이 프로토콜은 인간 유방 세포의 변환을 평가하기 위해 실험적인 체외 도구를 제공합니다. 지하 막 매트릭스를 가진 3D 배양에서 세포 증식율, 앵커리지 독립적인 성장 능력 및 세포 혈통의 분포를 후속하는 상세한 단계가 설명되어 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
종양 발생은 세포가 적대적인 조건하에서 그들의 성장, 생존 및 보급을 허용하는 기능을 취득하는 다단계 프로세스입니다. 다른 시험은 암 세포의 이 특징을 확인하고 정량화하기 위하여 노력합니다; 그러나, 그들은 종종 세포 변환의 단일 측면에 초점을 맞추고, 사실, 여러 테스트는 그들의 적절 한 특성에 대 한 필요. 이 작업의 목적은 연구원에게 광범위한 관점에서 체외의 세포 변환을 평가하는 도구 세트를 제공하여 건전한 결론을 도출 할 수 있도록하는 것입니다.
지속적인 증식 신호 활성화는 종양 조직의 주요 특징이며 시간이 지남에 따라 달성 된 인구 두 배수를 계산하여 체외 조건에서 쉽게 모니터링 할 수 있습니다. 게다가, 3D 배양에 있는 세포의 성장은 생체 내에서 일어나는 무슨을 닮은 주변 세포와의 상호 작용을 허용합니다. 이것은 세포 집계의 평가를 가능하게 하고, 특유한 세포 마커의 면역 형광 표시와 더불어, 종양 변환의 또 다른 관련 특징에 대한 정보를 얻기 위하여: 적당한 조직의 손실. 변형 된 세포의 또 다른 놀라운 특성은 앵커리지 분석으로 평가 할 수있는 다른 세포 및 세포 외 매트릭스에 부착하지 않고 성장하는 능력입니다.
세포 성장속도를 평가하고, 3D 배양에서 세포 계보 마커의 면역형광 라벨링을 수행하고, 연한 한천에서 앵커리지 독립적인 세포 성장을 테스트하는 상세한 실험 절차가 제공됩니다. 이러한 방법론은 유방암에 있는 그것의 관련성 때문에 유방 1 차상피 세포 (BPEC)를 위해 최적화됩니다; 그러나 일부 조정 후 다른 세포 유형에 절차를 적용할 수 있습니다.
서론
신생물 개발에는 여러 개의 연속이벤트가 필요합니다. 2011년 하나한과 웨인버그는 변형된 세포의 성장, 생존 및 보급을 가능하게 하는 10가지 기능을 설명했습니다: 소위 "암의 특징"1. 여기에 설명된 방법론은 종양 세포의 독특한 특징 중 일부에 집중하여 체외 세포 변환을 평가하는 세 가지 다른 도구를 컴파일합니다. 이러한 기술은 세포 증식율, 3D로 배양될 때 세포의 행동 및 앵커리지 독립성을 가진 식민지를 형성하는 능력을 평가합니다.
세포 모델은 시험관 내가설을 테스트하는 데 매우 중요합니다. 암2,3,4의연구를 위한 세포 변환의 실험 모델을 생성하기 위해 상이한 접근법이 개발되었다. 유방암은 전 세계 여성들 사이에서 가장 흔한 암이고 여자 중 암 죽음의 대략 15%를 책임지고 있기 때문에5,유방 상피 세포의 적당한 세포 모형을 제공하는 것은 추가 조사를 위해 가장 중요합니다. 이 문서에서는, 우리는 2007년에 Ince와 동료에 의해 처음에 기술된 유방 1 차상피 세포 (BpECs) 변환....
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프로토콜
다음과 같은 실험에 사용된 인간 샘플은 표준 절차 동의하에 클리니카 필라르 산트 조르디(바르셀로나)에서 수행된 감소 유방성형술로부터 수득되었다. 모든 절차는 달리 명시되지 않는 한 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛에서 수행됩니다.
1. 인간 유방 상피 세포 및 성장 곡선 플롯 축적의 체외 배양
-
유방 1 차상성 세포의 체외 배양 (BPECs): 세포 통과
참고: BPEC 파생 및 세포 배양의 경우 Ince 외, 20076에의해 기술된 지침을 따릅니다.- 중간 준비.
- P 또는 T 보충제와 보충 WIT 기초 정의 매체, 제조 업체에 의해 제공, 기본 또는 변형 된 BpEC 배양 여부에 따라.
- 변환된 BpEC에 대해 100 ng/mL또는 25 ng/mL의 최종 농도에 보충된 WIT 매체에 콜레라 독소를 추가합니다.
주의: 콜레라 독소는 삼키면 치명적입니다. 개인 보호 장비를 사용합니다. 환경에 대한 릴리스를 피하십시오.
- 세포 배양 유지 및 패시징.
참고: 다음 단계의 경우 T25 플라스크에서 세포가 증가하고 있음을 명심하십시오. 그럼에....
- 중간 준비.
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결과
BPECs에서 3개의 유전적 원소의 도입과 함께 세포 변환의 실험 모델은6,7(그림 3)의대표적인 결과를 생성하도록 선택되었다. 비변형 BPEC(N)는Ince 및동료에 의해 기술된 바와 같이 질병이 없는 유방 조직에서 유래되었다 6 여기에 표시된 프로토콜에 따라 배양되었다. STASIS를 극복한 후 (스트레스 또는 비정상적인 신호 유도-노화, 일반적으로 세포 배양 후 약 4 주 극복 되는 시험관 내의 유방 상피 세포에서 관찰 되는 현상), 세포는 연속적으로 렌티바이러스 입자 pRRL-CMV-IRES-EGFP 및 pRRL-CMV-TERT-변환-IFP를 획득 했다 D).바이러스 성 Ttag의 발현은 p53 및 망막 모세포종 기.......
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토론
이 논문에 설명된 실험 프로토콜은 체외 배양 세포의 온코겐 변환을 평가하는 유용한 도구를 제공합니다. 각 기술은 변환 프로세스의 특정 측면을 평가하므로 단일 분석에서 결론을 도출할 때 특별한 주의를 기울여야 합니다. 성장 곡선 빌드업은 다른 목적을 위해 세포를 배양할 때 이미 사용할 수 있는 정보를 요구하는 접근 방식입니다. 즉, 이 기술은 다른 세포 증식 에세이에 비해 저렴하고 쉽게 적용 할 수 있습니다. 그러나 유효한 결과를 얻으려면 하위 배양 될 때마다 셀을 계산하고 파종 할 때 특별한주의를 기울여야합니다. 증가된 성장속도는세포변환(1)을나타내지만, 항생제 및 항진균물질의 첨가/제거 또는 배양 조건의 변화(예를 들어, 온도,CO2)와같은 다른 외인성 인자가 세포 분열에도 영향을 미칠 수 있기 때문에 단독으로 사용해서는 안 된다. 또한 약물을 가진 세포의 트랜스퍼션 또는 치료가 다가오는 일 또는 몇 주 안에 그들의 성장 속도에 영향을 미치고 따라서 장기 증식 용량.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
AG 연구소는 스페인 원자력 안전 위원회의 지원을 받습니다. T.A.와 A.G.는 일반 타탈룬야 (2017-SGR-503)에 의해 인식 연구 그룹의 구성원입니다. MT는 과학 재단 아소시아시온 에스파냐라 콘트라 엘 콘트라 엘 칸서 [AECC-INVES1902TERR]에 의해 투자 계약을 보유하고 있습니다. G.F. 계약은 셀렉스 재단의 보조금으로 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91001 | |
| 1.5 ml Eppendorfs | Thermo Fisher Scientific | 3451 | Dark eppendorfs는 MTT 장기 보관에 선호 |
| . 10 μ l 필터 없는 피펫 팁 | Biologix | 20-0010 | |
| 100ml 유리병 | 캡 포함, 오토클레이브 | ||
| 가능 1000 μ l 피펫 팁 (필터 포함 | Labclinics | LAB1000ULFNL | |
| 1000 μ l 피펫 팁 (필터 없음 | Biologix | 20-1000 | |
| 15 ml 원추형 튜브 | VWR | 525-0400 | |
| 2 ml 혈청 피펫 | Labclinics | PLC91002 | |
| 200 μ l 필터가 있는 피펫 팁 | Labclinics | FTR200-96 | |
| 5ml 혈청학 피펫 | Labclinics | PLC91005 | |
| 50ml 원추형 튜브 | VWR | 525-0304 | |
| Acetone | PanReac AppliChem | 211007 | 면역형광 라벨링 |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | 앵커리지 분석에 사용 |
| Anti-Claudin 4 항체 | Abcam | 15104, RRID:AB_301650 | Working dilution 1:100, host: rabbit |
| Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] 항체 | Abcam | 9220, RRID:AB_307087 | Working dilution 1:100, host: mouse |
| Anti-mouse Cyanine Cy3 항체 | Jackson ImmunoResearch Inc. | 115-165-146, RRID:AB_2338690 | 작업 희석 1:500, 호스트: 염소 |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 항체 | Thermo Fisher Scientific | A-11034, RRID:AB_2576217 | 작업 희석 1:500, 호스트: 염소 |
| 오토클레이브 | |||
| BioVoxxel 도구 상자 | RRID:SCR_015825 | ||
| 세포 배양 24웰 플레이트 | 랩클리 | 닉 PLC30024 | Matrigel의 3D 배양에 사용됩니다. Flat Bottom |
| Cell Culture 6-well Plate | Labclinics | PLC30006 | 앵커리지 분석에 사용됨 |
| 세포 인큐베이터(37 º C 및 5 % CO2) | |||
| 셀 스트레이너 | Fisherbrand | 11587522 | 메쉬 크기 : 40 & m |
| CellSense 소프트웨어 | Olympus | 비 | |
| 브리오 콜레라의 | |||
| Class II 생물 안전 캐비닛 | Herasafe | HAEREUS HS12 | |
| 컨포칼 도립 현미경 | Leica | TCS SP5 | |
| 커버 안경 | Witeg Labortechnik GmbH | 4600122 22 X 22 mm, 두께 0.13 - 0.17 mm | |
| DAPI | 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine | ||
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1810 | 트립신 작용 피지 소프트웨어를 비활성화하는 데 사용 |
| (ImageJ) | National Institutes of Health | RRID:SCR_002285 | 무료 다운로드, 라이선스 필요 없음 |
| 유리 파스퇴르 피펫 | |||
| 유리 슬라이드 | Fisherbrand | 11844782 | |
| 염소 혈청 | Biowest | S2000 | 3D 구조의 면역 형광에 사용 |
| 내열 장갑 | 오토클레이브 히터 수조 후 한천 조작에 사용 | ||
| (37 º C) | 세포 계대배양 | ||
| 히터 수조 (42 º C) | 한천을 따뜻하게 유지하는 데 사용 | ||
| Matrigel 탈수에 사용되는 | 가열판 | ||
| 습한 챔버 | 면역 형광 중 항체 배양에 사용 | ||
| 얼음 | Matrigel 조작 중에 사용 | ||
| 아이스 박스 | |||
| 도립 광학 현미경 | Olympus | IX71 | |
| Matrigel Matrix | Becton Dickinson 354234 | -20 º의 매장; C 사용 중에는 차갑게 유지하십시오. 기저막 매트릭스라고 함 | |
| 메탄올 | PanReac AppliChem | 131091 | 면역형광 라벨링 이전에 3D 구조 고정에 사용됨 |
| 마이크로피펫 | p1000, p200 및 p10 | ||
| Microsoft Office Excel Microsoft | RRID:SCR_016137 | 개체군 배가를 계산하고 성장률 방정식 | |
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| 매니큐어 | 장착 후 시료 밀봉에 사용 | ||
| 양 중 항체 용액을 덮는 데 사용 | |||
| PBS pH 7.4 (칼슘 및 마그네슘 제외) | Gibco | 10010-056 | Sterile. 세포 계대배양 |
| PBS 정제 | Sigma-Aldrich | P4417 | milliQ 물에 희석합니다. 무균 상태가 필요하지 않습니다. 면역 |
| 피펫 에이드 | |||
| Primaria T25 플라스크에 | 코닝 | 353808 | BPEC 배양에 사용 |
| 셉터 자동 세포 계수기 | Millipore | PHCC20060 | 대안적으로, 혈구계 |
| 가위를 | 피펫 팁과 파라필름을 절단하는 데 사용 | ||
| 멸균 필터 0.22 μ m | Millipore | SLGP033RS | MTT 용액 |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | -20 º에서 저장; C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 3D 구조의 면역 형광에 사용 |
| Trypsin-EDTA 10X | Biowest | X0930 | PBS에서 희석하여 3X 용액 |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| WIT-P-NC 배양 배지 | Stemgent | 00-0051 | 1 차 BPEC 배양 |
| WIT-T에 사용 배양배지 | Stemgent | 00-0047 | 형질전환된 BPEC 배양에 사용 |
참고문헌
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Stampfer, M. R., Yaswen, P. Culture models of human mammary epithelial cell transformation. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 ....
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재인쇄 및 허가
