuroscience, West Virginia University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

방사선 dosimetry는 전임상 실험의 정확도를 향상시키고 전달된 방사선 량이 임상 파라미터와 밀접하게 관련되도록 하는 기술을 제공합니다. 이 프로토콜은 적절한 실험 설계를 보장하기 위해 전임상 방사선 실험 중 각 단계에서 취해야 할 조치를 설명합니다.

초록

방사선 도시성은 높은 번역 관련성을 위해 전임상 모델에서 방사선 계획의 정확한 전달 및 재현성에 중요합니다. 시험관 내 또는 생체 내 실험을 수행하기 전에, 조사기 및 개별 실험 설계에 대한 특정 용량 출력을 평가해야합니다. 이온화 챔버, 전기계 및 고체 물 설정을 사용하여 동경지의 넓은 필드의 용량 출력을 결정할 수 있습니다. 이온화 챔버 대신 방사성 크로믹 필름과 유사한 설정을 사용하여, 다른 깊이에서 작은 필드에 대한 용량 속도도 결정할 수 있습니다. 방사선 치료에 반응하여 암세포의 체외 내 클로노네릭 생존 분석은 이러한 데이터를 기존의 선형 이차 모델로 피팅하여 세포주의 내재된 무선 감도의 척도를 제공하는 저렴한 실험이다. 생물학적 효과적인 투여량의 원리와 결합된 이러한 실험에서 추정된 모델 매개변수는 종양 을 베어링 동물 실험에서 동등한 효과적인 용량을 제공하는 방사선 치료를 위한 다양한 분획 스케줄을 개발할 수 있게 합니다. 이것은 생체 내 방사선 요법 일정에서 생체 내 방사선 요법 스케줄을 비교하여 전달된 효과적인 용량의 분산으로 인한 결과의 잠재적 혼란을 제거하기 위해 고려하고 올바른 중요한 요소입니다. 종합, 이 문서는 투여량 출력 검증 전임상 동물 및 캐비닛 조사기, 방사선 감도의 체외 평가 및 작은 살아있는 유기체에서 방사선 전달의 검증을 위한 일반적인 방법을 제공합니다.

서론

암은 총칭하여 미국과 전 세계 많은 국가에서 두 번째로 주요 한 사망 원인을나타냅니다. 방사선 요법은 많은 종양 특수형에 대한 치료의 초석이며 모든 암 환자의 약 절반에 투여된다2,3. 거의 모든 암에 대한 환자 결과는 방사선 량을 전달하는 데 사용되는 장비가 꾸준히 진행되고 일부 효과적인 다중 모달 치료 접근법이개발되었기때문에 시간이 지남에 따라개선되었지만 특정 유형의 종양을 가진 환자의 재발 및 사망률은7,8,9로유지된다. 따라서, 암을 위한 방사선 요법은 기초 및 임상 연구의 적극적인 영역으로 계속합니다. 많은 전임상 방사선 요법 연구는 암의 체외 또는 동물 모델에 방사선 량을 전달하기 위해 소규모 조사자의 사용을 사용합니다. 기계방사선생물학의 세부 사항 또는 새로운 치료법을 탐구하는 수많은 잠재적인 실험을 통해 잘못된 결론, 불량한 재현성 및 낭비된 자원으로 이어지는 일반적인 함정이 발생할 수 있습니다. 이러한 함정은 세 가지 중요한 영역 내에 속합니다: 조사기 정리, 모델 세포주의 체외 특성화, 생체 조사 조사 도징 일정 및 설정. 더 진보된 실험에서 정확하고 재현 가능한 결과는 방사선 요법 연구의 이 근본적인 양상에 선행주의 없이 달성하기 어렵습니다.

여기에 자세히 설명된 프로토콜은 이러한 문제를 피하거나 완화하기 위한 일반화된 전략을 설명하고 독립적인 사용을 위해 이전에 개발된 여러 방법론을 활용합니다. 이러한 독특한 방법은 전임상 방사선 요법 실험을 시작하거나 개선하는 데 관심이 있는 연구원이 이를 강력한 실험 레이아웃으로 사용할 수 있도록 병합되었습니다. 제안된 프레임워크에는 소규모 동물 조사자의 시운전 방법론, 모델 암 세포선의 기본 방사선 학적 특성 결정, 생체 내 종양 모델에 대한 투약 및 분별 일정을 적절히 설계 및 투여하는 방법론이 포함됩니다.

프로토콜

처리 및 절차를 포함하여 실험실 동물의 사용을 포함하는 이 프로토콜의 모든 단계는 웨스트 버지니아 모건타운에 있는 웨스트 버지니아 대학에 있는 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 번호: 1604001894).

1. 용량 출력의 결정

  1. 이 프로토콜을 사용하여 미국 의학 태스크 그룹(AAPM TG) 6110 및 Xstrahl이 설정한 시운전 프로토콜과 유사한 "팬텀 방법" 프로토콜을 기반으로 다음 설정 조건하에서 특정 형상에 대하여 작은 동물 조사자의 빔 출력을 결정한다.
    1. 220kVp 및 13 mA에서 방사선을 전달하는 조사기를 설정하여 광원 (17cm x 17cm)을 등원에서 또는 소스에서 35cm 로 배치합니다. 또한 0.15mm Cu 필터로 빔을 폭넓은 초점으로 필터링합니다. 일부 세포 조사기는 방사성 소스만 포함하며,이 프로토콜은 X 선 조사기에게만 사용할 수 있습니다.
    2. 다음 순서로 고체 물 팬텀을 정렬 : 1cm 슬래브, 이온화 챔버 슬롯2cm 슬래브, 2cm 슬래브, 1cm 슬래브. 이 순서로 고체 물 팬텀을 쌓아 두면 이온화 챔버를 2cm 깊이로 배치하여 4cm뿐만 아니라 백스캐터에도 허용합니다. 도시메트리 설정의 그래픽 묘사는 그림 1을 참조하십시오.
      참고 : 고체 물의 크고 상당히 무거운 스택을 수용하기 위해 저자는 팬텀 스택이 수준과 재료의 표면을 가로 질러 소스에서 올바른 거리에 있는지 확인하기 위해 가변 지지와 사용자 정의 3D 인쇄 소파의 취득을 권장합니다, 뿐만 아니라 중심에.
  2. 측정 장비(즉, ADCL 보정 이온화 챔버, 전기계)를 사용하고 사용되는 보정 인자에 대한 설명은 각각 재료 표 및 표 1에서 찾을 수 있다.
    참고: ADCL은 서로 다른 하프 값 레이어(HVL, 빔 품질 측정)에 대해 몇 가지 지점에서 Nk값을 제공합니다. 프로토콜에 사용할 Nk값은 장치의 측정된 HVL에 대한 ADCL 값의 보간을 기반으로 해야 합니다. 제조업체는 우리 단위의 HVL을 측정하고 우리는 우리의 복용량 속도 출력 결정에 그것을 사용했다.
  3. 팬텀 스택을 설정하고 1.1.2 단계에서 지정된 대로 팬텀에 이온화 챔버를 삽입합니다.
    1. 소스에서 표면 거리(SSD) 또는 방사선 소스에서 제1 표면까지의 거리가 적절히 수평될 때 33cm가 되는 것을 팬텀 스택을 조정합니다.
      참고: 저자는 고체 물 슬래브의 치수를 지원할 수 있을 만큼 커다란 맞춤형 3D 인쇄 소파를 만드는 것이 좋습니다. 또한 이 프로토콜에 활용되는 제품은 팬텀 스택을 평준화하기 위한 조정 가능한 구성 요소가 있습니다.
  4. 300 V로 설정된 전기계 바이어스 전압으로 3개의 별도 엑스레이 노출, 1분 판독값의 평균을 섭취하십시오. 결과는 M+라고합니다.
    참고 : 조사는 220 kVp 및 13 mA에서 방사선을 전달하기 위해 설정 된 계측기로 수행됩니다. 다음 두 단계(1.5-1.6단계)와 동일합니다. 사용자 안전을 위해 치료 중에 도어가 닫혀 있는지 확인하십시오.
  5. -150 V로 설정된 전기계 바이어스 전압으로 세 개의 별도의 X선 노출, 1분 판독값의 또 다른 세트를 수행합니다. 결과는 ML이라고합니다.
  6. -300 V로 설정된 전기계 바이어스 전압으로 세 개의 별도의 X선 노출, 1분 판독값의 또 다른 세트를 수행합니다. 결과는 MH또는 M-라고합니다.
  7. 아래설명과 같이 각각 방정식 1과 방정식 2를 사용하여 P폴과 P이온을 계산합니다.
    figure-protocol-1(방정식1)
    figure-protocol-2(방정식2)
  8. 보정된 디지털 온도계와 기압계를 사용하여 조사기 내부의 온도와 kPa의 압력을 측정합니다. 그런 다음 방정식 3에 표시된 대로 PTP를 계산합니다.
    참고: 이 계산은 ADCL이 공기 케르마 교정 계수에 대한 값을 명시할 때 22°C 및 101.33 kPa의 표준 온도 및 압력 값을 사용했다고 가정합니다.
    figure-protocol-3(방정식3)
  9. 보정 된 챔버 판독값을 계산, M, 원시 챔버 판독을 곱하여, MH,Pelec에의해, P폴,P이온,및 PTP. 이 방정식은 방정식 4에서아래에서 찾을 수 있습니다.
    참고: 이 계산은 ADCL이 -300V로 설정된 바이어스 전압으로 교정을 수행했다고 가정합니다.
    figure-protocol-4(방정식4).
  10. 또한 Nk,[(μ 엔/p)w공기]물,PQ, 참,및 P 칼집에 의해 수정된 챔버판독을 곱한다. P칼집은 물에서 얻은 측정에만 필요합니다. 따라서 이 프로토콜의 경우 P 칼집은 1에불과합니다.
    참고: 이 프로토콜의 조건을 사용하면 후자의 세 항목이 1.0731의 값을 제공합니다. 이 값은 빔 품질에 따라 달라지므로 HVL을 결정하는 것으로 알려야 합니다. 값 1.0731은 당사 단위에 따라 다르며 예제로 제공됩니다. PQ,cham 및 [(μ엔/p)w공기]장치의 값을 결정하려면, 측정된 HVL을 사용하고 표 VII및 표 VIII로부터보간하고, AAPM TG61프로토콜(10)에서 도 3 및 도 4에 따른 기준 필드 크기에 대해 정확하게 한다. 우리의 경우, Nk를 곱하면 물, Dw,Gy에서 1 분의 명목 시간 동안 ADCL Nk 값이 Gy /Coulumbs에서 주어진다고 가정하면 복용량을 제공합니다.
  11. 사용되는 조사자의 최종 효과를 결정합니다. 엑스레이가 처음 생성되면 출력이 유한 시간 동안 전체 값으로 상승합니다. 마찬가지로 x-ray 소스가 꺼지면 일부 유한 시간에 비해 출력이 0으로 감소합니다.
    1. 이 전환 시간 또는 최종 효과를 고려합니다. 이는 전기계 바이어스 전압이 -300 V로 설정된 3개의 판독값의 평균을 다양한 시간 설정에 대해 수행할 수 있습니다. 6, 12, 18, 24, 30 및 60초 동안 이 작업을 수행합니다.
    2. 시간에 대해 전기계 판독값을 플롯하고 최고의 직선을 찾습니다. 총 시간, t, 1 분 치료에 대 한 방정식 5에 의해 계산될 수 있다:
      figure-protocol-5(수학식 5).
  12. 방정식 6에의해 주어진 조사자의 투여속도를 계산합니다.
    figure-protocol-6(방정식6)

2. 방사성 크로믹 필름 교정 곡선 만들기

  1. 필요한 재료 목록은 재료 표를참조하십시오.
  2. 이전 프로토콜과 거의 동일한 설정을 사용하여 필름을 고체 물 팬텀 스택에 2cm 깊이로 배치합니다. 고체 물 팬텀의 순서는 위에 고체 물 2cm, 축적 및 백스캐터 효과를 위해 아래 4cm의 고체 물이 있는 한 미미합니다.
  3. 프로토콜 1에 의뢰된 결정된 용량을 사용하여, 표 2에 나열된 용량에 대한 치료 시간을 방정식 7을사용하여 결정합니다.
    figure-protocol-7(방정식7)
  4. 각 필름의 크기가 같고 스캔 획득을 통해 치료에서 동일한 방향으로 유지되도록 필름의 여러 조각을 준비합니다. 왼쪽 아래 모서리에 작은 대각선 컷을 배치하여 수행할 수 있습니다. 이 시점의 각 필름은 동일한 필름 배치에서 이루어져야 합니다.
    참고: 평가할 각 투여 지점에 대해 3개의 별도의 복제를 준비합니다.
  5. 모든 보정이 꺼진 48비트 컬러 사진 스캐너를 사용하여 절단 조각을 스캔합니다. 각 필름이 스캐닝 침대의 정확한 중앙에 배치되었는지 확인합니다. 얻어진 값은 노출되지 않은 광학밀도(11)및12를결정하는 데 사용되는 사전 노출 스캔이다. 모든 이미지를 저장할 수 있습니다. 주요 데이터의 압축을 피하기 위해 Tiff 파일 형식입니다.
    참고: 저자는 영화를 세 번 스캔하고 획득한 평균을 지정된 필름의 단일 값으로 사용하는 것이 좋습니다.
  6. 이 섹션에 설명된 바와 같이, 필름 의 조각을 4cm의 고체 물 위에 놓고 위의 나머지 2cm의 고체 물을 배치하여 영화의 조사를 시작합니다.
  7. 필름이 용량 출력을 결정할 때 이온화 챔버와 동일한 거리인 소스로부터 동일한 거리되도록 팬텀 세트를 조정한다. 이것은 조사자의 등중심점입니다.
  8. 하나의 처방 된 복용량에 대한 위의 단계 2.3에서 계산 된 치료 시간을 프로그래밍합니다.
  9. 표 2에나열된 각 용량에 대한 반복 치료.
  10. 필름이 빛으로부터 보호된 24시간 동안 휴식을 취할 수 있도록 허용합니다.
  11. 상기와 동일한 방식으로 노출 후 필름 스캔을 획득합니다.
  12. ImageJ 분석 소프트웨어로 이미지를 가져오고 빨간색 채널의 모든 측정을 수행합니다.
    1. 이미지를 드래그합니다. ImageJ에 티프 파일 형식.
    2. 이미지 드롭 다운 메뉴를 클릭합니다. 이미지 드롭 다운 메뉴에서 색상을 선택합니다. 색상 옵션에서 분할 채널을 선택합니다.
    3. 빨간색 이미지 채널만 사용하여 사각형 도구를 사용하여 관심 영역을 그립니다. Ctrl +M을누릅니다. 결과 창에서 평균 값을 전사합니다.
    4. 모든 스캔 된 영화에 대해 2.12.1-2.12.4 단계를 반복합니다.
  13. 노출되지 않은 필름과 노출되지 않은 필름모두에 대해 중앙에 위치한 1cm x 1cm 정사각형에서 픽셀 값을 가져옵니다. 이러한 값은 각각 PVU(D) 및PV(D)로 표시되며, 수학식 8에설명된 바와 같이 순 광학 밀도를 계산하는 데 사용할 수 있다.
    figure-protocol-8 (방정식8) 13
  14. 사전 노출 및 노출 후 각 필름 이미지 쌍에 대해 2.13 단계를 반복합니다.
  15. 순 광학 밀도 대 용량그래프를 플롯하고 곡선을 y = ax3 + bx2 + cx + d 의 형식으로 입방 다각형에 맞춥니다. 그림 2B에서예제를 찾을 수 있습니다.

3. 클로노제닉 분석서를 통해 특정 암 세포주를 위한 α/β 가치의 결정

참고: 다음 프로토콜은 Franken 외14에 의해 설명된 메서드의 수정된 버전이며 그림 3에서볼 수 있습니다.

  1. 세포를 ~80%의 합류로 증가시다. 세포가 세포 성장의 로그 단계에 있는 것이 필요하기 때문에 이 실험을 위해 세포의 과잉 수렴 원을 사용하지 마십시오. 도 3C에표시된 대표적인 클로노겐성 분석 결과의 경우, 뇌열대 MDA-MB-231 유방암 세포는 덜벡코의 수정된 이글 배지(DMEM)에서 배양되어 10%의 태아 소 혈청및 페니실린/연쇄상구균증으로 보충되어 37°C에서 배양되었고 5%의 이산화탄소에서 배양하였다.
  2. 콜로니 분석에 대한 원하는 밀도로 세포를 시드. 시드 동안 정확한 희석은 분석기의 도금 효율을 결정하는 데 중요합니다. 여러 복제판을 플레이트해야 합니다.
  3. 방사선 치료가 세포 도금(도 3A)에선행될 경우이 단계를 진행합니다. 대안적으로, 세포 도금이 방사선 처리에 선행될 경우 3.4 단계로 진행한다.
    1. 배양 플라스크에서 원하는 방사선 치료를 수행합니다. 모든 추가 치료 (즉, 약물 치료) 전후 모든 시점에서 수행 될 수 있습니다. 도 3C의대표적인 결과에 대해, 방사선 치료는 도금 세포 후 발생, 단계 3.4에 상세.
    2. 바람직한 트립시화 방법을 사용하여 세포를 추출하고 단일 셀 현탁액을 만듭니다. 배양 배지를 제거하고 재조합 효소(예: 트립LE 익스프레스)를 추가하여 플라스크에서 세포를 분리합니다. 세포가 광 현미경을 사용하여 검출된 바와 같이 분리될 때까지 약 3분 동안 효소로 세포를 배양한다. 동일한 양의 세포 배양 매체를 사용하여 효소를 중화시합니다. 원심분리기 세포는 300 x g에서 10분 동안 배양 배지에서 원하는 농도로 재연한다.
    3. 여러 복제에서 원하는 밀도로 셀을 플레이트.
    4. 처음 24 시간 후에 신선한 매체로 교체하십시오.
    5. 2-3일마다 미디어를 계속 교체하십시오.
    6. 대조군 식민지가 식민지 당 50 세포를 초과 할 때까지 세포를 배양 계속, ~ 9-14 일. 대조군 식민지는 방사선 량이 없는 치료 군입니다. 약물 치료를 이용한 실험의 경우 약물 주입을 가진 또 다른 대조군이지만 방사선 치료도 필요하지 않습니다.
  4. 방사선 치료 전에 세포를 파종할 때 이 단계를 진행한다(도3B).
    1. 바람직한 트립시화 방법을 사용하여 세포를 추출하고 단일 셀 현탁액을 생성합니다.
    2. 셀을 원하는 밀도에 여러 복제하여 배치합니다.
    3. 세포가 하룻밤 동안 접시에 부착되도록 허용합니다.
    4. 원하는 방사선 량을 수행합니다. 약물 약물 치료와 같은 추가 치료는 세포가 치료 판에 부착 된 한이 단계 전후의 모든 시점에서 수행 될 수 있습니다. 도 3C에서대표적인 결과를 위해, 1250개의 뇌-열대 MDA-MB-231 세포가 치료 전에 도금하였다(단계 3.4). 이어서, 세포는 엑스레이의 3Gy로 조사하기 전에 3 시간 전에 15 nM 독소루비신으로 처리되었다.
    5. 초기 24 시간 이후에 미디어를 교체합니다.
    6. 2-3일마다 미디어를 교체합니다.
    7. 대조군 식민지가 50세포를 초과할 때까지 처리된 세포를 배양하고, ~9-14일을 배양한다. 대조군 식민지는 방사선 량이 없는 치료 군입니다. 약물 치료를 이용한 실험의 경우 약물 주입을 가진 또 다른 대조군이지만 방사선 치료도 필요하지 않습니다.
  5. 우물이나 접시에서 문화 매체를 제거하고 PBS로 세척하십시오.
  6. 빙하 아세트산과 메탄올의 1:7 (v:v) 용액에서 15분 동안 세포를 수정합니다.
  7. 고정 솔루션을 제거합니다.
  8. 고정 후, 얼룩 세포30 분, 또는 2 시간 사용 가능한 경우, 실온에서 2.5-5.0 mg/mL 용액의 크리스탈 바이올렛4:1 (v:v) 증류수 및 메탄올용액.
  9. 염색 용액을 제거하고 실온의 큰 수조에서 세포를 씻으실 수 있습니다.
    참고: 흐르는 물 에서 씻지 마십시오.
  10. 각 치료 군에서 결과 수의 콜로니수를 계산하고 각 플레이트의 생존 분수를 계산합니다.
  11. 전달된 해당 용량에 대해 생존 분수를 플롯하고 기하급수적 핏으로 곡선에 맞춥시게 합니다.
  12. α/β 값을 추정하려면 위의 플롯의 지수를 사용하여 아래와 같은 선형 이차 방정식에서 각 조정 가능한 매개변수의 값을 추정합니다.
    figure-protocol-9(방정식9)
    참고: 필드 크기가 잘 접시 나 페트리 접시를 수용 할 수있을만큼 큰 경우 세포의 조사는 일반적으로 어떤 진열없이 동위 센터에서 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 잠재적 인 함정에는 식민지 형성, 명확한 세포 성장을 가진 중요한 세포 이동, 또는 비멸 적 조사실에서의 치료로 인한 오염과 같은 수율을 포함 할 수 있습니다.

4. 가변 실험 설계에 대한 특정 용량 출력의 결정

  1. 소스에서 원하는 필드 크기와 거리를 결정합니다.
    참고: 콜리메이션은 X선 소스에서 콜리메이터의 크기 나 거리에 관계없이 용량 속도를 변경합니다.
  2. 고체 물 팬텀을 사용하여 축적 및 백스캐터(backscatter)를 제공하며, 실험 설계를 가장 잘 묘사하는 올바른 방향으로 필름 조각을 배치합니다.
    참고: 실험용 고체물은 주어진 설계를 가장 정확하게 표현하지 못할 수 있습니다. 대신 실제 실험 용기(예: 페트리 접시, 잘 접시, 작은 동물 팬텀 등)를 사용하는 것이 좋습니다.
  3. 1 (N =3) 및 2 (N = 3) 분에 대한 필름을 조사합니다.
  4. 필름이 빛으로부터 보호된 24시간 동안 휴식을 취할 수 있도록 허용합니다.
  5. 섹션 2의절차에 따라 각 필름의 순 광학 밀도를 결정합니다. 필름 교정 곡선을 사용하여 순 광학 밀도에서 용량을 결정합니다.
  6. 1 분, D1에서용량을 결정, 출력 용량 속도로, Ḋ, 수학식에 의해 정의 된이 실험 설정에 대한 10 다음과 같이:
    figure-protocol-10(방정식10)
  7. 마찬가지로, 다음과 같이, 수학식 11에 의해 2 분에 복용량을 caluclate:
    figure-protocol-11(방정식11)
  8. 최종 효과로 인해 위의 계산에 대한 투여량률은 약간 다를 수 있습니다. 이러한 이유로 원하는 실험 설계에 대한 D소모를 계산하려면 수학식 12에표시된 개별 D소모의 평균을 사용합니다.
    figure-protocol-12(방정식12)
  9. 이 평균을 사용하여, 방정식 13에서이특정 설정에 대한 원하는 용량으로 치료하는 시간을 정의 :
    figure-protocol-13(방정식13)

5. 해부학적 위치에서 종양을 베어링 하는 마우스 치료

  1. 기관의 IACUC에 의해 승인 된 안전하고 인도적인 마취 기술로 마우스를 마취.
  2. 마취된 동물을 원하는 실험 설계에 표시된 대로 구속하여 놓습니다.
  3. 이 단계는 5.6 단계로 진행할 수 없는 경우 선택 사항입니다. 알루미늄 필터를 사용하여 교개하지 않고 마우스의 온보드 포털 카메라를 사용하여 전파그램을 가져옵니다.
  4. 제 자리에서 충돌과 두 번째 방사선 을 가져옵니다.
  5. ImageJ에서 방사선 사진을 오버레이하여 빔 포지셔닝을 시연합니다.
  6. 소정의 α/β 값을 사용하여, 연구 질문에 대답하는 가장 합리적인 접근 방식을 제공하는 투여 계획을 결정하십시오 (즉, 3 Gy의 10 분수에서 전달된 30Gy의 투여 효과를 모델링하고 싶지만 4 개의 분수만 주고 자하는 경우). 수학식(14)을 사용하여, 가정된 α/β 값이 10(이 값은 프로토콜 3에서개별 암 세포주를 위해 결정될 수 있음) 및 30 Gy/10 F의 것과 유사한 BED, 6Gy의 4분획에서 24Gy로 치료한다.
  7. 원하는 복용량에 대 한 주어진 처방 된 시간에 대 한 동물을 치료.

6. 생체 내에서 용량 증착의 조직학적 확인

  1. 다음 프로토콜 5는치료 1시간 이내에 관심 있는 조직을수집15,16. 조직 수확에 따라, 바람직한 면역 조직 화학 프로토콜을 진행한다. 다음은 예제가 있습니다.
  2. 얼음 감기 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)와 동물을 perfuse.
  3. 4 °C에서 PFA에서 수정 후 수정.
  4. 고정 후, 실온에서 각각 24시간 동안 조직을 10%, 20%, 30%로 순차적으로 수정합니다.
  5. 젤라틴에 조직을 포함하고 순차적으로 4 % PFA에 수정하고 실온에서 각각 24 시간 동안 10-30 % 자당에 다시 수정합니다.
  6. 블록을 잘라 30 분 동안 -80 °C에서 배치합니다.
  7. 조직을 20-30 μm 섹션으로 슬라이스합니다.
  8. 면역스테인은 6개의 웰 플레이트17,18에서무료 부동 섹션으로 미끄러져 있습니다.
    1. 트리톤 1%의 리신 1.83%, 열불성 염소 세럼으로 셰이커에서 30분간 세 번 씻고 퍼메라빌리징을 합니다.
    2. 24시간 동안 항γH2AX 항체를 배양한 다음 원하는 이차 항체를 통해 2시간 배양합니다.
    3. 선호하는 장착 미디어를 사용하여 유리 커버립이 있는 커버슬립 슬라이드.
  9. 형광 현미경에 이미지.

결과

다음 프로토콜 1 Gy/min에서 복용량 속도를 제공할 것 이다, 사용 되는 조사에 특정. 그러나, 조사기의 종류에 관계없이, 공지된 투여량 비율로 교정 곡선은 도 2A-B에서유사한 필름과 유사한 교정 곡선을 산출하는 프로토콜 2를사용하여 생성될 수 있다. 프로토콜 3의 성공적인 분석은 균질적으로 보라색을 얼룩지게 하는 세포의 뚜렷하고 잘 구분된 식민지를 얻을 것입니다. α/β 추정치는 주어진 세포주들의 무선 감도를 해석하기 위해 문헌 값 또는 기타 치료 그룹과 비교될 수 있다. 프로토콜 2에 따라 개발된 교정 곡선을 활용하여 도 2B에표시되고, 프로토콜 4는 필요한 실험 조사 시간을 추정하는 데 사용할 수 있는 도 2A와 유사한 두 개의 필름 샘플을 산출한다. 조사자가 사용되는 온보드 포털 이미징 카메라를 사용할 수 있는 경우, 작은 동물의 방사선 사진은 충돌 없이 얻을 수 있습니다. 이러한 이미지를 오버레이하면 도 4A에묘사된 대로 처리되는 작은 동물을 기준으로 충돌된 방사선 빔의 정확한 위치를 보여 줍니다. 프로토콜 5에서 성공적인 용량 증착은 프로토콜 6에 따라 확인할 수 있다. 방사선이 생체 내 또는 체외 시스템에 증착되고 있다는 한 가지 징후는 이중 좌초 된 DNA 파손의 검출을 통해서입니다. 도 4B에도시된 동일한 마우스는 도 4A에서오른쪽 반구를 통해서만 처리된 것으로, 처리된 반구에서만 포정 γH2AX 염색을 보여 준다. 이 그림에서 핵은 두 가지를 보여주기 위해 DAPI로 염색됩니다. 1) 전체는 조직학적 분석 중에 항γH2AX 항체가 적용된 뇌의 전체이며, 2) 뇌의 치료되지 않은 반구는 스테인드되지 않은 채로 남아 있다.

figure-results-1
그림 1: 용량 출력의 측정을 위해 설정된 이온화 챔버 및 물 팬텀의 거친 설정. 피토그램은 이온화 챔버와 세료의 캐비닛 내에서 고체 물 팬텀을 사용하여 도시에 필요한 다양한 구성 요소를 활용하는 기본 설정을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 방사성 크로믹 필름을 사용하여 교정 곡선의 생성. (A)용량이 증가하는 방사성 크로믹 필름의 대표적인 색상 변화. 왼쪽 위 (0 cGy); 오른쪽 아래 (2000 cGy). (B)순 광학 밀도 및 용량을 비교하는 잠재적 방사성 크로믹 필름 보정 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 암세포의 종양 분석. 세포의 방사선 치료는 6개의 웰 플레이트/페트리접시(A)또는 그후(B)로도금하기 전에 수행할 수 있다. 패널(C)에서대표적인 이미지는 의정서 제3항을 따른 후 MDA-MB-231 유방암 세포와 함께 성공적인 클로노제닉 분석의 표시를 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 배치(가능한 경우) 및 용량 증착 확인을 위한 양수 γH2AX 면역히스토케미칼 염색을 위한 이중 오버레이 방사성그램의 사용. (A)방사선 빔의 배치를 묘사하는 대표적인 오버레이 방사선 사진. (B)γH2AX 강도 증가에 의해 입증된 바와 같이 오른쪽 반구에 대한 투여량 증착을 나타내는 대표적인 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보정 계수설명
Nθ공기 케마 교정 계수
【(μ엔/θ)W공기】 물 공기에 물의 질량 에너지 흡수 계수의 배급; 약 1.05
Pq, 참 챔버에 의해 광자 연도 감기에 영향을 미치는 챔버 줄기에 대한 보정 회계; 약 1.022
P칼집 이온화 챔버를 보호하는 칼집에 대한 보정 회계; 챔버가 방수이기 때문에 1의 값
P폴 극성을 고려한 보정 계수; 프로토콜 1에서 결정
P이온 이온 재조합에 대한 보정 계수 회계; 프로토콜 1에서 결정
PTp 실험 당일 에테메르파처 및 압력에 대한 보정 계수 프로토콜 1에서 결정

표 1: 프로토콜 1에서 복용량 속도의 결정에 필요한 교정 요인.

복용량N
0.53
13
23
33
43
63
83
103
12*3
15*3
20*3
* 개별 실험에 대해 10을 초과하는 용량에만 필요합니다.

표 2: 방사성 크로믹 필름 교정 곡선의 생성에 사용되는 복용량.

토론

위의 프로토콜은 방사선 dosimetry를 위한 사용자 친화적인 접근, 암 세포주에서 α/β 값의 결정 및 유방암 뇌 전이의 전임상 모형에 있는 조사를 위한 접근의 간략한 보기를 기술합니다. 이 방법은 암의 어떤 모형든지 연구하기 위하여 이용될 수 있고 유방암의 두뇌 전이에 만국한되지 않습니다. 이 섹션에서 우리는 임상 전 방사선 요법 실험의 근본적인 관련 복잡성에 대해 논의할 것입니다.

Dosimetry는 두 가지 부품을 포함: 1) 농부 챔버와 출력을 보정, 그래서 X 선 단위의 용량 속도설정, 그리고 2) 방사성 염색체 필름을 사용하여 실용적인 dosimetry 측정 시스템을 준비. 출력 교정과 관련하여 TG-61은 물에서 재현 가능한 방법을 제공합니다. 여기에 프로토콜은 감멕스 RMI 457 고체 물을 사용, XStrahl에 의해 권장, 조사자의 제조 업체. 고체수와 함께 상대적 도시(프로파일 또는 깊이 투여 곡선이 최대 용량으로 정상화) 분석이 고체물로 1% 이상 더 나은 것으로 합의하지만, 물에 비해 고체 물에 대한 질량 흡수 계수로 인해 절대 투여량의 약 3~4%의 차이가 있다. 그러나 XStrahl 시스템의 모든 설치가 출력 보정을 위해 고체 물 프로토콜을 사용하므로 이러한 차이점에 대해서는 수정되지 않았습니다. 출력을 알면 원하는 용량을 제공하는 데 필요한 노출 시간을 계산할 수 있습니다. 농부 챔버와 같은 설정에 필름을 배치하면 우리가 영화에 알려진 복용량을 제공 할 수 있습니다. 그런 다음 필름을 스캔하면 광학 밀도가 제공됩니다. 필름에 대한 용량은 해당 순 광학 밀도(노출 전후광학 밀도의 차이)에 대해 그래프로 분석될 수 있다. 이렇게 하면 필름 교정 곡선이 생성됩니다. 우리가 실험 적인 설정을 변경할 때, 그 상황에서 복용량 속도 변경할 수 있습니다., 복용량 속도 필드 크기에 따라 달라 집니다 때문에, 깊이 및 조사 되는 재료. 실험용 설정으로 필름을 노출하면 순 광학 밀도가 제공되며 필름 교정 곡선을 사용하여 해당 용량을 결정할 수 있습니다. 필름이 조사 될 때까지이 복용량을 분할, 우리는 복용량 비율을 얻을. 이러한 용량 속도는 주어진 실험 설정에 대해 원하는 용량을 제공하기 위해 노출 시간을 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 위에서 설명한 프로토콜은 필름 도시미트리와 관련된 몇 가지 뉘앙스를 처리합니다. 예를 들어, 노출 후 필름은 필름의 활성 층에서 화학 반응이 거의 완료되기 위해 약 24시간이 필요합니다. 이 시간을 기다리지 않는 것은 낮은 광학 밀도로 이어질 것입니다.

재현 가능한 dosimetry를 가지고 어떤 연구를 위해 알고 주어진 조사자의 핵심 요소 의 몇 가지를 이해하는 것이 중요합니다. 특히, 다른 연구진에게 사용되는 조사자의 제조 및 모델을 알고 자세하게 아는 것이 중요합니다. 소스 유형(x-ray, 방사성 등), 에너지, 반값 층, 현장 크기, 원거리, 조사된 물질의 크기, 조사 된 물질, 실험 별 용량 속도, 분획 스키마, 정확한 도시계 장비 활용 및 도시 트라이 프로토콜이 사용되는 dosimetry 프로토콜에 대한 표면 및 소스. 이러한 모든 정보 지점은 어떤 동물이나세포(19)에투여량을 전달하기 전에 주어진 조사자의 빔 품질을 응집력 있게 설명하는 것입니다. 이 프로토콜 및 다른 사람으로부터 정보의 또 다른 관련 점은 프로토콜 에서 달성 된 복용량 속도 단순히 사용 되는 조사자의 출력. 주어진 실험에 대해 생성된 방사성 색소믹 필름 교정 곡선(Protocol2)과비교하여 특정 설정(Protocol4)에대한 투여속도를 정의하는 것이 중요하다.

체외 실험은 암 세포주의 방사선 학적 행동에 대한 중요한 세부 사항을 제공합니다. 체외 내 clonogenic 세포 생존 측정체는세포주(20)의내재된 무선 감도를 정확하게 추정하고 정량화하며, 후속 세포 또는 소형 동물실험(21)에서분획 스케줄의 설계를 돕는다. 구체적으로, 이러한 분석은 방정식에 따른 방사선 요법에 대한 응답으로 세포 사멸을 예측하기 위해 선형 이차 모델에서 사용되는 매개 변수 α 및 β 대한 대략적인 값입니다.

figure-discussion-1(방정식9)

여기서 SF는 clonogenically 실행 가능한 세포의 생존 분수인 경우, D는 Gy에서 방사선 량이며, α 및 β파라미터(22)를장착한다. α/β 비율은세포주(22)의감도와 상관관계가 높은 높은 값으로 셀룰러 무선 감도의 내재된 측정값을 제공한다. 이러한 기능적 관계는 투여량에 대하여 비선형이기 때문에, 방사선요법 분획 계획의 생물학적 효과는 전달된 총 투여량뿐만 아니라분획(23)의수와 크기에도 관련이 있다. 생물학적 유효 용량(BED)은 조직에 전달된 진정한 생물학적 투여량의 척도이며, 상이한 분획 체계24,25의직접 비교를 허용한다. BED 방정식은 α/β 추정치만 필요하며 아래에 표시됩니다.

figure-discussion-2(방정식14)

여기서 n은 투여량 D. Clonogenic 세포 생존 시도의 분수의 수로 α/β 추정하고 BED 방정식을 통해 방사선 요법 분획 계획의 직접적인 비교를 용이하게 한다. 치료 군내 또는 실험 사이에 BED가 공평하지 않은 경우 방사선 요법(또는 다른 양식과 방사선 요법의 조합)에 대한 조직 또는 장기 반응에 관한 잘못된 결론이 그려질 수 있습니다. 예를 들어, 5Gy의 4분획에 비해 10Gy의 2분수는 동일한 BED를 산출하지 못하므로 이러한 투약 계획은 생물학적 반응측면에서 직접 비교할 수 없습니다. BED 방정식은 선형 이차 모델의 내재된 한계로 인해 불완전하지만 광범위한 실험 적 치료조건(24,25)에대해 공평한 효과를 안정적으로 추정합니다.

Clonogenic 세포 생존 assays 명확하게 암 모형에 있는 방사선 요법 효력을 공부에 있는 중요한 역할을 합니다, 그러나 시험관 내 실험은 암 세포 방사선생물학의 기계론적인 세부사항을 더 탐구하기 위하여 추가 선택권의 수를 제공합니다. 클로노겐세포 생존 분석의 간단한 변형은 파클리탁셀 또는 에토포사이드(26,27)와같은 일부 무선 민감화화학요법에 대한 행동 모드를 결정하는 데 사용되었다. 추가 체외 실험 옵션은 이중 좌초 DNA 브레이크수리(28)에대한 γ-H2AX 포시 및/또는 53BP1 염색과 같은 특정 세포 수리 경로를 검사하는 면역 세포 화학 연구를 포함한다. 이러한 실험은 특히 주어진 세포주에 대한 기계론적 세부 사항을 탐구할 때, 특히 복합 요법과 단일 양형으로 방사선 요법을 비교할 때 특히 흥미로할 수 있습니다. 다른 실험 옵션으로는 세포사멸 의 모드(즉, 세포사멸, 괴사, 미토틱 재앙 등)의 조사 또는 분석에 대한 세포의 염증 반응의 선천적 역할을 검사하기 위한 사이토카인측정(29,30,31)을포함한다. 실험의 이 모형은 동물 실험을 보완하거나 대체할 수 있고 암 세포 선의 방사선 생물학의 더 완전한 이해를 제공할 수 있습니다. 수행하기 위한 추가 실험의 선택에 관계없이 프로토콜 3에 기재된 표준 clonogenic 세포 생존 분석은 세포주의 중요한 초기 방사선학적 평가이다.

Clonogenic 분석 및 방사선 dosimetry는 임상 시나리오와 더 직접적으로 유사한 실험을 정확하게 계획하는 방법을 연구원에게 제공합니다. 전임상암 소형 설치류 모델을 첨가하면, 생체내에서 의한 치료계획의 맥락에서 단독으로 또는 방사선에 대한 반응을 연구할 수 있다. 동물을 사용하기 전에, 용량출력(32,33)의측정에 사용되는 설정과 다른 경우 특정 설정의 상대적 용량 출력을 결정하는 것이 중요하다. 그것은 & 10 mm의 필드 크기에 대 한 복용량 속도 결정에 관해서, 이온화 챔버의 사용은 작은 필드 내정렬 및 부분 볼륨 평균 효과33으로 인해 덜 정확해진다. 방사성크로믹 필름을 사용하여 생체 내 면역히스토케 실험과 병용하여 출력을 결정하는 데 사용되어 지난16,34,35, 36,37,38에서의 출력 및 용량 증착을 결정하는 데 사용되었다.

공개 사항

저자는 공개가 없습니다.

감사의 글

저자는 보조금 번호 P20GM103434에 의해 지원되는 그들의 장비의 사용에 대한 WVU에서 현미경 및 동물 모델 이미징 촉진자 감사하고 싶습니다. 또한, 이 작품은 국립 암 연구소 교부금 번호 F99CA25376801, Mylan 의자 인다우먼트 기금에 의해 일반 의학의 국립 연구소에서 보조금 번호 P20GM121322에 의해 지원되었다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세트산, 빙하Sigma-AldrichA6283이 빙초 제품 또는 유사한 빙초 제품이 허용됩니다.
크리스탈 바이올렛시그마-알드리치C6158이 제품 또는 유사한 크리스탈 바이올렛 제품을 사용할 수 있습니다.
디지털 압력계Fisher Scientific14-650-118압력 및 온도 측정용.
전위계표준 이미징CDX 2000B; 보정 계수 필요, Pelec
FilmGafchromicEBT3 필름25매로 제공; 보정 필름 및 실험 필름은 동일한 세트에서 가져와야 합니다
이온화 챔버파머PTW TN30013ADCL @ 두 개의 보정 포인트에 의해 보정됨
메탄올시그마-알드리치34860이 또는 유사한 메탄올 제품이 허용됩니다.
포토 스캐너EpsonPerfection V700동급 스캐너는 V800, V10000, V11000, V12000
XenXXstrahlNAIrradiator를 사용합니다.
ADCL에 의해 보정된

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