방법 논문

잠재적 인 후성 유전학 마커의 하향 식 질량 분광프로파일링을위한 수줌 잎 조직에서 히스톤의 격리

DOI:

10.3791/61707

⸱

2021년 3월 4일

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1Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 2DOE-Joint Genome Institute, Lawrence Berkeley Laboratory, 3Kearney Agricultural Research and Extension Center, University of California Agriculture and Natural Resources, 4West Side Research and Extension Center, University of California, 5Department of Plant Sciences, University of California, Davis, 6Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 엔지니어링 가뭄 내성 작물을 돕기 위해 잠재적 후성 유전학 마커역할을 할 수 있는 번역 후 변형 후 프로파일링을 위해 사탕수잎 재료로부터 손상되지 않은 히스톤을 효과적으로 추출하기 위해 개발되었습니다.

초록

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히스톤은 진핵생물에 있는 고도로 보존된 단백질의 가족에 속합니다. 그(것)들은 크로마틴의 기능적인 단위로 뉴클레오소좀으로 DNA를 포장합니다. 매우 역동적이고 효소에 의해 추가되거나 제거될 수 있는 히스톤의 번역 후 변형(PTM)은 유전자 발현 조절에 중요한 역할을 합니다. 식물에서, 후성 유전학 요인, histone PTM을 포함 하 여, 환경에 그들의 적응 응답과 관련. 후성 유전학 적 제어의 분자 메커니즘을 이해하면 혁신적인 생명 공학 솔루션에 전례없는 기회를 가져올 수 있습니다. 본명, 우리는 핵을 분리하고 사탕수수 잎 조직에서 히스톤을 정화하는 프로토콜을 설명합니다. 추출된 히스톤은 온라인 반전 단계(RP) 액체 크로마토그래피(LC)와 결합된 하향식 질량 분석법(MS)에 의해 온전한 형태로 분석될 수 있다. 동일한 히스톤 프로테오폼에 여러 PTM의 조합 과 스토이치오메트리를 쉽게 식별할 수 있다. 또한, 히스톤 테일 클리핑은 하향식 LC-MS 워크플로우를 이용하여 검출될 수 있으므로 코어 히스톤(H4, H2A, H2B, H3)의 글로벌 PTM 프로파일을 산출할 수 있다. 우리는 가뭄 저항의 후성 유전학 마커를 확인하기 위한 대규모 필드 연구 결과에서 집합된 사탕잎 조직에서 히스톤 PTM을 프로파일링하기 위하여 이전에 이 프로토콜을 적용했습니다. 이 프로토콜은 잠재적으로 크롬마틴 면역 침전 시퀀싱(ChIP-seq)에 맞게 조정되고 최적화될 수 있으며, 유사한 식물에서 그의 음색 PTM을 연구할 수 있습니다.

서론

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가뭄의 심각도와 빈도가 증가하면 시리얼 작물1,2의생산성에 영향을 미칠 것으로 예상됩니다. 수쿰은3,4의수중제한조건을 견딜 수 있는 뛰어난 능력으로 유명한 시리얼 식품 및 에너지 작물입니다. 우리는 가뭄 스트레스, 식물 개발 및 사탕수수의 후성 유전학 사이의 상호 작용에 대한 기계적 이해를 추구하고 있습니다 [수줌 바이 컬러 (L.) Moench] 식물. 우리의 이전 작품은 가뭄 적응과 분자수준5,6,7에서반응에 식물과 뿌리 부피 미생물군유전체 사이의 강한 연결을 입증했다. 이 연구는 미래의 기후 시나리오에 작물을 적응에 후성 유전학 공학을 활용하기위한 길을 열 것입니다. 후성유전학을 이해하는 노력의 일환으로, 우리는 식물 유기체 내의 유전자 발현에 영향을 미치는 단백질 마커를 연구하는 것을 목표로 합니다.

히스톤은 크로마틴의 기본 단위로 뉴클레오소로 D....

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프로토콜

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1. 사탕수수 잎 소재 준비

참고 : 사탕수수 식물은 칼리어, 캘리포니아에있는 필드에 토양에서 재배되었다.

  1. 식물에서 수중 잎을 50mL 원심분리기 튜브로 수집하고 즉시 액체 질소로 튜브를 얼릴 수 있습니다. 제 3 및 네 번째 완전히 출현 한 잎을 1 차 경작기에서 떼어 내며 잎 조직을 수집하십시오.
    참고: 현장 상태, 샘플 증가 및 수집에 대한 자세한 내용은 게시된 보고서18에서찾을 수 있습니다.
  2. 액체 질소로 잎을 갈아서 원심분리기 튜브로 즉시 옮깁니다.
  3. 사용할 때까지 -80 °C에 접지 잎을 저장합니다. 각 샘플의 히스톤 분석을 위해 저온 분쇄 잎 분말 약 4 g을 섭취하십시오.

2. 버퍼 및 재료 준비 (3-4 시간)

참고: 고농도 재고 솔루션은 미리 만들어 사용할 때까지 저장할 수 있습니다. 그러나 모든 작업 버퍼는 추출 당일 (재고 희석 및 다른 내용과 혼합하여) 신선하게 만들어져야하며 공정 중에 얼음위에 두어야합니다. 그렇지 않으면 권장하지 않는 한 전체 실험은 4 °C에서 수행되어야합니다.

  1. 연속 교반이 ....

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결과

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프로토콜에 따라, 히스톤은 LC-MS 분석을 사용하여 추출 및 식별될 수 있다. 원시 데이터 및 처리된 결과는 액세스를 통해 MassIVE(https://massive.ucsd.edu/)에서 사용할 수 있습니다: MSV0000085770. 대표 샘플(MassIVE에서도 사용 가능)의 TopPIC 결과를 바탕으로 303개의 히스톤 프로테오폼(106 H2A, 72 H2B, 103 H3 및 22 H4 프로테오폼)을 확인했습니다. 공동 정제 리보소말 프로테오폼도 검출되었으며, 일반적으로 LC초기에 발례한다. 그들은 일반적으로 식별 된 프로테오폼의 ~20 %로 구성되지만 LC 그라데이션의 후반 단계에서 용출하는 히스톤 프로테오폼과 겹치지 않습니다. 결과는 최신 TopPIC 또는 정보 프로테오믹스 패키지로 쉽게 시각화할 수 있습니다. 데모를 위해 원시 MS 파일을 직접 로드하고 프로테오폼 식별을 수동으로 검사하는 데 사용할 수 있는 정보-Proteomics 패키지를 사용하여 데이터 시각화에 중점을 둡니다. 두 소프트웨어 패키지 모두 서로 .......

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토론

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제시된 프로토콜은 사탕수수 잎(또는 일반적으로 식물 잎) 샘플에서 히스톤을 추출하는 방법을 설명합니다. 평균 히스톤 수율은 4-5g 의 사탕수수 잎 재료당 2-20 μg가 될 것으로 예상됩니다. 재료는 LC-MS에 의한 하류 히스톤 분석에 대해 충분히 순수합니다 (대부분 - 20 % 리보솜 단백질 오염이있는 히스톤). 샘플 변형 또는 프로토콜 전체의 잠재적 인 오류 처리 / 오류로 인해 낮은 수율을 얻을 수 있습니다. 핵 리시스 단계 전에 핵의 무결성을 유지하는 것은 중요합니다. 따라서 NLB를 추가하기 전에 공격적인 소용돌이 및 파이펫팅을 피해야 합니다. 또한, 펠릿으로부터 초중자를 제거할 때 핵의 손실이 발생할 수 있다. 파이프를 할 때 펠릿을 방해하지 않도록주의해야합니다. 트리톤 X-100 농도는 1%로 비표적 소기관을 선택적으로 리세이크하도록 최적화되었지만 핵(step 3.2)은 아니다. 다른 조직 또는 유기체에 대한 최적의 세제 농도는 다를 수 있으며 실험적으로 결정될 필요가 있습니다. 여과 과정에서 상체의 색상 변경은.......

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감사의 글

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우리는 대량 분광 실험에 도움을 준 로널드 무어와 토마스 필모어, 그리고 매튜 먼로에게 데이터 증착을 해준 것에 감사드립니다. 이 연구는 미국 농무부(USDA)의 수상 번호 DE-SC0014081에 따라 수쿰(EPICON) 프로젝트에서 가뭄 대응의 후성유전학 적 통제를 통해 미국 에너지부 (DOE) 생물 및 환경 연구의 보조금에 의해 지원되었다; CRIS 2030-21430-008-00D, 그리고 공동 바이오 에너지 연구소 (JBEI)를 통해, 로렌스 버클리 국립 연구소와 DOE 사이의 DOE (계약 DE-AC02-05CH11231)가 후원하는 시설. 이 연구는 생물환경연구실이 후원하는 과학사용자 시설 DOE 사무소인 환경 분자 과학 연구소(EMSL)(grid.436923.9)를 사용하여 수행되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세토니트릴피셔 케미컬A955-4L
디티오트레이톨(DTT)시그마43815-5G
EDTA, 500mM 용액, pH 8.0EMD Millipore Corp324504-500mL
포름산Thermo Scientific28905
구아니딘 하이드로클로라이드시그마G3272-100G
MgCl2SigmaM8266-100G
인산칼륨, 이염기성SigmaP3786-100G
프로테아제 억제제 칵테일, cOmplete 정제Roche5892791001
부티르산나트륨Sigma303410-5G히스톤 탈아세틸화효소 억제제에 사용
염화나트륨(NaCl)SigmaS1888
나트륨 불소시그마S7020-100G인산가수분해효소 억제제에 사용
오르토바나데이트시그마450243-10G인산가수분해효소 억제제에 사용
설탕시그마S7903-5KG
Tris-HClFisher ScientificBP153-500 g
트리톤 X-100시그마T9284-100ML
약한 양이온 교환 수지, 메쉬 100-200 analytical (BioRex70)Bio-Rad142-5842
Disposables
Chromatography column (Bio-Spin)BIO-RAD732-6008
Mesh 100 filter clothMillipore SigmaNY1H09000이것은 식물 핵 추출을 위한 Sigma 키트(카탈로그 # CELLYTPN1)의 일부입니다. 메쉬 크기가 같은 유사한 필터를 사용할 수 있습니다.
마이크로피펫 팁(P20, P200, P1000)시그마
튜브, 50mL/15mL, 원심분리기, 원뿔Genesee Scientific28-103
튜브, 마이크로 원심분리기, 1.5/2mL Sigma
Equipment
Analytical BalanceFisher Scientific01-912-401
비커( 50mL – 2L)
냉각 기능이 있는 마이크로 원심분리기Fisher Scientific13-690-006
마이크로피펫
냉각 기능이 있는 스윙 버킷 원심분리기Fisher Scientific
VortexFisher Scientific50-728-002
수조 초음파 발생기Fisher Scientific15-336-120
나트륨 형

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
  2. Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Clim....

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