이 기사에서는 효소 조직 소화 프로토콜을 사용하여 붉은털 원숭이 유래 지방 유래 줄기 세포(ADSC)의 분리에 대해 설명합니다. 다음으로, 세포 분리, 계수 및 도금을 포함하는 ADSC 증식에 대해 설명합니다. 마지막으로, ADSC 분화는 특정 지방 생성 유도제를 사용하여 설명됩니다. 또한 차별화를 확인하기 위한 염색 기술을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
지방 조직은 자가 재생이 가능한 풍부하고 접근 가능한 다능성 줄기 세포 공급원을 제공합니다. 이러한 지방 유래 줄기 세포 (ADSC)는 생체 내 지방 세포와 기능적으로 유사한 일관된 생체 외 세포 시스템을 제공합니다. 생물 의학 연구에서 ADSC를 사용하면 지방 조직 대사 조절 및 기능에 대한 세포 조사가 가능합니다. ADSC 분화는 적절한 지방세포 확장을 위해 필요하며, 차선의 분화는 지방 기능 장애의 주요 메커니즘입니다. ADSC 분화의 변화를 이해하는 것은 대사 기능 장애 및 질병의 발병을 이해하는 데 중요합니다. 이 원고에 설명 된 프로토콜을 따를 때 포도당 섭취, 지방 분해, 지방 생성 및 분비를 측정하는 분석을 포함하되 이에 국한되지 않는 ADSC 대사 기능을 평가하기위한 여러 시험관 내 기능 테스트에 사용할 수있는 성숙한 지방 세포를 산출 할 것입니다. 붉은털 원숭이( Macaca mulatta) 는 생리학적, 해부학적, 진화적으로 인간과 유사하므로 그들의 조직과 세포는 생물 의학 연구 및 치료법 개발에 광범위하게 사용되었습니다. 여기에서는 4-9 세의 붉은 털 원숭이에서 얻은 신선한 피하 및 안타 지방 조직을 사용하여 ADSC 분리를 설명합니다. 지방 조직 샘플은 콜라게나제에서 효소적으로 분해된 후 여과 및 원심분리하여 기질 혈관 분획에서 ADSC를 분리합니다. 분리된 ADSC는 기질 배지에서 증식한 후 기질 배지에서 0.5μg/mL 덱사메타손, 0.5mM 이소부틸 메틸크산틴 및 50μM 인도메타신의 칵테일을 사용하여 약 14-21일 동안 분화합니다. 성숙한 지방 세포는 분화 약 14 일에 관찰됩니다. 이 원고에서는 ADSC 분리, 증식 및 시험관 내 분화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 붉은털 원숭이 지방 조직의 ADSC에 초점을 맞추었지만 이러한 프로토콜은 최소한의 조정으로 다른 동물로부터 얻은 지방 조직에 활용할 수 있습니다.
서론
지방 조직은 세포, 주로 성숙한 지방 세포 및 섬유 아세포, 면역 세포 및 지방 유래 줄기 세포 (ADSC)를 포함한 기질 혈관 분획의 이질적인 혼합물로 구성됩니다 1,2,3. 1 차 ADSC는 백색 지방 조직에서 직접 분리되고 지방 세포, 연골 또는 뼈 세포로 분화하도록 자극 될 수 있습니다4. ADSC는 시험관 내 다능성 유지 및자가 재생과 같은 고전적인 줄기 세포 특성을 나타냅니다. 그리고 문화에서 플라스틱을 고수합니다 5,6. ADSC는 다분화능과 비침습적 기술을 사용하여 대량으로 쉽게 수확할 수 있는 능력으로 인해 재생 의학에 사용되는 데 중요한 관심사입니다7. ADSC의 지방생성 분화는 지질 축적, 인슐린 자극 포도당 흡수, 지방 분해 및 아디포카인 분비8를 포함하는 성숙한 지방세포를 기능적으로 모방하는 세포를생성합니다. 성숙한 지방 세포와의 유사성은 지방 세포의 세포 특성 및 대사 기....
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프로토콜
획득 된 모든 조직 및 절차는 루이지애나 주립 대학 건강 과학 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며 국립 보건원 (NIH 간행물 번호 85-12, 1996 년 개정)의 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 완충액 및 용액의 제조
- 5x PBS에 5% 페니실린/스트렙토마이신(pen/strep) 및 0.25μg/mL의 진균 억제제를 추가하여 멸균 5-인산염 완충 식염수 세척 완충액(1-PBS) 용액을 준비합니다. 1x PBS에 2% 펜/스트렙 및 0.25μg/mL의 진균 억제제를 추가하여 멸균 2-PBS 세척 완충액(2-PBS) 용액을 준비합니다. 세척 완충액은 향후 사용을 위해 4°C에서 보관할 수 있으며 4주 이내에 사용해야 합니다.
참고: 5-PBS 버퍼는 부검 시 얻은 조직 샘플이 비멸균 환경에서 수집되므로 가능한 오염을 최소화하기 위해 지방 조직 수집 및 초기 세척에 사용됩니다. - 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)에 0.075 % 콜라게나제 유형 I (125 단위 / mg 활성), 2 % 펜 / 연쇄상 구균 및 0.25 μg / mL의 곰팡이 억제제를 1 % 소 혈청 알부민과 결합하여 멸균 콜라게나제 완충액 (CB)을 준비합니다. CB는 1 시간 이내에 사용해야합니다. ....
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결과
붉은털 원숭이 지방 조직 샘플에서 분리된 ADSC를 배양 플레이트에 시딩하고 그림 1에 나타내었다. 플레이팅 당일에, 세포는 비부착성이고 도 1A에 도시된 바와 같이 배양 접시에 부유한다. 72시간 이내에 ADSC는 80% 합류하여 지방세포 분화 준비가 됩니다(그림 1B). ADSC는 화학적 유도 후 강한 지방 생성 특성을 나타냅니다. 분화 14일 후, 성숙한 지방세포는 광학 현미경을 통해 관찰할 수 있습니다(그림 2A). ADSC 지방생성 분화를 확인하기 위해 다양한 염색을 사용하여 분화된 성숙 지방세포의 지질 방울을 시각화할 수 있습니다. 분화 14일째에, 세포를 염색하고 지질 액적 시각화를 위해 Oil Red O (도 2B) 및 BODIPY (
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토론
ADSC 분리, 증식 및 분화 프로토콜은 간단하고 재현 가능하지만 적절한 분리, 건강한 확장 및 효율적인 차별화를 보장하기 위해 신중한 기술이 필요합니다. 멸균 작업 환경은 모든 세포 배양 실험에 매우 중요합니다. 박테리아 또는 곰팡이는 오염된 도구, 배지 또는 작업 환경을 통해 세포 배양에 도입될 수 있습니다. 곰팡이 오염은 배양 물에서 포자 성장으로 표시되는 반면 박테리아 오염은 배지의 탁도의 존재로 표시됩니다. 사용하기 전에 생물안전 캐비닛과 모든 피펫, 병 및 도구를 소독하고, 생물안전 캐비닛을 사용하기 최소 15분 전에 층류 공기 흐름을 켜고, 사용 후 캐비닛과 모든 피펫을 소독하여 오염 위험을 줄이는 것이 좋습니다. 또한 진공 흡인을 위해 비필터 피펫 팁을 오토클레이빙하고 사용 후 흡인기를 멸균수로 세척한 후 70% 에탄올로 세척하는 것이 좋습니다. 배지만 있는 배양 접시를 37°C 및 5%CO2 의 가습 인큐베이터에 며칠 동안 두어 배지의 멸균성을 확인할 수 있습니다. 오염 된 배양 물은 30 분.......
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감사의 글
저자는 그의 기술 지원에 대해 Curtis Vande Stouwe에게 감사하고 싶습니다. 프로토콜 개발의 기초가되는 연구는 국립 알코올 남용 및 알코올 중독 연구소 (5P60AA009803-25, 5T32AA007577-20 및 1F31AA028459-01)의 보조금으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.4 % trypan blue | Thermo-Fisher | 15250061 | |
| 1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브 | Dot Scientific | 707-FTG | |
| 100 % 이소프로판올 | Sigma-Aldrich | PX1838-P | |
| 100-mm 세포 배양 접시 | Corning | 430167 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 50-mL 플라스틱 원뿔형 튜브 | Fisher Scientific | 50-465-232 | |
| 70-µ m cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| a-MEM | Thermo-Fisher | 12561056 | |
| 알루미늄 호일 | Reynolds Wrap | ||
| BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Sigma-Aldrich | 05470 | |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5810 R | |
| 콜라겐분해효소, 유형 I | Thermo-Fisher | 17100017 | |
| Dexamethasone-수용성 | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| 디메틸 설폭사이드, DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| 증류수 | Thermo-Fisher | 15230162 | |
| Fetal Bovine Serum, USDA 승인 | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fungizone/Amphotericin B(250ug/mL) | Thermo-Fisher | 15290018 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14175095 | |
| Hemacytometer with cover slip | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| 도립광 현미경 | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| 실험실 로커, 0.5-1.0 Hz | 신뢰할 수 있는 과학 | 모델 55 로킹 | |
| 중성 완충 포르말린(10%) | Pharmco | 8BUFF-FORM | |
| 오일 레드 O | 시그마-알드리치 | O0625 | |
| 파라포르멜데히드 | 시그마-알드리치 | P6148 | |
| 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4 | Thermo-Fisher | 10010023 | |
| 적혈구(RBC) 용해 완충액 | Qiagen | 158904 | |
| 혈청학적 피펫, 2 - 25 mL | Costar Stripettes | ||
| 표준 가습 세포 배양 인큐베이터, 37 ° C, 5 % CO2 | 산요 | MCO-17AIC | |
| 트립신-EDTA (0.25%) | 써모 피셔 | 25200056 |
참고문헌
- Fain, J. N. Release of interleukins and other inflammatory cytokines by human adipose tissue is enhanced in obesity and primarily due to the nonfat cells. Vitamins and Hormones. 74, 443-477 (2006).
- Ibrahim, M. M.
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재인쇄 및 허가
