그람 양성 박테리아에서 RNA 염기서열분석과 결합된 MS2-선호도 정화

요약

MAPS 기술은 생체 내에서 특정 조절 RNA의 표적을 면밀히 조사하기 위해 개발되었습니다. 관심의 sRNA는 RNA 의 RNA 파트너의 공동 정화및 RNA 시퀀싱에 의한 그들의 식별을 가능하게 하는 MS2 aptamer로 태그됩니다. 이 수정 된 프로토콜은 특히 그램 양성 박테리아에 적합합니다.

초록

작은 규제 RNA (sRNA)는 삶의 세균 영역 중 널리 퍼져 있지만, 그들 중 많은 기능은 mRNA 목표를 식별하는 어려움으로 인해 특히 특성화되지 않은 상태로 남아 있습니다. 여기서, 우리는 생체 내특정 sRNA의 모든 RNA 파트너를 드러내는 것을 목표로 RNA 시퀀싱 (MAPS) 기술과 결합된 MS2-선호도 정화의 수정된 프로토콜을 기술했습니다. 광범위하게, MS2 aptamer는 관심의 sRNA의 5'극단에 융합됩니다. 이 구조는 MS2-sRNA가 세포 파트너와 상호 작용할 수 있도록 생체 내에서 발현됩니다. 세균 수확 후, 세포는 기계적으로 lysed. 조추출물은 이전에 말토스 결합 단백질에 융합된 MS2 단백질로 코팅된 아밀로오스 계 크로마토그래피 컬럼에 적재된다. 이를 통해 MS2-sRNA를 특정 캡처하고 RNA를 상호 작용할 수 있습니다. 용출 후, 조정된 RNA는 고처리량 RNA 시퀀싱 및 후속 생물정보 분석으로 확인된다. 다음 프로토콜은 그람 양성 인간 병원체 황색포도상구균에서 구현되었으며, 원칙적으로 모든 그램 양성 박테리아로 변형될 수 있습니다. 요약하자면 MAPS 기술은 특정 sRNA의 규제 네트워크를 깊이 탐구하는 효율적인 방법을 구성하여 전체 대상의 스냅샷을 제공합니다. 그러나 MAPS에서 식별된 대상은 여전히 상호 보완적인 실험 적 접근 방식으로 검증되어야 한다는 점을 명심해야 합니다.

서론

수백, 아마도 수천 개의 작은 규제 RNA (sRNA)는 대부분의 세균게놈에서 확인되었지만, 그들 중 대다수의 기능은 특징지어지지 않습니다. 전반적으로, sRNA는 짧은 비코딩 분자, 세균성 생리학및^변동하는환경에 적응에 있는 중요한 역할을^1,2,3. 실제로, 이 거대 분자는 수많은 복잡한 규제 네트워크의 중심에, 신진 대사 경로에 영향을 미치는, 스트레스 반응뿐만 아니라 독성과 항생 저항. 논리적으로, 그들의 합성은 특정 환경 자극에 의해 트리거됩니다 (예를 들어, 영양소 기아, 산화 또는 막 스트레스). 대부분의 sRNA는 짧고 연속적이지 않은 염기 페어링을 통해 전사 후 수준에서 다중 표적 mRNA를 조절합니다. 그들은 일반적으로 번역 개시 영역^4에대한 리보솜과 경쟁하여 번역 개시를 방지합니다. sRNA:mRNA 이중제의 형성은 또한 수시로 특정 RNases의 모집에 의하여 표적 mRNA의 적극적인 저하에 초래됩니다.

sRNA 표적(즉, 표적 RNA의 전체 세트)의 특성화는 개입하는 대사 경로의 식별과 응답할 수 있는 잠재적 신호를 허용합니다. 따라서, 특정 sRNA의 기능은 일반적으로 그것의 targetome에서 유추될 수 있습니다. 이를 위해, 실리코 예측 도구중 몇몇은 IntaRNA 및 CopraRNA^5,6,7과같은 개발되었다. 특히 시퀀스 상호 보완성, 잠재적 인 상호 작용 부위의 페어링 에너지 및 접근성에 의존하여 putative sRNA 파트너를 결정합니다. 그러나, 예측 알고리즘은 RNA chaperones^8의 참여와 같은 생체 내의 기본 페어링에 영향을 미치는 모든 요인을 통합하지 않으며, 이는 하위 최적 상호 작용 또는 두 파트너의 공동 발현을 선호한다. 고유한 제한으로 인해 예측 도구의 잘못된 긍정 비율은 여전히 높습니다. 대부분의 실험적인 대규모 접근법은 태그된 RNA 결합 단백질(RBP)^6,9와상호 작용하는 sRNA:mRNA 커플의 공동 정화에^{기초한다.} 예를 들어, 레깅스 및 시퀀싱(RIL-seq) 방법에 의한 RNA 상호작용은 에체리치아 대장균^10,11에서Hfq 및 ProQ와 같은 RNA 샤페론과 공동 정제된 RNA 이중균을 규명하였다. 하이브리드의 UV 크로스링크, 리깅 및 시퀀싱(CLASH)이라는 유사한 기술이 대장균^12,13의RNase E-및 Hfq 관련 sRNA에 적용되었다. 여러 박테리아에서 sRNA 매개 조절에서 Hfq 및 ProQ의잘 기술된 역할에도 불구하고^8,14,15,sRNA 기반 조절은 S. 아우레우스^16,17,18과같은 여러 유기체에서 RNA 샤페론 독립적인 것으로 보인다. RNases와 관련하여 RNA 이중화의 정제가 워터스와 동료^(13)에의해 입증 된 것처럼 가능하더라도, 이것은 RNases가 급속한 저하를 유발하기 때문에 까다로운 남아있다. 따라서, RNA 염기서열분석(MAPS)접근법(MAPS)과 결합된 MS2-선호도 정화는^19,20은 그러한 유기체에서 견고한 대안을 구성한다.

위에서 언급한 방법과 달리 MAPS는 특정 sRNA를 미끼로 사용하여 상호 작용하는 모든 RNA를 캡처하므로 RBP의 참여에 의존하지 않습니다. 전체 프로세스는 그림 1에표시됩니다. 간단히 말해서, sRNA는 MS2 코트 단백질에 의해 특별히 인식되는 MS2 RNA aptamer와 함께 5'에 태그된다. 이 단백질은 아밀로스 수지에 고정되는 말토스 결합 단백질(MBP)과 융합된다. 따라서, MS2-sRNA 및 그 RNA 파트너는 친화성 크로마토그래피 컬럼상에 유지된다. 말토스를 이용한 용출 후, 공동 정제 된 RNA는 생물학적 정보 분석(도 2)에이어 고처리량 RNA 시퀀싱을 사용하여 식별됩니다. MAPS 기술은 궁극적으로 생체 내에서 발생하는 모든 잠재적 상호 작용에 대한 상호 작용 맵을 그립니다.

MAPS 기술은 원래 비 병원성 그람 음성 박테리아 대장균(21)에서구현되었다. 놀랍게도 MAPS는 RyhB 및 Rybb sRNAs와 특히 상호 작용하는 tRNA 유래 단편을 식별하고 비 유도 조건에서 mRNA 표적을 조절하기 위한 sRNA 전사 소음을 방지하는 데 도움을 주었습니다. 그 후, MAPS는 DsrA^22,RprA^23,CyaR²³ 및 GcvB²⁴ (표 1)와같은 다른 대장균 sRNA에 성공적으로 적용되었습니다. MAPS는 이전에 알려진 대상을 확인하는 것 외에도 이러한 잘 알려진 sRNA의 대상을 확장했습니다. 최근, MAPS는 살모넬라 타이피무리움에서 수행되었으며 SraL sRNA가 로mRNA에 결합되어 전사 종료 인자(25)를 코딩한다고 밝혔다. 이 페어링을 통해 SraL은 Rho 자체에 의해 유발되는 조기 전사 종료로부터 rho mRNA를 보호합니다. 흥미롭게도, 이러한 기술은 sRNA에 국한되지 않으며 tRNA 유래^{단편(26)과} mRNA^22(표 1)의번역되지 않은 영역의 사용에 의해 예시된 바와 같이 모든 유형의 세포 RNA에 적용될 수 있다.

MAPS 방법은 또한 병원성 그람 양성 박테리아 S. 아우레우스^19에적응되었다. 구체적으로, 용해 프로토콜은 그람 음성 박테리아보다 두꺼운 세포벽으로 세포를 효율적으로 분해하고 RNA 무결성을 유지하기 위해 널리 변형되었다. 이 적응 된 프로토콜은 이미 RsaA^27,RsaI²⁸ 및 RsaC^29의상호 작용을 해명했다. 이 접근은 세포 표면 속성, 포도당 섭취 및 산화 스트레스 반응의 규제 메커니즘에서 이러한 sRNAs의 중요한 역할에 대한 통찰력을 제공했습니다.

2015년 대장균에서 개발 및 구현된 프로토콜은 최근^30개세부 사항으로 설명되어 있다. 여기서, 당사는 변형된 MAPS 프로토콜을 제공하며, 이는 비병원성 또는 병원성(안전 예방 조치)이 아닌 그람 양성(두꺼운 세포벽) 박테리아에서 sRNA 규제 네트워크를 연구하는 데 특히 적합합니다.

프로토콜

1. 버퍼 및 미디어

1. MAPS 실험의 경우 다음 버퍼 및 미디어를 준비합니다.
   - 버퍼 A (150mM KCl, 20m Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ 및 1 mM DTT)
   - 버퍼 E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM 말토세, 0.1% 트리톤, 1 mM MgCl₂ 및 1 mM DTT)
   - RNA 적재 버퍼 (0.025 % 자일렌 시안올 및 0.025 % 브로모페놀 블루 8 M 우레아)
   - 뇌 심장 주입 (BHI) 매체 (종아리 뇌 12.5 g, 펩톤 10 g, 쇠고기 심장 5 g, NaCl 5 g, Na₂HPO₄ g 2.5 g, 1 L용 포도당 2 g)
   - 리소제니 브로스 (LB) 매체 (펩톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 10 g 1 L)
2. 노던 블롯 에세이의 경우 다음 버퍼를 준비합니다.
   - 블로킹 용액(1배 수성산 및 1% 차단 시약)
   - 혼성화 용액 (50 % 포르마이미드, 5 배 SSC, 7 % SDS, 1 % 차단 용액 및 0.2 % N-lauryl sarcosine, 50 mMM 나트륨 인산염). 교반으로 가열하여 용해합니다.
   주의: 각 제품과 관련된 안전 주의 사항을 신중하게 따르십시오.
   - 인산나트륨 1M (58mM 나트륨 인산염 디베이직 및 42m 나트륨 인산염 모노베이직)
   - 식염수, 구연산나트륨(SSC) 완충제, 20배 농축액(3M NaCl 및 300mM 삼각나트륨 구연산)

2. 안전 문제

1. 레벨 2 봉쇄 실험실에서 실행 가능한 병원성 박테리아와 관련된 모든 단계를 수행하십시오.
   참고: 세포 추출물만 리시스(5단계)후에 외부에서 추출할 수 있습니다.
2. 실험실 코트와 장갑을 착용하십시오.
3. 손목이 덮여 있는지 확인합니다.
4. 소독제 용액으로 생물학적 안전 캐비닛(Class II)을 청소합니다.
5. 적절한 생체 의학 쓰레기통에 박테리아에 노출 된 고체 폐기물을 폐기하십시오.
6. 소독제로 오염된 액체를 함유한 플라스크를 치료합니다. 그런 다음 싱크대에 버리십시오.
7. 비누로 손과 손목을 조심스럽게 씻고 레벨 2 봉쇄 실험실을 떠나기 전에 실험실 코트를 제거하십시오.

3. 플라스미드 건설

참고: 복제 를 위해, 먼저 내인 성 sRNA의 경계를 식별하는 것이 중요합니다. pCN51-P3 및 pCN51-P3-MS2 플라스미드는 토마시니 외(2017)^27에기재되어 있다. P3 프로모터는 세포 밀도 의존성 방식으로 sRNA의 높은 발현을 허용합니다(즉, 박테리아가 성장의 고정 된 단계에 들어갈 때). 많은 포도상 구균 sRNA는 이 성장 단계 도중 축적됩니다.

1. 고충실도 DNA 폴리머라제 및 PCR 기계를 사용하여 PCR에 의해 sRNA 서열을 증폭시킵니다. 제조업체의 지침을 신중하게 따르고 자세한 내용은 가리비안과 아바시아 (2013)^31을 참조하십시오.
2. 다음 템플릿을 사용하여 특정 프라이머를 디자인합니다.
   
   및 5'-CGCGGATCC(N)-3' 포워드 및 역 프라이머에 대 한, 각각.
   참고: 이러한 올리고뉴클레오티드는 MS2 서열을 관심 있는 sRNA의 5'끝에 융합할 수 있게 한다. Pst I및 BamHI 제한 사이트(밑줄)는 MS2-sRNA 구조의 5' 및 3'단말에 첨가되어 앰플콘을 pCN51-P3 플라스미드^27로복제한다. (N) 유전자 특이적 서열(15-20 뉴클레오티드)에 대응한다.
3. pCN51-P3 플라스미드의 1 μg와 제조업체의 권장 사항에 따라 적절한 버퍼에 2 U의 PstI 및 BamHI 1 U를 가진 MS2-sRNA PCR 제품의 1 μg를 소화합니다.
4. 37°C에서 1h를 배양하고 PCR 정화 키트를 사용하여 DNA를 정화합니다(재료표참조).
5. 소화된 pCN51-P3 플라스미드(300 ng) 및 MS2-sRNA 앰플리온(벡터용 어금루 비율:삽입 = 1:3)을 1.5mL 튜브에 섞는다. 리비 외(1988)^32를 참조하여 결찰 효율을 극대화하십시오. 각 튜브에 리가제 버퍼 1μL과 T4 리개세 10U를 추가합니다. 초순수로 부피를 10 μL로 조정합니다.
6. 22°C에서 적어도 2시간 동안 배양한다.
7. 냉동 DH5α화학유능한 대장균 세포의 50 μL에 결찰 혼합물 5μL을 추가합니다. Seidman 외(2001)^33을 읽고 플라스미드 변환및 화학적으로 유능한 세포에 대해 자세히 알아보십시오.
8. 얼음에 30 분 인큐베이션.
9. 열 충격(42°C에서 45s)은 열블록 또는 수조를 이용한 변형 튜브.
10. LB 배지 의 900 μL을 추가하고 30 분 동안 37 °C에서 배양하십시오.
11. 암피실린(100 μg/μL)으로 보충된 LB 한천 판에 세균 현탁액의 플레이트 100 μL.
    참고: pCN51-P3 벡터는 pCN51-P3-MS2-sRNA 플라스미드를 운반하는 대장균 클론만을 선택할 수 있는 암피실린 내성 유전자를 인코딩한다.
12. 플라스미드 DNA 미니프렙 키트를 사용하여 암피실린(100 μg/μL)의 존재에서 자란 하룻밤 세균 배양(5mL)으로부터 pCN51-P3-MS2-sRNA 플라스미드를 추출한다(재료표참조).
13. 다음 프라이머, 5'-TCTCGAAAATAATAATAATAATAATAGAGGG-3'를 사용하여 Sanger 시퀀싱^34에 의해 구조를 확인합니다.
14. pCN51-P3-MS2-sRNA 플라스미드를 DC10B화학적으로 유능한 대장균 세포로 변환합니다.  3.7에서 3.11단계를 반복합니다.
15. pCN51-P3-MS2-sRNA 플라스미드(단계 3.12 참조)를 추출하고, 전기기장치를 사용하여 플라스미드 DNA의 1-5 μg를 HG001 ΔsRNA 전기능력 S. 아우레우스 세포로 변환한다. 제조업체의 지침을 신중하게 따르십시오. 그로서와 리처드슨 (2016)^35읽기 전기 유능한 S. 아우레우스를준비하는 방법에 대해 자세히 알아보십시오.
    주의: 이 단계는 병원성 박테리아의 처리를 포함합니다 (2 단계 참조).
16. BHI 배지 의 900 μL을 추가하고 3 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오.
17. 원심분리기 1분 16,000 x g. 상부체를 폐기합니다.
18. 펠릿을 BHI 의 100 μL로 재중단하고 에리스로마이신(10 μg/μL)으로 보충된 BHI 천 판에 세균 현탁액을 플레이트합니다.
    참고: pCN51-P3 벡터는 또한 pCN51-P3-MS2-sRNA 플라스미드를 운반하는 S. 아우레우스 클론만 을 선택할 수 있는 에리스로마이신 저항 유전자를 인코딩합니다.

4. 박테리아 수확

주의: 이 단계는 병원성 박테리아의 처리를 관련시킵니다 (2단계 참조).

1. 중복에 에리스로 마이신 (10 μg/μL)으로 보충 된 BHI 매체의 3 mL에서 pCN51-P3-MS2-sRNA 또는 pCN51-P3-MS2-MS2²⁷ 플라스미드를 운반하는 균주의 한 식민지를 성장시다.
2. 각 야간 배양을 50mL(≈1/100)의 신선한 BHI 배지에 적혈구(10 μg/μL)로 보충하여 0.05의 OD_600nm에 도달하도록 희석한다. 250 mL 살균 플라스크 (5:1 플라스크 대 중간 비율)를 사용합니다.
   참고: 중간 및 성장 조건은 연구된 sRNA의 발현 패턴에 따라 설정되어야 한다.
3. 6 시간 동안 180 rpm에서 흔들어 37 °C에서 배양성장.
4. 각 문화를 50mL 원심분리기 튜브로 옮는다.
5. 4°C에서 15분 동안 2,900 x g의 원심분리기. 상부체를 폐기합니다.
6. 펠릿을 얼음 위에 보관하고 기계식 셀 용액(5단계)을 직접 수행하거나 -80°C에 펠릿을 동결및 저장합니다.

5. 기계셀 리시스

주의: 다음 단계는 얼음에서 수행해야하며 버퍼는 4 °C에 있어야합니다. 장갑을 사용하고 RNases에서 샘플을 보호하기 위해 모든 예방 조치를 취하십시오.

1. 버퍼 A의 5mL에서 펠릿(4.6단계)을 다시 중단합니다.
2. 실리카 비드 3.5 g(0.1mm)로 15mL 원심분리기 튜브에서 재중단된 세포를 이송한다.
3. 기계식 셀 리시스 기기에 튜브를 삽입합니다(재료 표참조). 4.0 m/s에서 40s의 사이클을 실행합니다.
   참고: 한 주기가 세포를 깨기에 충분하지 않은 경우 샘플을 얼음 위에 유지하면서 장치를 5분 동안 식힙니다. 그런 다음 4.0 m/s에서 40s의 또 다른 주기를 반복합니다. 세포 용해의 효율은 BHI-agar 플레이트에 상체를 도금하여 테스트 할 수 있습니다.
4. 15 분 동안 15,700 x g에서 원심 분리기. 상체를 복구하고 얼음에 보관합니다.

6. 열 준비

주의: 아밀로오스 수지가 건조되지 않도록 주의하십시오. 필요한 경우 끝 캡으로 열을 봉인합니다. 선호도 정화를 시작하기 전에 모든 솔루션을 준비합니다.

1. 열 랙에 크로마토그래피 열을 넣습니다(재료 표참조).
2. 기둥 끝을 제거하고 초순수물로 컬럼을 씻으시다.
3. 아밀로오스 수지 300 μL을 추가합니다.
4. 버퍼 A의 10mL로 열을 씻으시다.
5. 완충 A의 6mL에서 MBP-MS2 단백질의 1,200 pmol을 희석하고 열에 적재합니다.
6. 버퍼 A의 10mL로 열을 씻으시다.

7. MS2 선호도 정화 (그림1)

1. 셀 리세이트를 열에 로드합니다.
   참고: 총 RNA(Step 8)를 추출하고 북부 블롯(9단계) 및 전사(10단계) 분석을 수행하기 위해 세포 리세테(원유 추출물, CE)의 1mL을 보관한다.
2. 깨끗한 수집 튜브에서 흐름 관통 분획(FT)을 수집합니다.
3. 버퍼 A의 10mL로 컬럼을 3번 세척하여 세척 분수(W)를 수집합니다.
4. 버퍼 E의 1mL로 컬럼을 엘테우트와 2mL 마이크로튜브에서 용출 분수(E)를 수집합니다.
5. RNA 추출(8단계)까지 수집된 모든 분획을 얼음 위에 보관하거나 나중에 사용하기 위해 -20°C에서 동결하십시오.

8. 수집 된 분획의 RNA 추출 (CE, FT, W 및 E)

1. RNA 추출에 각 분획(FT 및 W 포함)의 1mL를 사용합니다.
2. 페놀 1부 분량을 추가합니다. 힘차게 섞으세요.
   주의: 페놀은 휘발성이 높고 부식성이며, 주의를 기울이고 연기 후드 아래에서 안전하게 일합니다.
3. 20°C에서 10분 동안 16,000 x g의 원심분리기.
4. 깨끗한 2 mL 마이크로 튜브에서 상층을 전송합니다.
5. 클로로폼/이소아밀 알코올 1부(24:1)를 추가하고 8.3~8.4단계를 반복합니다.
   주의: 연기 후드 아래에서 안전하게 작업하십시오.
6. 2.5권의 냉간 에탄올 100% 및 3M 아세테이트(NaOAc) pH 5,2의 1/10 부피를 추가합니다.
7. 하룻밤 사이에 -20 °C에서 침전시됩니다.
   참고: 강수량은 20분 동안 또는 2시간 동안 -80°C에서 에탄올/드라이 아이스 욕조에서 수행될 수 있습니다.
8. 원심분리기는 4°C에서 15분 동안 16,000 x g의 원심분리기. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 파이펫으로 에탄올을 천천히 제거합니다.
   주의: RNA 펠릿은 항상 볼 수 없으며 에탄올이 있는 경우 때때로 느슨합니다.
9. 80% 차가운 에탄올의 500 μL을 추가합니다.
10. 원심분리기는 4°C에서 5분 동안 16,000 x g에서 원심분리기.
11. 천천히 파이펫으로 에탄올을 버리십시오. 진공 농축기, 실행 모드에서 5 분 사용하여 펠릿을 건조.
12. 초순수의 적절한 부피(15-50 μL)로 펠릿을 다시 놓습니다. 나중에 사용하기 위해 -20 °C에서 펠릿을 동결하십시오.
13. 분광계/불소계를 사용하여 RNA 수량(260nm) 및 품질(260/280 및 260/230 파장 비율)을 평가합니다(재료표참조). 제조업체의 지침을 신중하게 따르십시오.
    참고: 3-4 μg는 일반적으로 용출 분획(E)에서 얻어진다. 이것은 주로 테스트 된 조건에 따라 달라집니다.

9. 북부 블롯36에 의한 MS2 선호도 정화 분석

1. CE, FT, W 분수 및 500 ng의 RNA를 초순수 수의 10 μL에 희석하고 RNA 적재 버퍼 10 μL과 혼합합니다.
2. 90 °C에서 3 분 동안 배양하십시오.
3. 1% 아가로즈 젤의 우물에 샘플을 적재하여 20mM의 구아니듐 티오야네이트로 보충하고 4°C에서 TBE 1x 버퍼에서 100-150 V로 젤을 실행합니다. 자세한 내용은 Koontz (2013)^37을 참조하십시오.
4. 1시간 또는 모세관 이송을 위해 밤새 진공 이송에 의해 니트로셀룰로오스 멤브레인에 RNA를 전달한다.
   참고: 모세관 방법은 대형 RNA의 경우 더 효율적입니다.
5. 자외선 크로스링커를 사용하여 멤브레인(254nmMMJ에서 120mJ)에 UV 크로스 링크 RNA.
6. RNA 측이 위를 향하여 혼성화 병에 멤브레인을 삽입합니다.
7. 예열된 혼성화 솔루션의 10-20mL를 추가합니다. 68 °C에서 30 분 인큐베이션하십시오.
8. 용액을 폐기하고 sRNA 특이적 프로브의 1 μL로 보충된 신선한 혼성화 용액 10-20mL을 추가합니다. 68 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
   참고: DIG 라벨RNA 프로브는 DIG RNA 라벨링 키트를 사용하여 제조업체의 지침을 따르게 됩니다. 또는, 무선 라벨 프로브를 사용할 수 있습니다.
9. 20°C에서 5분 동안 10-20mL의 워시 용액 1(2x SSC 및 0.1% SDS)으로 멤브레인을 세척합니다. 한 번 반복합니다.
10. 68°C에서 15분 동안 10-20mL의 워시 용액 2(0.2배 SSC 및 0.1% SDS)로 멤브레인을 세척합니다. 한 번 반복합니다.
11. 20°C에서 최소 30분 동안 10-20mL의 블로킹 용액을 배양한다.
12. 용액을 폐기하고 알칼리성 인산파아제에 공주한 폴리클론 항디곡시진 항체(1/1000)로 보충된 블로킹 용액의 10-20mL를 추가한다. 20 °C에서 30 분 인큐베이션하십시오.
13. 20°C에서 15분 동안 10-20mL의 세정용액 3(1배 수성산 및 0.3% 트웬 20)로 멤브레인을 세척한다. 한 번 반복합니다.
14. 검출 용액의 10-20 mL (0.1 M Tris HCl 및 0.1 M NaCl pH 9.5) 20 °C에서 5 분으로 멤브레인을 배양하십시오.
15. 플라스틱 필름에 멤브레인을 넣고 기판으로 담급니다 (재료 표참조). 어둠 속에서 5 분 동안 배양하십시오.
16. 플라스틱 필름에서 멤브레인을 밀봉합니다. 사인 방사선 카세트에 멤브레인을 넣습니다.
17. 전용 어두운 방에서 사인 방사선 필름에 막을 노출.
    참고: 박람회 시간은 몇 초에서 몇 초까지 신호 강도에 따라 달라집니다.
18. 자동 개발 장치에서 노출된 필름을 공개합니다.

10. RNA 염기서열분석시료 의 준비

참고: 이 단계는 E 및 CE 분획에서 추출한 RNA에만 해당됩니다.

1. 각 샘플에 10x DNase 버퍼 및 DNase I(처리된 RNA의 U/μg 1개)를 추가합니다. 100 μL의 최종 부피에 물을 추가합니다.
2. 37°C에서 1h의 인큐베이션을 합니다.
3. 이전에 설명한 대로 RNA를 추출하고 정화합니다(8.2~ 8.11단계).
4. 초순수 의 20 μL에서 RNA 펠릿을 다시 중단합니다.
   참고: 남은 DNA의 존재는 PCR 및 특정 프라이머(예를 들어, 16S 유전자)를 사용하여 검사될 수 있다.
5. 미세 유체학 기반 전기 전광 분석 시스템을 사용하여 RNA 수량 및 품질을 평가합니다(재료 표참조).
   참고: 1 μg는 일반적으로 DNase 처리 후에 용출 분획(E)에서 수득됩니다.
6. 세균 rRNA 고갈 키트로 리보소말 RNA를 제거합니다.
   참고: 크고 풍부한 RNA(즉, rRNA)는 선호도 열과 구체적으로 상호 작용하는 경향이 있습니다. 추출된 RNA의 500 ng는 이 단계를 수행하기 위해 요구된다.
7. 미세 유체학 기반 전기 포근 분석 시스템을 사용하여 RNA 수량과 품질을 다시 평가합니다.
8. cDNA 라이브러리 준비 키트를 사용하여 제조업체의 지침을 따르는 10-20 ng의 방비 RNA로 cDNA 라이브러리를 준비하십시오.
9. 시퀀싱 계측기를 사용하여 얻은 라이브러리를 시퀀싱합니다(예: 단단, 150bp; 재료표참조).
   참고: 샘플당 5-1,000만 개의 읽기는 일반적으로 충분합니다.

11. RNAseq 데이터 분석 (그림2)

1. 시퀀싱 플랫폼에서 FastQ 시퀀싱 파일을 다운로드합니다.
2. 로코프 생물학적스테이션(https://galaxy.sb-roscoff.fr/)의은하 인스턴스에 액세스하고 로그인합니다.
   참고: 언급된 모든 알고리즘은 검색 표시줄을 사용하여 쉽게 찾을 수 있습니다. 각 도구에 대해 사용자 가이드가 제공됩니다.
   주의: 필요한 도구의 버전은 공용 Galaxy^{서버(38)와}다를 수 있습니다.
3. 데이터 사용 아이콘을 클릭한 다음 컴퓨터에서 파일을 업로드합니다. 각 MS2 제어 및 MS2-sRNA 샘플의 FastQ 시퀀싱 파일을 업로드합니다. 또한 FASTA 참조 게놈 파일 및 GFF 어노션 파일을 업로드합니다.
4. 빠른 QC 읽기 품질 보고서 (갤럭시 버전 0.69)를 실행합니다.
   참고: 이 도구는 원시 시퀀스에 대한 품질 평가(예: 품질 점수, 어댑터 시퀀스의 존재)를 제공합니다.
5. 트림모틱 유연한 읽기 트리밍 도구(Galaxy Version 0.36.6)를 실행하여 어댑터 시퀀스와 품질이 좋지 않은 읽기를 제거합니다. 라이브러리 준비에 사용되는 어댑터 시퀀스를 나타냅니다(예: TruSeq 3, 단일 단말). 다음 트리모틱 작업을 추가합니다: 슬라이딩윈도우(베이스 수=4; 평균 품질=20) 및 MINLEN(읽기=20의 최소 길이).
6. 다시 FastQC 읽기 품질 보고서 (갤럭시 버전 0.69)를 실행합니다.
7. 나비티2 실행 - 지도는 참조 게놈에 대해 읽습니다 (갤럭시 버전 2.3.2.2). 기록에서 게놈 참조 FASTA 파일을 사용하여 기본 설정(매우 민감한 로컬)으로 읽기를 매핑합니다.
   참고: Bowtie2 도구에서 생성된 BAM 파일은 통합 유전체학 뷰어(IGV)를 사용하여 시각화할 수 있습니다. 연결된 BAI 파일도 필요합니다.
8. 선택적으로 BAM 데이터 집합(Galaxy Version 2.0)에 대한 통계를 컴파일하는 플래그스타트 실행.
9. htseq 카운트 실행 - GFF 음권 파일에서 중복되는 기능을 정렬하는 카운트(갤럭시 버전 0.6.1). 교차(비어 없는) 모드를 사용합니다.
10. htseq 카운트 분석에서 단일 Zip 파일로 모든 원시 카운트 파일을 보관합니다.
11. SARTools DESeq2를 실행하여 데이터를 비교합니다(갤럭시 버전 1.6.3.0). 원시 카운트 파일과 디자인 파일이 포함된 Zip 파일을 제공하며 실험을 설명하는 탭 디미티코 파일을 제공합니다. 설계 파일을 생성하는 지침에 따라 신중하게 따르십시오.

결과

대표적인 결과는 S. 아우레우스^29에서RsaC 표적학의 연구에서 유래. RsaC는 비전통적인 1,116 nt-long sRNA입니다. 그것의 5' 끝은 그것의 3'끝 (544 nt)가 구조적으로 독립적이고 mRNA 표적으로 가진 모든 예측된 상호 작용 사이트를 포함하는 동안 몇몇 반복된 지역을 포함합니다. 이 sRNA의 발현은 망간(Mn)이 부족할 때 유도되며, 이는 종종 숙주 면역 반응의 맥락에서 발생합니다. MAPS 기술을 사용하여 RsaC와 직접 상호 작용하는 여러 mRNAs를 식별하여 산화 스트레스(sodA, ldh1 및 sarA)및 금속 관련(znuBC-zur 및 sufCDSUB)응답에서 중요한 역할을 밝혔습니다.

MS2-sRNA 구조 및 실험 조건의 검증
MAPS 실험을 수행하기 전에, 연구된 s...

토론

그람 양성 박테리아에 대한 수정된 프로토콜
MAPS의 초기 프로토콜은 모델 유기체^{대장균(20)및30에서}sRNA 상호작용을 연구하기 위해 개발되었다. 여기서, 우리는 기회성 인간 병원체 S. 아우레우스에서 sRNA 의존적인 규제 네트워크의 특성화에 적합하고 확실히 그밖 그람 양성 박테리아, 병원성 또는 아닙니다 에 이식할 수 있는 수정된 프로토콜을 기술합니다.

특히 세포 리시스 단계에주의를 기울였다. 프랑스 언론은 기계식 셀 리시스 기기로 대체되었습니다. 이 방법은 그람 양성 세포를 깨고 병원성 균주의 처리에 관련된 위험을 제한하는 데 효과적입니다. MS2-선호도 정제의 수율을 향상시키기 위해 아밀로산 수지상에 고정된 MS2-MBP의 양이 크게 증가했습니다. 이렇게 하려면 개반 및 세치 수를 조정해야 합니다....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브	Sarstedt	72.690.001
15mL 원심분리기 튜브	Falcon	352070
2mL 마이크로 원심분리기 튜브	Starstedt	72.691
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939BA	RNA 수량 및 품질
250mL 배양 플라스크	Dominique Dutscher	2515074	Bacterial culture
50 mL 원심분리기 튜브	Falcon	352051	Culture 원심분리
Absolute ethanol	VWR Chemicals	20821.321	RNA 추출 및 정제
Allegra X-12R 원심분리기	Beckman Coulter		박테리아 펠릿화
Ampicilin (amp)	Sigma-Aldrich	A9518-5G	성장 배지
Amylose resin	New England BioLabs	E8021S	MS2-친화성 정제
항 다이옥시제닌 AP Fab 단편	Sigma Aldrich	11093274910	Northern blot assays
Autoradiography cassette	ThermoFisher Scientific	50-212-726	Northern blot assays
BamHI	ThermoFisher Scientific	ER0051	Plasmid construction
BHI (Brain Heart Infusion) Broth	Sigma-Aldrich	53286	성장 배지
차단 시약	Sigma Aldrich	11096176001	Northern blot assays
CDP-Star	Sigma Aldrich	11759051001	Northern blot assays (substrate)
Centrifuge 5415 R	Eppendorf		RNA extraction and
purification Chloroform	Dominique Dutscher	508320-CER	RNA extraction and 정제
DIG-RNA 라벨링 믹스	Sigma-Aldrich	11277073910	Northern blot assays
DNase I	Roche	4716728001	DNase 처리
Erythromycin (ery)	Sigma-Aldrich	Fluka 45673	성장 매체
FastPrep 장치	MP Biomedicals	116004500	기계적 용해
Guanidium Thiocyanate	Sigma-Aldrich	G9277-250G	노던 블롯 어세이
하이브리제이션 호벤 Hybrigene	Techne	FHB4DD	노던 블롯 어세이
하이브리드화 튜브	Techne	FHB16	노던 블롯 어세이
이소아밀 알코올	Fisher Scientific	A/6960/08	RNA 추출 및 정제
LB(용원 국물)	Sigma-Aldrich	L3022	성장 매체
용해 매트릭스 B 벌크	MP Biomedicals	6540-428	기계적 용해
MicroPulser Electroporator	BioRad	1652100	플라스미드 구조
Milli-Q 수성 장치	Millipore	Z00QSV0WW	초순수
NanoDrop 분광 광도계	ThermoFisher Scientific		RNA/DNA 수량 및 품질
니트로셀룰로오스 멤브레인	Dominique Dutsher 10600002		Northern blot assays
Phembact Neutre	PHEM Technologies	BAC03-5-11205	Cleaning and decontamination
Phenol	Carl Roth	38.2	RNA extraction and purification
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530	Plasmid construction
pMBP-MS2	Addgene	65104	MS2-MBP production
Poly-Prep chromatography column	BioRad	7311550	MS2-affinity purification
PstI	ThermoFisher Scientific	ER0615	Plasmid construction
Qubit 3 Fluorometer	Invitrogen	15387293	RNA quantity
RNAPro Solution	MP Biomedicals	6055050	Mechanical lysis
ScriptSeq Complete Kit	Illumina	BB1224	cDNA 라이브러리 준비
분광 광도계 Genesys 20	ThermoFisher Scientific	11972278	세균 배양
SpeedVac Savant 진공 장치	ThermoFisher Scientific	DNA120	RNA 추출 및 정제
Stratalinker UV Crosslinker 1800	Stratagene	400672	Northern blot assay
T4 DNA 리가제	ThermoFisher Scientific	EL0014	플라스미드 구조
TBE (Tris-Borate-EDTA)	Euromedex	ET020-C	노던 블롯 어세이
ThermalCycler T100	BioRad	1861096	플라스미드 구조
트윈 20	시그마 Aldrich	P9416-100ML	노던 블롯 어세이
X선 필름 프로세서	hu.q	HQ-350XT	노던 블롯 어세이
X-ray 필름 Super RX-N	FujiFilm	4741019318	노던 블롯 어세이