암 진행에서 세포/기질 상호 작용의 중요성을 조사하는 데 사용할 수 있는 3D 세포 배양 환경을 만드는 방법을 제시합니다. 간단한 자가 조립 옥타펩타이드를 사용하여 캡슐화된 세포를 둘러싼 매트릭스를 제어하고 기계적 및 생화학적 신호를 독립적으로 조절할 수 있습니다.
이 논문에서
요약
초록
3D에서 성장한 세포가 2D에서 성장한 세포보다 생체 내 행동을 더 잘 모델링한다는 인식이 높아지고 있습니다. 이 프로토콜에서는 세포와 조직을 본래 환경과 일치하는 환경에서 배양하는 데 적합한 간단하고 조정 가능한 3D 하이드로겔에 대해 설명합니다. 이는 세포와 국소 세포외 기질 간의 상호 작용이 모델의 기본 부분인 암의 시작, 성장 및 치료를 연구하는 연구자들에게 특히 중요합니다. 3D 배양으로의 전환은 어려울 수 있으며, 동물 유래 3D 배양 매트릭스의 높은 배치 간 변동으로 인해 재현성 부족과 관련이 있는 경우가 많습니다. 마찬가지로, 취급 문제는 합성 하이드로겔의 유용성을 제한할 수 있습니다. 이러한 요구에 부응하여 당사는 간단한 자가 조립 펩타이드 겔을 최적화하여 암 및 질병의 관련 세포주 모델뿐만 아니라 환자 유래 조직/세포의 배양을 가능하게 했습니다. 겔 자체는 캡슐화 중에 추가되거나 캡슐화된 세포에 의해 겔에 증착되는 성분을 제외하고는 매트릭스 성분이 없습니다. 하이드로겔의 기계적 특성은 매트릭스 첨가와 무관하게 변경될 수도 있습니다. 따라서 이는 연구자가 관심 대상 조직을 반영하는 3D 배양 환경을 구축하고 기계적 힘 및/또는 세포 행동의 생화학적 제어의 영향을 독립적으로 해부할 수 있도록 하는 '백지 상태' 역할을 합니다.
서론
암 발병과 진행에 있어 세포외 환경이 하는 많은 역할은 점점 더 명확해지고 있다1. 최근에는 상세한 단백질체학 기반 분석이 이미 설득력 있는 문헌 기반에 추가되어 암 관련 기질 세포 또는 암세포 자체에서 유래한 기질 성분이 상피 중간엽 전이 및 전이성 확산 촉진과 같은 사건의 핵심 요인임을 입증했습니다 2,3,4. 이처럼 세포외 기질(ECM)의 중요성이 인식됨에 따라 세포에 제공되는 3D 환경을 제어할 수 있는 세포 배양 플랫폼으로 전환하는 것이 중요해지고 있습니다. 이러한 요구에 부응하기 위해 이 프로토콜은 사용자 정의 ECM 조성 및 기계적 특성을 갖춘 3D 하이드로겔에서 세포 캡슐화 및 배양 방법을 제시합니다5.
현재 2D 체외 배양에서의 암 치료 효능, 현재 생체 내(환자 유래 이종이식, PDX) 모델에서 이러한 치료제의 영향 및 임상 시험에서의 최종 활성 사이에는 상관관계가 낮습니다 6,7. 이로 인해 신약 개발 파이프라인에 심각한 실패가 발생했으며, 테스트된 치료제가 '조기에 실패하고 저렴하게 실패'할 수 있도록 하는 개선된 체외 모델에 대한 시급한 필요성이 대두되었습니다. 많은 연구자들은 마우스 비만세포종 유래 제품(예: Matrigel 또는 유사 제품)을 사용하여 PDX 유래 세포 및 기타 환자와 가까운 세포를 포함하여 체외에서 성장하고 세포 거동을 관찰할 수 있는 3D 매트릭스가 풍부한 환경을 만듭니다 8,9,10. 그러나 이러한 '모든 상황에 맞는' 접근법은 암 발병 및 진행에서 기질 단백질/글라이칸이 수행하는 복잡한 역할을 간과합니다.
세포 거동 조절에서 세포외 기질(ECM)의 역할에 대한 인식은 또한 특정 기질 성분으로 구성된 하이드로겔 내부 또는 상에서 3D 배양의 사용을 장려했습니다11. 이것은 특정 상호 작용을 조사하는 데 유용하지만 이러한 시스템은 세포와 기질 간에 기계적 및 생화학적 명령을 분리할 수 없다는 단점이 있습니다. 또한 다루기 어려울 수 있으며 세포 행동에 대한 불분명한 판독값을 제공할 수 있습니다. 콜라겐 겔은 이러한 문제의 주요 예인데, 세포 매개 겔 수축은 겔 내의 세포를 시각화하는 능력을 크게 감소시킬 수 있기 때문입니다5. 또한 전문가들이 12,13,14 큰 효과를 발휘하기 위해 사용한 매우 우아한 다중 구성 요소 겔 시스템이 있습니다. 이들은 효소에 민감한 링커와 생체 활성 모티프를 통합할 수 있지만 여기에 설명된 시스템보다 제형 및 적용이 훨씬 더 복잡합니다.
이 프로토콜은 완전히 정의된 3D 배양 모델을 생성하는 방법을 설명하여 개발 및 질병에서 ECM의 역할을 in vitro로 모델링할 수 있도록 합니다. 3D 모델의 기본은 펩타이드 겔이며, 이는 이전에 간단한 자체 조립 옥타펩타이드 하이드로겔 5,15,16의 최적화로 설명했습니다. 이 시스템은 복잡한 동물 유래 매트릭스에서 벗어나 배치 간 일관성을 개선하고 취급을 개선하는 상당한 이점을 제공합니다. 단순한 상태에서 펩타이드는 매트릭스 유래 모티프를 포함하지 않으며 사용자가 기능을 구축할 수 있는 '빈 슬레이트'를 효과적으로 제공합니다.
우리는 펩타이드 겔의 기계적 특성이 매트릭스 단백질/글라이칸의 통합과 함께 독립적으로 조절될 수 있는 방법을 보여줍니다. 이 시스템은 튜닝 가능성이 높아 다양한 형식의 다양한 셀 유형을 캡슐화할 수 있습니다. 암 모델을 구축하는 데 중요한 것은 기질 세포를 직접 공동 배양에 통합하거나 분리하여 간접 암 세포-기질 상호 작용에 대한 특정 분석을 수행할 수도 있다는 것입니다. 가장 결정적으로, 여기에 설명된 프로토콜은 화학에 대한 복잡한 지식이 필요하지 않으며 전문 화학 지식이나 장비 없이도 모든 세포 배양 실험실에서 재현할 수 있습니다.
당사는 이미징, 유변학적 분석, PCR5 를 위한 물질 추출 및 조직학적 평가를 위한 포매링을 포함하여 펩타이드 겔의 세포 거동 연구를 위한 방법을 최적화했습니다. 단순 하이드로겔 시스템의 분명한 이점은 캡슐화된 세포에 의해 증착된 매트릭스를 시각화하고 연구할 수 있다는 것입니다. 세포 유래 매트릭스의 중요성과 세포가 국소 미세환경을 재설계하는 방법에 대한 더 나은 이해의 이점이 최근 강조되었으며17 이는 생체 내에서 발생하는 것과 유사한 방식으로 세포 분비 매트릭스 구성 요소를 포획하는 것의 중요성에 대한 인식이 높아지고 있음을 반영합니다. 이러한 프로세스를 모델링할 수 있는 능력을 활용하는 것은 하이드로겔 기반 질병 모델의 환자 관련성 향상의 근본적인 동인 중 하나가 될 수 있습니다.
프로토콜
1. 펩티드의 용해
- 조직 배양 후드에서 P1000 피펫을 사용하여 15mL 튜브에 800μL의 멸균수를 추가합니다.
- 미세 저울을 사용하여 펩타이드 분말을 비정적 계량 보트에 담습니다. 원하는 최종 펩타이드 겔 농도의 1.25배(mg/mL, 표 1)의 질량(mg)을 사용합니다.
참고: 여기에 설명된 방법은 최종 겔화 지점에서 튜브당 약 1.25mL의 펩타이드 겔 부피를 생성합니다. 한 번에 여러 개의 튜브를 준비할 수 있으며, 또는 사용자가 제시된 방법에 익숙할 때 튜브당 부피를 증가시킬 수 있습니다.
| 펩타이드 농도 (최종 겔화 후) | 펩타이드의 질량 | 초기 NaOH 첨가 |
| 6 밀리그램 / mL | 7.5의 mg의 | 30 μL |
| 10 mg/mL | 12.5의 mg의 | 60 μL |
| 15 mg/mL | 18.75의 mg의 | 100 마이크로L |
표 1: 펩타이드 질량 및 일반적인 최종 겔 농도에 대한 권장 초기 NaOH 첨가. 나열된 펩타이드 농도의 범위는 어느 방향으로든 확장될 수 있지만, 낮은 펩타이드 농도는 안정적인 겔을 형성하지 못할 가능성이 더 높지만, 고농도에서는 생성된 겔이 너무 조밀하여 충분한 영양소 교환 및 세포 생존력을 허용할 수 없습니다. 적절한 농도를 위해서는 다양한 세포 유형과 펩타이드 배치에 대한 최적화가 필요합니다.
- 칭량된 펩타이드를 15mL 튜브에 추가합니다. 계량 보트를 튕겨 분말이 남지 않도록 합니다.
참고: 펩타이드 분말은 매우 정적일 수 있으므로 분말의 손실을 최소화하도록 주의하십시오. 공정 후반부에 80°C에서 배양하는 동안 멸균이 발생하므로 1.2단계 및 1.3단계(또는 pH 측정) 동안 멸균 상태를 유지할 필요가 없습니다. - 3분 동안 볼텍스, 3분 동안 200 x g 에서 원심분리합니다.
- 펩타이드 용액을 80°C로 설정된 오븐에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 용해되지 않은 펩타이드가 존재하는 경우 1.4단계를 반복합니다.
알림: 균일한 가열이 필수적이므로 히트 블록은 이 단계에 적합하지 않습니다. 그러나 우리는 혼성화 오븐이 펩타이드 용액이 완전히 잠겨 있는 한 수조와 마찬가지로 잘 작동한다는 것을 발견했습니다.
2. 겔 전구체의 형성
- 멸균수를 사용하여 멸균 0.5M 수산화나트륨(NaOH) 용액을 준비합니다.
알림: 가장 일관된 결과를 얻으려면 갓 희석된 NaOH 용액을 사용하는 것이 좋습니다. - 조직 배양 후드에서 용해된 펩타이드의 중심에 0.5M NaOH를 첨가하고 피펫 팁으로 천천히 교반하여 혼합합니다(표 1).
- 튜브를 10초 동안 소용돌이치고 200 x g 에서 10초 동안 원심분리하여 기포를 제거합니다.
- 겔 전구체가 흐리면 2.2단계와 2.3단계를 반복하여 NaOH를 5μL 증가시킵니다.
참고: pH 측정은 충분한 NaOH가 첨가되었는지 여부를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다: 최적의 pH는 9–10.5 사이이며 pH를 다시 낮추기 위해 산을 사용하여 겔 불균일성을 초래할 수 있으므로 이를 초과하지 않는 것이 좋습니다. 필요한 NaOH의 정확한 양은 펩타이드 공급원에 따라 다를 수 있습니다. - 겔 전구체가 광학적으로 투명하고 15mL 튜브의 반전 시 자립(또는 그냥 흐르기만 함)이 되면 조직 배양 후드에 100μL의 멸균 10x PBS를 추가합니다. 10초 동안 와류, 10초 동안 200 x g 에서 원심분리기.
참고: 겔 프리코이가 흐리면 투명하고 반고체가 될 때까지 2.4단계를 반복합니다. 겔 전구체가 액체(pH ~10.5 이상)인 경우 안정적인 겔을 형성하지 않으므로 폐기해야 합니다. - 80 °C의 오븐에서 밤새 배양합니다.
- 겔 전구체를 육안으로 확인하여 80°C에서 완전히 액체인지 확인합니다.
- 겔 전구체가 80°C에서 완전히 액체가 아닌 경우 충분히 중화되지 않은 것이므로 2.4단계에 따라 NaOH를 추가합니다.
- 겔 전구체가 액체이지만 기포나 작은 침전물이 있는 경우 튜브를 날카롭게 두드려 분산시킵니다. 튜브를 튕긴 후에도 기포나 침전물이 지속되면 겔 전구체와 원심분리기를 200 x g 에서 각각 10초 동안 와류시킵니다.
- 2.7.1 또는 2.7.2 단계 중 하나를 수행한 후 최종 겔화를 진행하기 전에 80°C에서 2시간 동안 전구체 겔을 추가로 배양합니다.
- 겔 전구체는 필요할 때까지 80°C(최대 48시간)로 유지합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있으며 최대 4주 동안 4°C에서 겔 전구체를 보관할 수 있습니다. 이 일시 중지 지점에서 다시 시작하는 경우 80°C에서 최소 2시간 동안 겔 전구체를 배양하고 2.7단계부터 다시 시작합니다. 필요한 경우 위의 변형을 위한 충분한 시간이 있는지 확인하기 위해 최종 겔화에 필요하기 훨씬 전에 겔 전구체를 준비하는 것이 좋습니다.
3. 파종을 위한 매트릭스 성분의 준비
참고: 3-5단계에 대한 계산 예가 그림 1에 나와 있습니다. 3단계 및 4단계는 각각 무매트릭스 및/또는 무세포 겔을 생성하기 위해 생략될 수 있습니다.
- 파종에 필요한 세포, 매트릭스 및 배지의 총 결합 부피를 계산하여 각 1mL 전구체 겔에 250μL를 추가할 수 있습니다. 이 부피에 1.1을 곱하여 피펫팅 오류를 허용합니다. 이것이 파종 부피 VS입니다.
- 각 매트릭스 성분에 대해 방정식 1을 사용하여 시딩 부피에 추가할 저장 용액의 부피를 계산합니다.
(1)
주: VS는 모든 젤 씨를 뿌리는 데 필요한 씨씨 뿌리는 매체의 총 양에 대응합니다 (단계 3.1). 모든 매트릭스 구성 요소 부피의 합이 VS를 초과하지 않는지 확인합니다. - 모든 매트릭스 구성 요소를 철저히 해동하고(제조업체의 지침 참조) 필요할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
참고: 일부 매트릭스 구성 요소는 겔화되기 쉽습니다. 이러한 일이 발생하지 않도록 제조업체의 지침을 참조하십시오. - 중화가 필요한 산성 콜라겐 스톡 용액을 추가해야 하는 경우(제조업체의 지침 참조) 다음과 같이 중화 용액을 준비하십시오.
- 방정식 1을 사용하여 필요한 콜라겐 스톡 용액 V-C의 부피를 계산합니다.
- 중화 용액에 적합한 부피 VN을 결정합니다. 이는 모든 매트릭스 첨가의 결합 부피가 시딩 부피 VS를 초과하지 않도록 선택해야 합니다.
참고: 일반적으로 VN= 2 x Vc에 대한 합리적인 값이지만 이는 추가되는 다른 매트릭스 구성 요소의 수와 부피에 따라 조정될 수 있습니다. - 방정식 2를 사용하여 중화에 필요한 1M NaOH의 부피를 계산합니다.
(2) - 수식 3을 사용하여 중화 용액에 필요한 10x PBS의 부피를 계산합니다.
(3) - 계산 된 1M NaOH와 10x PBS의 부피를 결합 한 다음 멸균수로 VN까지 구성합니다. 잘 섞어 필요할 때까지 얼음에 보관하십시오.
참고: 이 시점에서 산성 콜라겐을 추가하지 마십시오. 콜라겐과 중화 용액의 조기 혼합은 콜라겐 섬유형성의 시작으로 이어질 수 있으며, 이는 최종 펩타이드 겔의 특성에 불일치를 유발할 수 있습니다.
4. 파종을 위한 세포의 준비
- 아직 완료되지 않은 경우 3.1단계에 따라 파종 부피 VS 를 계산합니다.
- 최종 펩타이드 겔에서 원하는 세포 밀도를 취하고 5를 곱하여 이 세포 현탁액에 필요한 세포 밀도를 계산합니다.
참고: 세포 현탁액은 겔 전구체와 혼합할 때 희석을 설명하기 위해 원하는 말단 농도의 5배입니다. 세포 밀도는 고려 중인 각각의 새로운 세포주에 대해 최적화되어야 합니다. 세포 유형에 따라 최종 펩타이드 겔에서 1 x 104 및 1 x 106 cells/mL 사이의 밀도가 적절할 수 있습니다. - 시딩에 필요한 총 세포 수를 계산합니다(세포 밀도에 4.1단계에서 계산된 시딩 부피 VS 를 곱합니다).
- 사용 중인 세포에 대한 표준 배양/계대 방법을 사용하여 4.3단계에서 계산한 대로 필요한 양의 세포를 포함하는 세포 펠렛을 준비합니다.
5. 최종 겔화/세포 캡슐화
- 최종 겔화를 시작할 준비가 되면 겔 전구체를 80°C 오븐에서 37°C 수조로 옮깁니다.
참고: 겔 전구체는 37°C에서 자립해야 합니다. 액체인 경우 완전한 겔화가 발생할 가능성은 낮으므로 겔 전구체는 폐기해야 합니다. - 96웰 플레이트 또는 세포 배양 인서트가 있는 24웰 플레이트(또는 이와 유사한 플레이트)를 준비합니다.
참고: 24개의 웰 인서트에서 펩타이드 겔을 도금할 때 인서트 바닥과 웰 플레이트 사이에 틈이 있는지 확인하십시오. 이렇게 하면 젤이 매체와 접촉하게 됩니다. - 매트릭스를 추가해야 하는 경우 모든 매트릭스 구성 요소와 중화 용액을 결합합니다(3단계). 세포 배양 배지를 사용하여 VS(3.1단계)까지 만들고 철저히 혼합합니다. 세포를 추가하고자 하는 경우, 시딩 부피 VS를 사용하여 단계 4에서 제조한 세포 펠릿을 재현탁시킨다.
참고: 3단계에서 매트릭스 성분이 준비되지 않은 경우 시딩 부피에 세포 배양 배지를 사용합니다. 이는 일반적으로 사용 중인 세포 유형에 대한 표준 배양 배지이지만, 세포 유형의 혼합물을 사용하는 경우 검증이 필요할 수 있습니다. - P1000 피펫을 사용하여 겔 전구체 위에 250μL의 세포/매트릭스 혼합물을 부드럽게 추가합니다.
참고: 매트릭스 성분, 특히 기저막 추출물은 겔 전구체에 첨가되면 중합을 시작할 수 있습니다. 따라서 가능한 한 빨리 다음 단계로 이동하는 것이 중요합니다. - 피펫팅과 교반의 조합 동작으로 부드럽게 혼합합니다. 젤은 전단 얇아지므로 부드러운 피펫팅/교반으로 더 쉽게 혼합할 수 있습니다. 완전히 혼합되면 96웰 플레이트의 각 웰에 100μL를 첨가하거나 각 세포 배양 삽입물에 200μL를 추가합니다.
참고: 혼합 시 200μL로 설정된 P1000을 사용하여 역피펫팅하면 기포 유입을 방지할 수 있습니다. 겔은 처음에는 혼합하기 어려울 수 있지만 계속 혼합하면 더 쉬워져야 합니다 - 이는 혼합이 효율적임을 나타냅니다. - 37 ° C에서 10 % CO2 및 가습 된 분위기에서 5 분 동안 배양합니다.
참고: 이 단계는 펩타이드 겔에 매트릭스 첨가물이 포함되어 있지 않은 경우 필요하지 않습니다. - 96웰 플레이트의 각 웰에 200μL의 배지를 추가하거나 겔 상단에 몇 방울을 떨어뜨려 세포 배양 인서트 외부에 1mL를 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 및 가습 된 분위기에서 배양합니다.
- 다음 한 시간 내에 미디어를 두 번 변경하고 몇 시간 후(또는 다음 날) 다시 변경합니다.
알림: 젤이 몇 시간 동안 불안정할 수 있으므로 여기에서 주의하십시오. - 2-3일마다 배지를 교체합니다(또는 사용 중인 세포에 대한 표준 배양 프로토콜에 따름).
6. 간접 공동 문화
주: 이 방법은 펩티드 젤이 24의 웰 격판덮개 삽입물, 또는 젤이 세포 monolayer 의 위 지원될 수 있는 유사한 체재로 파종되는 경우에만 적용 가능합니다. 이 경우 웰 플레이트의 바닥에 세포의 2D 공급층을 준비하여 간접적인 공동 배양을 도입할 수 있습니다.
- 파종을 위해 24웰 플레이트를 준비합니다. 이것은 펩타이드 겔과 별도의 플레이트여야 하지만 사용된 인서트와의 호환성을 보장하기 위해 동일한 브랜드여야 합니다(5.2단계 참조).
- 고려 중인 세포 유형에 따라 간접 공동 배양을 파종하는 데 필요한 세포 밀도를 계산합니다.
참고: 세포 시딩 밀도는 고려 중인 각각의 새로운 세포주에 대해 최적화되어야 합니다. 세포는 약 30-50%의 합류점을 제공하도록 도금되어야 합니다. 예를 들어, 인간 유방 섬유아세포 세포주 HMFU19는 일반적으로 1-5 x 104 cells/well의 밀도로 도말됩니다. - 사용 중인 세포에 대한 표준 배양/계대 방법을 사용하여 이러한 세포에 대한 일반적인 성장 배지를 사용하여 1mL/웰에서 파종에 적합한 세포 현탁액을 준비합니다.
- 세포 현탁액을 웰 플레이트에 웰당 1mL씩 파종합니다.
- 37 ° C에서 5 % CO2 및 가습 된 분위기에서 몇 시간 또는 밤새 부착하십시오. 그런 다음 우물에서 매체를 제거합니다.
- 멸균 겸자를 사용하여 펩타이드 겔이 포함된 24개의 웰 플레이트 삽입물을 2D로 사전 파종된 세포가 포함된 새 웰로 옮깁니다. 인서트 외부에 매체 1mL를 적가하고 젤 표면에 몇 방울을 떨어뜨립니다.
참고: 일반적으로 이 시점에서 사용되는 배지는 겔에 캡슐화된 세포에 적합한 배지이지만 2D 세포에 대한 이 배지의 적합성은 고려 중인 특정 실험에 대한 검증 또는 최적화가 필요할 수 있습니다. - 과도한 합류를 방지하기 위해 정기적으로 새로운 피더 층을 준비하고 위와 동일한 방법에 따라 펩타이드 겔을 이러한 새로운 웰로 옮깁니다.
참고: 일반적으로 간접 공동 배양을 위한 세포는 펩타이드 겔 파종과 동시에 준비됩니다. 그런 다음 펩타이드 겔은 몇 시간 또는 하룻밤 배양 후 배지 변경 시점에서 공동 배양으로 전환할 수 있습니다(5.8단계 참조).
7. 펩타이드 겔의 벌크 진동 유변학
참고: 표준으로, 유변학적 특성화는 겔 파종 후 24시간 후에 수행되며, 이는 24웰 플레이트 인서트에서 이루어져야 합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 레오미터를 설정하고 보정합니다. 세포 배양 삽입물의 직경에 최대한 가까운 플레이트 직경을 가진 평행 플레이트 형상을 사용합니다.
참고: 원하는 경우 37°C에서 테스트를 수행하여 배양 중 환경을 복제할 수 있습니다. - 세포 배양 삽입물에서 검사할 첫 번째 펩타이드 겔 샘플을 삽입물을 뒤집고 메스를 사용하여 플라스틱 멤브레인을 잘라냅니다.
참고: 테스트하기 전에 펩타이드 겔이 들어 있는 플레이트가 가능한 한 짧은 시간 동안 세포 배양 인큐베이터 외부에 있는지 확인하십시오. 중탄산염 완충 시스템이 있는 매체는 pH를 유지하기 위해 CO2 의 존재에 의존합니다. 인큐베이터 외부에 너무 오래 있던 젤은 pH에서 표류하여 유변학적 평가에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 효과를 방지하기 위해 배지에 10mM HEPES가 첨가된 겔을 유지하는 것이 도움이 될 수 있습니다. - 겔을 레오미터 플레이트에 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 메스를 사용하여 겔의 높이를 약 1mm로 잘라 레오미터 플레이트 아래에 로드할 때 겔 변형을 최소화합니다.
참고: 메스를 사용할 때 레오미터 플레이트를 만지거나 손상시키지 않도록 주의하십시오. - 평행 플레이트 간격을 1mm로 설정합니다. 레오미터 플레이트로 덮여 있지 않은 여분의 젤을 잘라냅니다.
- 제조업체의 지침에 따라 레오미터에서 원하는 테스트 설정을 실행합니다.
참고: 각각의 새로운 샘플 조건에 대해 0.1–100% 변형률에서 진폭 스윕을 실행하여 모든 테스트가 샘플의 선형 점탄성 영역 내의 변형률 수준에서 수행되도록 하는 것이 좋습니다.
8. 캡슐화된 세포의 살아있는/죽은 염색
- 웰에서 매체를 제거하고 매체 변경과 동일한 기술을 사용하여 1x PBS로 펩타이드 겔을 두 번 세척합니다(5.7단계).
- 7.2단계에 따라 24웰 플레이트 삽입체에서 배양된 펩타이드 겔을 제거합니다. 염색할 준비가 될 때까지 원래 웰 플레이트의 1x PBS에 있는 젤을 보관하십시오.
참고: 이 시점에서 젤은 특히 확장된 배양 후에 깨지기 쉬울 수 있으므로 주의하십시오. - 24웰 플레이트 삽입물당 500μL 또는 96웰 플레이트당 50μL의 염색을 허용하여 살아있는/죽은 염색 용액을 준비합니다. 일반적인 염색은 1x PBS의 4μM 에티듐 호모다이머와 2μM 칼세인 AM입니다. 결과 용액을 빛으로부터 보호하십시오.
참고: 살아있는/죽은 시약의 농도는 사용된 세포 유형과 시약 공급업체에 따라 추가 최적화가 필요할 수 있습니다. - 각 젤에서 PBS를 조심스럽게 제거하고 염색 용액 몇 방울로 교체하여 각 젤이 잘 덮여 있는지 확인합니다.
- 어두운 곳에서 염색 용액의 겔을 10-15분 동안 배양한 다음 공막/형광 현미경을 사용하여 시각화합니다.
참고: 더 높은 품질의 이미지를 위해 겔을 커버슬립 두께의 유리 바닥 접시로 옮기는 것이 도움이 될 수 있습니다.
9. 종말점 화상 진찰을 위한 담합 펩티드 젤
- 8.1단계에 따라 펩타이드 겔을 세척합니다.
- 1x PBS에 4% 파라포름알데히드(PFA)를 추가합니다: 96웰 플레이트의 각 웰에 대해 100μL, 24웰 플레이트 인서트에 있는 각 젤에 대해 1mL(인서트 내부의 젤 위에 몇 방울을 추가해야 함).
주의: 파라포름알데히드(PFA)는 독성이 강하여 피부를 통해 쉽게 흡수됩니다. 그것은 피부, 눈, 점막 및 상부 호흡기에 매우 파괴적입니다. PFA는 흄 후드에서 취급해야 하며 사용자는 보호복과 장갑을 착용해야 합니다. 대체 화학 정착제는 최종 용도에 따라 동일한 방식으로 사용될 수 있습니다. - 펩타이드 겔을 PFA 고정액으로 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
- PFA 고정제를 제거하고 1x PBS로 펩타이드 겔을 두 번 세척합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있으며, 고정 펩타이드 겔을 4°C에서 1x PBS에 최대 4주 동안 보관하고 플레이트가 파라핀 필름으로 잘 밀봉되었는지 확인할 수 있습니다.
10. 단면화를 위한 끼워넣는 펩티드 젤
참고: 4% 한천에 펩타이드 겔을 삽입하는 것은 면역조직화학을 위한 파라핀 삽입에 앞서 중요한 단계입니다. 대안적으로, 겔을 2% 한천에 매립하고 비브라톰을 사용하여 절편화할 수 있습니다(일반적으로 500μm 절편은 좋은 결과를 제공함). 이는 섹션 11의 방법을 사용하여 겔에서 세포외 기질 국소화를 염색하는 데 도움이 될 수 있는 수화된 겔 절편을 생산하는 선택적 단계입니다.
- 전자 레인지에서 끓여서 2x PBS (위 참고 사항 참조)에 용융 된 2 % 또는 4 % 한천 용액을 준비합니다. 사용하기 전에 몇 분 동안 식히십시오.
알림: 용융된 한천은 열 위험이 있으므로 손과 얼굴 보호구를 사용하여 조심스럽게 다루십시오. 준비가 완료되면 한천 용액은 필요할 때까지 4 °C에서 보관할 수 있습니다. - 7.2단계에 따라 세포 배양 삽입물에서 펩타이드 겔을 제거합니다.
- 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직학 포매 금형의 바닥을 한천 용액의 얇은 층으로 덮습니다. 20°C에서 몇 초 동안 식히십시오.
- 주걱을 사용하여 펩타이드 젤을 한천 중앙에 놓습니다. 그런 다음 한천에 펩타이드 젤을 완전히 덮습니다.
알림: 젤이 한천에 가라앉지 않아야 합니다. 그렇다면 젤을 제거하고 한천이 더 응고될 때까지 몇 초 더 기다렸다가 다시 시도하십시오. 너무 많은 응고가 일어나지 않도록 하거나 두 레이어 사이에 약한 결합이 있게 됩니다. - 조직학적 틀에서 제거하기 전에 내장된 젤을 4°C에서 1시간 동안 냉각시킵니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있으며, 최대 4주 동안 1x PBS에서 4°C의 임베디드 젤을 보관할 수 있습니다. - 면역조직화학을 수행해야 하는 경우, 내장된 겔을 조직 프로세서에 넣고 표준 실험실 방법을 사용하여 진행합니다.
참고: 또는 포함된 젤을 비브라톰을 사용하여 수화된 부분으로 절단할 수 있습니다. 수화된 섹션은 최대 4주 동안 1x PBS에서 4°C의 밀봉된 플레이트에 보관해야 합니다.
11. 면역세포화학을 이용한 겔의 세포 염색
- 펩타이드 겔/겔 섹션을 덮고 있는 1x PBS를 제거합니다. 7.2단계에 따라 24웰 플레이트 삽입물에 남아 있는 겔을 제거합니다.
- 겔/겔 절편을 차단 완충액으로 덮고 20°C에서 30분 동안 배양합니다.
참고: 일반적인 블로킹 버퍼는 1x PBS의 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)과 0.1% Triton X-100으로 구성됩니다. Triton X-100은 독성이 있으며 심각한 눈 손상, 피부 자극을 일으키며 수생 생물에 매우 독성이 있습니다. 사용자는 보호복, 보안경 및 장갑을 착용해야 합니다. - 최적화된 작업 농도에서 차단 버퍼에 1차 항체를 준비합니다. 24웰 플레이트 겔당 200μL, 겔 섹션당 100μL, 96웰 플레이트 웰당 50μL를 허용합니다.
참고: 일반적으로 겔의 3D 염색에 사용되는 항체 농도는 2D에서 사용되는 농도의 두 배여야 합니다. - 막는 완충액을 제거하고 항체 해결책을 젤에 적방울로 추가하십시오.
- 파라핀 필름으로 플레이트를 밀봉하고 4 °C에서 밤새 배양합니다.
- 항체 용액을 제거하고 차단 버퍼로 두 번 세척합니다.
- 11.3단계 및 11.4단계에 설명된 것과 동일한 절차에 따라 2차 항체를 추가합니다.
- 4 °C에서 밤새 어둠 속에서 배양하거나 20 °C에서 3 시간 동안 배양하십시오.
- 항체 용액을 제거하고 1x PBS로 두 번 세척합니다.
- 1:1,000 DAPI 용액에 시료를 담고 4°C의 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다.
- 겔을 유리 커버슬립으로 옮기고 형광등/컨포칼 현미경으로 이미지를 만듭니다.
12. RNA 적출
참고: 이 방법에 사용된 부피는 펩타이드 겔이 24웰 플레이트 인서트에 파종되는 곳에 적용할 수 있습니다. 다른 겔 형식을 사용할 수 있으며 그에 따라 부피를 조정할 수 있습니다.
- 웰에서 매체를 제거하고 매체 변경과 동일한 기술을 사용하여 1x PBS로 펩타이드 겔을 두 번 세척합니다(5.7단계).
- 7.2단계에 따라 24웰 플레이트 삽입체에서 배양된 펩타이드 겔을 제거합니다. 각 겔을 별도의 15mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
참고: 이 시점에서 젤은 특히 확장된 배양 후에 깨지기 쉬울 수 있으므로 주의하십시오. - P1000을 사용하여 각 튜브와 피펫에 500μL Trypsin-EDTA(0.25%)를 위아래로 추가하여 혼합하고 겔을 파괴합니다.
- 37°C에서 3-5분 동안 Trypsin-EDTA에서 겔을 배양합니다.
참고: 배양 시간은 사용된 세포 유형에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다. - 1x PBS 5mL를 첨가하여 트립신-EDTA를 희석합니다.
- 200 x g 에서 5분 동안 펠릿 세포에 원심분리기를 주입합니다.
- 상층액을 제거합니다.
알림: 세포 펠릿과 상등액 사이에 겔 층이 형성되었을 수 있으므로 주의하십시오. - 제조업체의 지침에 따라 세포 펠릿을 용해 완충액에 재현탁하고 RNA 추출을 위한 표준 프로토콜에 따라 진행합니다.
결과
여기에 설명된 펩타이드 겔 제조 방법을 통해 사용자는 맞춤형 3D 배양 환경을 정의하고 생성할 수 있습니다. 기계적 환경은 주로 펩타이드 농도에 의해 결정되지만, 그림 1의 계산 예에서 볼 수 있듯이 관심 매트릭스 성분이 제어된 밀도로 추가될 수도 있습니다. 그러나 가장 단순한 형태의 펩타이드 겔 프로토콜은 매트릭스가 없는 3D 환경에서 세포를 캡슐화하는 방법을 제공합니다. 그림 2 는 이 접근법이 형광 표지된 암 세포주(그림 2A) 및 환자 유래 이종이식(PDX) 물질(그림 2B,C)을 포함한 광범위한 암 모델과 어떻게 결합될 수 있는지 보여줍니다. 중요한 것은 세포주와 PDX 물질이 모두 무혈청 조건(그림 2C, D)에서 겔 내에서 배양될 수 있어 완전히 정의된 조성을 가진 3D 배양 시스템을 제공할 수 있다는 것입니다.
펩타이드 자체에는 세포 결합 모티프가 포함되어 있지 않기 때문에 캡슐화된 세포는 일반적으로 변형되지 않은 펩타이드 겔에서 둥근 형태를 나타냅니다. 그림 3A 는 순수 Matrigel 및 순수 콜라겐 겔에서 볼 수 있는 고전적인 길쭉한 형태와 비교하여 6mg/mL 펩타이드 겔의 인간 유방 섬유아세포에 대한 이를 보여줍니다. 그러나 중요한 것은 펩타이드 겔 프로토콜이 관심 매트릭스 구성 요소를 통합할 수 있다는 것입니다. 그림 3A 는 200μg/mL 콜라겐 I을 첨가하여 펩타이드 겔에서 긴 섬유아세포 형태를 회복할 수 있는 방법을 보여줍니다.
매트릭스 추가는 또한 그림 3B와 같이 MCF10A와 같은 다른 세포 유형의 성장 및 조직을 지원할 수 있습니다. 이 경우 6mg/mL 펩타이드 겔에 100μg/mL 콜라겐 I을 추가하면 7일째까지 아시나르 구조가 형성될 수 있습니다. 추가적인 복잡성은 또한 간접 공동 배양에서 지지 세포층의 통합에 의해 도입될 수 있습니다. 그림 3C 는 기질 통합 및 인간 유방 섬유아세포와의 간접 공동 배양의 결합된 접근 방식이 MCF10A의 성장과 조직을 향상시킬 수 있는 방법을 보여줍니다.
또 다른 중요한 매개변수는 펩타이드 겔 제조에 사용되는 펩타이드의 농도입니다. 그림 4A 는 펩타이드 농도(이 경우 4 - 10 mg/mL)를 제어하면 100 - 1000 Pa 범위의 강성이 어떻게 발생하는지에 대한 예를 보여줍니다. 이러한 겔은 매트릭스 없이 제작되거나 매트릭스 첨가로 생성되어 강성과 조성을 동시에 제어할 수 있습니다. 매트릭스 첨가물이 있는 펩타이드 겔은 이러한 첨가물의 분포를 시각화할 수 있도록 절단하고 염색할 수 있습니다. 그림 4B, C 는 이를 수행하기 위한 두 가지 방법을 보여줍니다: 면역조직화학을 위한 표준 조직 처리 및 파라핀 포매링(그림 4B) 또는 2% 아가르에 포매한 후 비브라톰 절편 및 형광 염색(그림 4C)을 수행합니다.
펩타이드 겔의 조성을 수정할 때 이러한 변화가 처음에 세포에 제시된 기계적 환경에 영향을 미치지 않도록 하는 것이 중요합니다. 그림 4D 는 펩타이드 농도에 대한 변형을 사용하여 매트릭스 혼입 시 펩타이드 겔 강성에 대한 변화를 상쇄하는 방법을 보여줍니다. 그런 다음 겔 강성(저장 탄성률, G')의 벌크 진동 유변학 측정을 통해 겔 조성과 강성이 세포 형태에 미치는 영향을 구별할 수 있습니다. 명시야 이미지에서 볼 수 있듯이 MDA MB 231 세포는 10mg/mL 또는 15mg/mL 펩타이드 겔에 콜라겐 첨가에 대해 길쭉한 형태를 발달시킵니다. 그림 4E 는 이러한 길쭉한 세포가 pFAK에 대해 양성으로 염색됨을 보여주며, 이는 주변 기질과의 상호 작용을 나타냅니다. 펩타이드 겔의 초기에 매트릭스가 없는 환경은 또한 세포 합성 및 관심 매트릭스 구성 요소의 증착을 연구하기 위한 이상적인 플랫폼이 됩니다. 그림 4F 는 10mg/mL 펩타이드 겔에 캡슐화된 MCF7 세포에 의한 콜라겐 I의 국소 침착을 보여줍니다.
펩타이드 겔의 주요 장점 중 하나는 표준 실험실 방법을 분석에 쉽게 적용할 수 있다는 것입니다. qRT-PCR을 위한 물질을 추출하여 유전자 발현 프로파일을 결정할 수 있습니다(최근 간행물5 참조). 또한 명시야 현미경을 통한 이미징을 통해 세포 성장을 실시간으로 시각화할 수 있습니다. 그림 5 는 실패한 펩티드 젤에서 부닥칠 수 있는 몇몇의 전형적인 문제 해결 문제점을 보여줍니다: 젤 전구체의 불완전한 섞기 (숫자 5A, B); 펩타이드 농도(그림 5C,D) 또는 파스팅 밀도(그림 5E,F)의 잘못된 최적화; 그리고 펩티드 젤에 있는 혼입 전에 산성 교원질의 부정확한 중화는 (그림 5G, H). 특히 펩타이드 농도 및 시딩 밀도는 각 세포주와 펩타이드 소스에 맞게 최적화하여 배양 환경이 적절하게 정의되고 관심 응용 분야를 대표하도록 해야 합니다.
그림 1: 행렬 구성 및 시딩 밀도에 대한 계산 예시. 이 예시 워크플로우는 1 x 105 cells/mL의 최종 세포 밀도에서 100μg/mL 콜라겐이 첨가된 두 개의 펩타이드 겔 전구체를 시딩하기 위해 따라야 하는 절차를 설명합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 무매트릭스 펩타이드 겔은 세포주 및 환자 유래 암 모델에 적합한 3D 배양 플랫폼을 제공합니다. (A) 형광 마커 mCherry 및 tdTomato를 각각 구성적으로 발현하는 HCT116 결장직장암 및 MCF7 유방암 세포주는 9일째까지 6mg/mL 겔에서 세포 클러스터를 형성하고(왼쪽), 형광 현미경을 사용하여 실시간으로 이미지화할 수 있습니다(오른쪽, 스케일 바 50μm). (B) 삼중 음성 유방암 환자(BR8)의 환자 유래 이종이식(PDX) 세포는 10mg/mL 펩타이드 겔에서 7일째까지 세포 클러스터를 형성합니다. (C) 에스트로겐 수용체 양성 유방 종양(BB3RC31)의 PDX 세포는 혈청이없는 조건에서 성장할 수 있으며, 비교를 위해 일치하는 통로에서 기저막 기질(예: Matrigel) 대조군으로 표시되며; (D) MCF7 유방암 세포는 7일째에 LIVE/DEAD 세포 분석을 사용하여 평가한 바와 같이 매트릭스가 없고 혈청이 없는 조건에서 6mg/mL 펩타이드 겔에서 생존할 수 있습니다. KSR = 녹아웃 혈청 대체, MS 배지 = 유방권 배지19. 지정되지 않는 한 100μm의 눈금 막대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 펩타이드 겔 복잡성은 매트릭스 첨가 및 공동 배양의 도입으로 증가할 수 있습니다. (A) 인간 유방 섬유아세포 세포주 HMFU19는 순수 기저막 매트릭스(예: Matrigel) 및 비교를 위해 1.5mg/mL 쥐꼬리 콜라겐 I 젤로 표시된 6mg/mL 펩타이드 겔에서 길쭉한 형태를 복원하기 위해 콜라겐 첨가가 필요합니다. (B) MCF10A 정상 유방 세포는 100μg/mL 인간 콜라겐 I, 스케일 바 100μm를 첨가하여 6mg/mL 펩타이드 겔에서 7일째까지 아시나르 구조를 형성합니다. (C) 간접 공동 배양에서 매트릭스 성분인 피브로넥틴/HA(히알루론산, 분자량 804kDa) 및 HMFU19를 함께 첨가하면 절단된 카스파제 3 염색, 스케일 바 50μm로 평가한 바와 같이 10mg/mL 펩타이드 겔에서 MCF10A 아시니의 크기와 조직이 증가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 펩타이드 겔을 사용하면 강성과 조성을 독립적으로 제어하고 세포 증착 매트릭스를 평가할 수 있습니다. (A) 펩타이드 농도 제어로 달성할 수 있는 일반적인 강성 범위(저장 탄성률, G')를 보여주는 벌크 유변학 측정, * 는 p < 0.05를 나타냅니다. (B) 캡슐화된 MCF7이 있는 10mg/mL 펩타이드 겔에서 150μg/mL 콜라겐 I의 염색을 보여주는 면역조직화학(7일차, 스케일 바 100μm); (C) 200 μg/mL 인간 콜라겐 I을 갖는 6 mg/mL 펩티드 겔에서 콜라겐 I 분포의 면역형광, 한천 포매 및 진동 절편, 스케일 바 25 μm; (D) 200μg/mL 콜라겐 I을 추가하면 10mg/mL 펩타이드 겔(벌크 진동 유변학)의 저장 탄성률 G'가 완만하게 감소하며, 펩타이드 농도를 15mg/mL로 증가시켜 상쇄됩니다. MDA MB 231 삼중 음성 유방암 세포는 각 조건(7일차, 눈금 막대 50μm)에서 표시됩니다. (E) 200 μg/mL 인간 콜라겐이 함유된 15 mg/mL 펩타이드 겔 내 MDA MB 231은 pFAK 염색을 통해 매트릭스와의 신장 및 상호 작용을 보여줍니다(14일, 스케일 바 50 μm). (F) 초기에 매트릭스가 없는 10mg/mL 펩타이드 겔(10일차, 스케일 바 100μm)에 MCF7 콜라겐 I을 증착하는 MCF7 콜라겐의 현장 염색. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 일반적인 펩타이드 겔 문제 해결 문제는 명시야 현미경을 사용하여 해결할 수 있습니다. 표시된 세포는 MCF10A 정상 유방 상피 세포이며, 명시되지 않는 한 7일째에 표시됩니다. (A) 올바르게 혼합된 겔 전구체는 불일치 없이 광학적으로 투명해야 하는 반면, (B) 불충분한 혼합/중화는 펩타이드 겔(흰색 화살표)에서 눈에 띄는 불균일성/줄무늬를 유발할 수 있습니다. (C) MCF10A는 HMFU19 간접 공동 배양을 첨가하면 6mg/mL 펩타이드 겔에서 아시나르 구조를 형성하지만, (D) 15mg/mL에서 펩타이드 농도가 너무 높아 아시나르 형성이 불가능합니다. (E) 100 μg/mL 콜라겐 I을 첨가하면 6 mg/mL 겔에서 5 x 105 cells/mL form acinar 구조를 형성한 MCF10A, 그러나 (F) 2 x 105 cells/mL 세포 밀도에서 acinar 형성이 너무 낮아 acinar 형성을 허용하지 않습니다. (G) 콜라겐 첨가는 14일째까지 큰 세포 클러스터를 생성할 수 있지만, (H) 잘못된 추가(과정에서 너무 일찍 콜라겐 중화)는 클러스터 성장을 방해할 수 있습니다. 눈금 막대 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
토론
우리는 여기에 설명된 펩타이드 겔이 여러 세포 유형의 3D 배양을 지원하는 간단하고 비용 효율적이며 유연한 솔루션이라는 것을 발견했습니다. 사용된 펩타이드의 농도와 단백질 또는 글리칸 첨가를 완벽하게 제어함으로써 이 방법을 사용하면 펩타이드 겔을 응용 분야에 맞게 신중하게 조정할 수 있습니다.
기존 방법에 비해 펩타이드 겔의 결정적인 장점은 복잡한 화학 절차가 필요하지 않은 간단한 방법을 사용하여 매트릭스 구성 및 기계적 특성을 독립적으로 제어할 수 있다는 것입니다. 펩티드 젤의 기계적 성질은 처음 젤 전구체에 있는 펩티드 농도에 의해 주로 결정됩니다. 이후에 세포 및/또는 매트릭스 성분을 추가하면 완전히 사용자 정의된 in vitro 환경을 만들 수 있습니다. 매트릭스 추가가 겔의 초기 기계적 특성을 변경할 수 있지만, 이는 펩타이드 농도5의 독립적인 변화에 의해 쉽게 상쇄될 수 있습니다. 이는 기존 시스템, 예를 들어 콜라겐 겔에 비해 명백한 이점을 제공하며, 강성을 제어하는 매개변수는 일반적으로 인테그린 결합 모티프의 변화를 초래합니다20,21.
우리는 암 세포주와 환자 유래 물질의 체외 배양을 위한 펩타이드 겔의 응용을 입증했습니다5. 펩티드 젤로 접근할 수 있는 뻣뻣함의 범위는(Pa의 100s에서 1000s의 범위에서) 유방과 같은 연조직에 있는 정상 및 종양 기질 환경을 복제하게 이상적으로 적응됩니다. 그러나 우리는 다른 응용 분야에는 골 재생을 위한 10-20kPa 범위와 같이 상당히 더 단단한 환경이 필요하다는 것을 알고 있습니다. 달성 가능한 강성을 이 범위로 확장하기 위해서는 여기에 제시된 프로토콜의 추가 수정이 필요하며, 이는 알기네이트 겔22와 같은 대체 접근법의 보다 일반적입니다. 유사하게, 여기에서 우리는 펩티드 젤 내의 기질 단백질/글리칸의 육체적인 포획에 의하여 functionalization를 위한 간단한 방법을 기술했습니다. 여기에 설명된 응용 프로그램의 경우 이 접근 방식이 잘 작동하며 질병의 3D 체외 모델을 사용하려는 비전문가 그룹이 사용하도록 쉽게 조정할 수 있습니다. 많은 다른 하이드로겔과 마찬가지로11, 여기에 사용된 펩티드는 세포-결합 또는 다른 생물학적 모티프를 포함하도록 확장될 수 있으며, 일부 응용에 대해서는 이 접근법이 바람직할 수 있다.
성공을 보장하기 위해 세심한 주의가 필요한 몇 가지 핵심 사항을 확인했습니다. 겔 전구체의 형성은 세포가 통합되기 전에 사용된 조건이 올바른지 사용자가 확인할 수 있는 중요한 중간 단계입니다. 이 전구체는 몇 주(4°C에서) 보관할 수 있지만 사용하기 전에 80°C에서 배양한 후 37°C에서 배양해야 합니다. 적합한 전구체는 80°C에서 완전히 액체이고 37°C에서 자립됩니다. 이러한 검사는 겔화가 올바르게 발생하는지 확인하는 데 필수적입니다. 그런 다음 세포 및/또는 매트릭스가 생리학적 조건 하에서 통합될 수 있습니다.
이미 3D 매트릭스를 사용하고 있는 실험실은 펩타이드 겔에서 세포를 캡슐화하는 데 필요한 신중한 취급에 익숙할 것입니다. 캡슐화 단계 전과 도중에 세포의 교반을 제한하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 우리는 특정 세포 유형이 이 과정에서 손상에 차별적으로 취약하다는 것을 발견했으며 이는 사용자가 신중하게 평가해야 합니다. 여기에서 기술된 펩티드 젤의 농도는, 언급된 세포를 위해, 세포가 주물의 바닥에 잘 가라앉기 전에 캡슐에 넣는 것을 허용하는 시간 구조에서 젤화가 진행되는 것을 허용한다 그러나 이 과정에 의해 손상되지 않는다 충분히 천천히 허용한다. 그러나 일부 민감한 세포 유형은 상승된 pH에 장기간 노출되는 것을 피하기 위해 더 빠른 중화가 필요할 수 있습니다. 이 경우, 펩타이드 겔을 둘러싼 배지에 10mM HEPES를 첨가하는 것이 도움이 될 수 있습니다.
이 프로토콜에 설명된 방법을 채택할 때 펩타이드 소스의 품질을 신중하게 고려하는 것이 매우 중요합니다. 여기서 펩타이드는 기능적 모티프 또는 코팅으로 사용되기보다는 하이드로겔의 불용성 부분 전체입니다. 따라서 펩타이드 구조의 모든 오염 물질 또는 변화는 최종 하이드로겔에서 세포 생존력을 지원하는 무결성 또는 용량에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 펩타이드의 새로운 배치로 이동할 때, 겔 전구체를 형성할 때 펩타이드의 거동을 확인하는 것뿐만 아니라 공급자로부터 우수한 배치 간 일관성이 있는지 확인하기 위해 주의를 기울여야 합니다.
요약하면, 이 프로토콜은 기계적 및 생물학적 특성의 독립적인 제어에 중점을 둔 3D 배양 시스템을 설명합니다. 이 방법의 단순성과 적응성은 모든 세포 배양 실험실에서 채택하기에 적합하며 광범위한 응용 분야에 적합합니다5. 향후 이 프로토콜은 펩타이드 염기서열의 공유 변형을 허용하도록 확장될 수 있습니다. 이는 고급 현미경 방법과 결합하여 세포가 주변 매트릭스에 가하는 인장력을 조사할 수 있습니다. 그러나 가장 중요한 것은 인위적으로 통합된 매트릭스와 캡슐화된 세포 자체에 의해 합성된 매트릭스를 구별할 수 있는 능력입니다. 시간 경과에 따른 기질 변화를 제어하고 모니터링하는 이러한 기능을 통해 암 및 기타 질병의 발병에서 세포-기질 상호 작용의 역할에 대한 전례 없는 통찰력을 얻을 수 있습니다.
공개 사항
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감사의 글
연구 NC/N0015831/1에서 JCA, GFR, GLRM, NC/T001267/1에서 RBC, CLRM, JCA, KL-S, KS, NC/T001259/1에서 JCA, KL-S 및 CLRM으로, NC/P002285/1에서 AMG, SJ 및 CLRM으로 NC//1의 자금 지원에 감사드립니다. 또한 Engineering and Physical Sciences Research Council EP/R035563/1에서 KL-S 및 CLRM으로, EP/N006615/1에서 JLT 및 CLRM으로 자금 지원을 제공합니다. 그림 1 은 Servier Medical Art의 그래픽을 사용하여 제작되었습니다. Servier의 Servier Medical Art는 Creative Commons Attribution 3.0 Unported License에 따라 라이선스가 부여됩니다.
재료
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| 유리 커버 슬립 | 모든 | No1 커버 슬립 0.13 - 0.17 mm 두께 | |
| 유리 바닥 접시 | MatTek | ||
| 염소 안티 토끼 IgG H & L (HRP 폴리머) | Abcam | ab214880 | |
| Haematoxylin 및 Eosin | 모든 | ||
| 조직학 금형 (일회용, 플라스틱) | 모든 | ||
| 이미지 분석 소프트웨어 | ImageJ | ||
| Live/Dead 분석 키트 | Invitrogen | L3224 | |
| 마이크로톰 | Any | ||
| Phalloidin | Life Technologies | F432/R415 | |
| 피어스 퍼록시다제 IHC 검출 키트 | ThermoFisher Scientific | 36000 | |
| 기본 Ab Caspase 3 | Abcam | ab34710 | 그림 3C |
| Primary Ab Collagen I | 세포 신호 기술 | 9661 | 그림 그림 4B, C, F |
| Primary Ab pFAK Tyr 397 | ThermoFisher Scientific | 그림 4E | 44-624G |
| ; | S36939 | ||
| Rheometer Physica MCR 301 | Anton Paar | ||
| Scalpel | Any | ||
| Secondary Antibody Goat anti Rabbit AF488 | nvitrogen | a11034 | |
| 2차 항체 염소 안티 래빗 AF546 | 인비트로겐 | a11010 | |
| SuperFrost 슬라이드 | ThermoFisher Scientific | 코팅(예: APES)은 슬라이드의 마이크로톰 단면을 유지하는 데 도움이 될 수 있습니다. | |
| 트리톤 X 100 | 시그마-알드리치 | X100 | |
| 트립신-EDTA (0.25%) | Gibco | ||
| Vibratome | Leica |
참고문헌
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