방법 논문

그람 양성 박테리아에서 RNA 염기서열분석과 결합된 MS2-선호도 정화

DOI:

10.3791/61731

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2021년 2월 23일

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1Université de Strasbourg, CNRS, 2Department of Biochemistry, Université de Sherbrooke

이 논문에서

요약

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MAPS 기술은 생체 내에서 특정 조절 RNA의 표적을 면밀히 조사하기 위해 개발되었습니다. 관심의 sRNA는 RNA 의 RNA 파트너의 공동 정화및 RNA 시퀀싱에 의한 그들의 식별을 가능하게 하는 MS2 aptamer로 태그됩니다. 이 수정 된 프로토콜은 특히 그램 양성 박테리아에 적합합니다.

초록

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작은 규제 RNA (sRNA)는 삶의 세균 영역 중 널리 퍼져 있지만, 그들 중 많은 기능은 mRNA 목표를 식별하는 어려움으로 인해 특히 특성화되지 않은 상태로 남아 있습니다. 여기서, 우리는 생체 내특정 sRNA의 모든 RNA 파트너를 드러내는 것을 목표로 RNA 시퀀싱 (MAPS) 기술과 결합된 MS2-선호도 정화의 수정된 프로토콜을 기술했습니다. 광범위하게, MS2 aptamer는 관심의 sRNA의 5'극단에 융합됩니다. 이 구조는 MS2-sRNA가 세포 파트너와 상호 작용할 수 있도록 생체 내에서 발현됩니다. 세균 수확 후, 세포는 기계적으로 lysed. 조추출물은 이전에 말토스 결합 단백질에 융합된 MS2 단백질로 코팅된 아밀로오스 계 크로마토그래피 컬럼에 적재된다. 이를 통해 MS2-sRNA를 특정 캡처하고 RNA를 상호 작용할 수 있습니다. 용출 후, 조정된 RNA는 고처리량 RNA 시퀀싱 및 후속 생물정보 분석으로 확인된다. 다음 프로토콜은 그람 양성 인간 병원체 황색포도상구균에서 구현되었으며, 원칙적으로 모든 그램 양성 박테리아로 변형될 수 있습니다. 요약하자면 MAPS 기술은 특정 sRNA의 규제 네트워크를 깊이 탐구하는 효율적인 방법을 구성하여 전체 대상의 스냅샷을 제공합니다. 그러나 MAPS에서 식별된 대상은 여전히 상호 보완적인 실험 적 접근 방식으로 검증되어야 한다는 점을 명심해야 합니다.

서론

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수백, 아마도 수천 개의 작은 규제 RNA (sRNA)는 대부분의 세균게놈에서 확인되었지만, 그들 중 대다수의 기능은 특징지어지지 않습니다. 전반적으로, sRNA는 짧은 비코딩 분자, 세균성 생리학및변동하는환경에 적응에 있는 중요한 역할을1,2,3. 실제로, 이 거대 분자는 수많은 복잡한 규제 네트워크의 중심에, 신진 대사 경로에 영향을 미치는, 스트레스 반응뿐만 아니라 독성과 항생 저항. 논리적으로, 그들의 합성은 특정 환경 자극에 의해 트리거됩니다 (예를 들어, 영양소 기아, 산화 또는 막 스트레스). 대부분의 sRNA는 짧고 연속적이지 않은 염기 페어링을 통해 전사 후 수준에서 다중 표적 mRNA를 조절합니다. 그들은 일반적으로 번역 개시 영역4에대한 리보솜과 경쟁하여 번역 개시를 방지합니다. sRNA:mRNA 이중제의 형성은 또한 수시로 특정 RNases의 모집에 의하여 표적 mRNA의 적극적인 저하에 초래됩니다.

sRNA 표적(즉, 표적 RNA의 전체 세트)의 특성화는 개입하는 대사 경로의 식별과 응답할 수 있는 잠재적 신호를....

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프로토콜

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1. 버퍼 및 미디어

  1. MAPS 실험의 경우 다음 버퍼 및 미디어를 준비합니다.
    - 버퍼 A (150mM KCl, 20m Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 및 1 mM DTT)
    - 버퍼 E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM 말토세, 0.1% 트리톤, 1 mM MgCl2 및 1 mM DTT)
    - RNA 적재 버퍼 (0.025 % 자일렌 시안올 및 0.025 % 브로모페놀 블루 8 M 우레아)
    - 뇌 심장 주입 (BHI) 매체 (종아리 뇌 12.5 g, 펩톤 10 g, 쇠고기 심장 5 g, NaCl 5 g, Na2HPO4 g 2.5 g, 1 L용 포도당 2 g)
    - 리소제니 브로스 (LB) 매체 (펩톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 10 g 1 L)
  2. 노던 블롯 에세이의 경우 다음 버퍼를 준비합니다.
    - 블로킹 용액(1배 수성산 및 1% 차단 시약)
    - 혼성화 용액 (50 % 포르마이미드, 5 배 SSC, 7 % SDS, 1 % 차단 용액 및 0.2 % N-lauryl sarcosine, 50 mMM 나트륨 인산염). 교반으로 가열하여 용해합니다.
    주의: 각....

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결과

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대표적인 결과는 S. 아우레우스29에서RsaC 표적학의 연구에서 유래. RsaC는 비전통적인 1,116 nt-long sRNA입니다. 그것의 5' 끝은 그것의 3'끝 (544 nt)가 구조적으로 독립적이고 mRNA 표적으로 가진 모든 예측된 상호 작용 사이트를 포함하는 동안 몇몇 반복된 지역을 포함합니다. 이 sRNA의 발현은 망간(Mn)이 부족할 때 유도되며, 이는 종종 숙주 면역 반응의 맥락에서 발생합니다. MAPS 기술을 사용하여 RsaC와 직접 상호 작용하는 여러 mRNAs를 식별하여 산화 스트레스(sodA, ldh1 및 sarA)및 금속 관련(znuBC-zur 및 sufCDSUB)응답에서 중요한 역할을 밝혔습니다.

MS2-sRNA 구조 및 실험 조건의 검증
MAPS 실험을 수행하기 전에, 연구된 s.......

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토론

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그람 양성 박테리아에 대한 수정된 프로토콜
MAPS의 초기 프로토콜은 모델 유기체대장균(20)및30에서sRNA 상호작용을 연구하기 위해 개발되었다. 여기서, 우리는 기회성 인간 병원체 S. 아우레우스에서 sRNA 의존적인 규제 네트워크의 특성화에 적합하고 확실히 그밖 그람 양성 박테리아, 병원성 또는 아닙니다 에 이식할 수 있는 수정된 프로토콜을 기술합니다.

특히 세포 리시스 단계에주의를 기울였다. 프랑스 언론은 기계식 셀 리시스 기기로 대체되었습니다. 이 방법은 그람 양성 세포를 깨고 병원성 균주의 처리에 관련된 위험을 제한하는 데 효과적입니다. MS2-선호도 정제의 수율을 향상시키기 위해 아밀로산 수지상에 고정된 MS2-MBP의 양이 크게 증가했습니다. 이렇게 하려면 개반 및 세치 수를 조정해야 합니다........

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작품은 "기관 내셔널 드 라 레체쉬"(ANR, 그랜트 ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH 및 ANR-18-CE12-0025-04, 코노코, PR)에 의해 지원되었다. 또한 향후 프로그램에 대한 투자의 일환으로 ANR이 관리하는 국가의 자금 지원으로 LabEx NetRNA ANR-10-LABX-0036및 ANR-17-EURE-0023 (PR)의 프레임 워크에 따라 출판되었습니다. DL은 마리 스크와도우스카-퀴리 보조금 계약 제753137-SaRNAReg에 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에 의해 지원되었다. E. Massé Lab의 작업은 캐나다 보건 연구소 (CIHR), 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC), 및 건강 NIH 팀 그랜트 R01 GM01 GM092830-06A1의 국립 연구소로부터 보조금을 운영함으로써 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브Sarstedt72.690.001
15mL 원심분리기 튜브Falcon352070
2mL 마이크로 원심분리기 튜브Starstedt72.691
2100 Bioanalyzer InstrumentAgilentG2939BARNA 수량 및 품질
250mL 배양 플라스크Dominique Dutscher2515074Bacterial culture
50 mL 원심분리기 튜브Falcon352051Culture 원심분리
Absolute ethanolVWR Chemicals20821.321RNA 추출 및 정제
Allegra X-12R 원심분리기Beckman Coulter박테리아 펠릿화
Ampicilin (amp)Sigma-AldrichA9518-5G성장 배지
Amylose resinNew England BioLabsE8021SMS2-친화성 정제
항 다이옥시제닌 AP Fab 단편Sigma Aldrich11093274910Northern blot assays
Autoradiography cassetteThermoFisher Scientific50-212-726Northern blot assays
BamHIThermoFisher ScientificER0051Plasmid construction
BHI (Brain Heart Infusion) BrothSigma-Aldrich53286성장 배지
차단 시약Sigma Aldrich11096176001Northern blot assays
CDP-StarSigma Aldrich11759051001Northern blot assays (substrate)
Centrifuge 5415 REppendorfRNA extraction and
purification ChloroformDominique Dutscher508320-CERRNA extraction and 정제
DIG-RNA 라벨링 믹스Sigma-Aldrich11277073910Northern blot assays
DNase IRoche4716728001DNase 처리
Erythromycin (ery)Sigma-AldrichFluka 45673성장 매체
FastPrep 장치MP Biomedicals116004500기계적 용해
Guanidium ThiocyanateSigma-AldrichG9277-250G노던 블롯 어세이
하이브리제이션 호벤 HybrigeneTechneFHB4DD노던 블롯 어세이
하이브리드화 튜브TechneFHB16노던 블롯 어세이
이소아밀 알코올Fisher ScientificA/6960/08RNA 추출 및 정제
LB(용원 국물)Sigma-AldrichL3022성장 매체
용해 매트릭스 B 벌크MP Biomedicals6540-428기계적 용해
MicroPulser ElectroporatorBioRad1652100플라스미드 구조
Milli-Q 수성 장치MilliporeZ00QSV0WW초순수
NanoDrop 분광 광도계ThermoFisher ScientificRNA/DNA 수량 및 품질
니트로셀룰로오스 멤브레인Dominique Dutsher 10600002Northern blot assays
Phembact NeutrePHEM TechnologiesBAC03-5-11205Cleaning and decontamination
PhenolCarl Roth38.2RNA extraction and purification
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BiolabsM0530Plasmid construction
pMBP-MS2Addgene65104MS2-MBP production
Poly-Prep chromatography columnBioRad7311550MS2-affinity purification
PstIThermoFisher ScientificER0615Plasmid construction
Qubit 3 FluorometerInvitrogen15387293RNA quantity
RNAPro SolutionMP Biomedicals6055050Mechanical lysis
ScriptSeq Complete KitIlluminaBB1224cDNA 라이브러리 준비
분광 광도계 Genesys 20ThermoFisher Scientific11972278세균 배양
SpeedVac Savant 진공 장치ThermoFisher ScientificDNA120RNA 추출 및 정제
Stratalinker UV Crosslinker 1800Stratagene400672Northern blot assay
T4 DNA 리가제ThermoFisher ScientificEL0014플라스미드 구조
TBE (Tris-Borate-EDTA)EuromedexET020-C노던 블롯 어세이
ThermalCycler T100BioRad1861096플라스미드 구조
트윈 20시그마 AldrichP9416-100ML노던 블롯 어세이
X선 필름 프로세서hu.qHQ-350XT노던 블롯 어세이
X-ray 필름 Super RX-NFujiFilm4741019318노던 블롯 어세이

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action. Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).
  2. Hör, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G.

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태그

sRNAStaphylococcus aureusRsaC sRNA

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