니코티아나 벤타미안나에서 과도하게 표현된 IgG 융합 단백질의 생산

요약

우리는 니코티아나 벤타미안에서GFP에 융합된 재조합 인간 IgG의 발현, 추출 및 정제를 위한 간단한 방법을 여기에서 설명한다. 이 프로토콜은 열 크로마토그래피를 활용하는 수많은 단백질의 정제 및 시각화로 확장될 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 직접 및 가상 대학 교육 실험실에 적용되어 프로젝트 기반 탐사를 제공합니다.

초록

다양한 전염성, 대사, 자가면역, 신플라스틱 및 기타 질병에 대한 치료 개입으로서 항체에 대한 수요가 높아지면서 재조합 항체 생산을 위한 효율적인 방법을 개발할 필요성이 증가하고 있다. 2019년 현재, FDA승인 단일클론 항체가 70개 이상 있었으며 기하급수적인 성장 잠재력이 있습니다. 그들의 약속에도 불구하고, 광범위한 사용에 대한 제한 요인은 제조 비용과 복잡성입니다. 잠재적으로 식물은 저비용, 안전하며 쉽게 확장 가능한 단백질 제조 전략을 제공합니다. 니코티아나 벤타미안과 같은 식물은 복잡한 포유류 단백질을 올바르게 접고 조립할 수 없을 뿐만 아니라 포유류 세포 배양에서 제공하는 것과 유사한 중요한 번역 후 수정을 추가할 수 있습니다. 본 작품에서는, 인간 단일클론 항체에 융합된 녹색 형광 단백질(GFP)의 원종 GFP 및 산안정변체를 사용하여, 우리는 N. 벤타미안 식물로부터 의 전체 과도 항체 발현 및 정화 과정을 시각화할 수 있었다. 실험의 목적에 따라 네이티브 GFP 융합은 식물의 발현 단계에서 쉽게 시각화할 수 있으며, 산안정성 GFP 융합은 다운스트림 처리 중에 시각화를 가능하게 합니다. 이 확장 가능하고 간단한 절차는 몇 가지 작은 식물을 사용하여 며칠 만에 고도로 순수한 항체 또는 항체 융합 단백질의 밀리그램 양을 생산하는 단일 연구원에 의해 수행 될 수있다. 이러한 기술은 식물 및 기타 발현 시스템에서 모든 유형의 항체 정제 공정 및 잠재적으로 많은 다른 단백질의 시각화로 확장될 수 있다. 또한, 이러한 기술은 가상 지침에 도움이 될 수 있으며 분자 생물학 기술에 대한 최소한의 사전 경험을 가진 학부 생에 의해 교육 실험실에서 실행될 수 있으며, 실제 응용 프로그램과 프로젝트 기반 탐사를위한 토대를 제공합니다.

서론

업계 보고서에 따르면 미국에서 가장 많이 매출을 기록한 20개 중 13개 약물은 생물학적 제제(단백질 기반 의약품)였으며, 그 중 9개가 항체였습니다. 2019년 현재, 다양한 임상 개발^상에서570개 이상의 항체(Ab) 치료제가^{1,2,3하였다.} 현재 글로벌 Ab 매출은 1,000억 달러를 초과하며, 단일클론 Ab(mAb) 치료제 시장은 2025년^1,4년까지최대 3,000억 달러를 창출할 것으로 예상됩니다. 이러한 높은 수요와 예상 된 수익 증가로, 연구원은 더 높은 품질과 낮은 비용으로, 그 어느 때보 다 큰 규모로 Ab 치료제를 생산하는 방법을 개발하기 위해 노력하고있다. 식물계 발현 시스템은 Ab 치료제^5,6의저렴하고 대규모 제조를 위해 전통적인 포유류 세포주보다 몇 가지 장점이 있다. 식물에서 단백질 치료제의 생산("분자 파밍")은 전통적인 포유류 세포 배양^기술7,

프로토콜

1. N. 벤타미안 식물 을 재배

1. 토양 토탄 펠릿을 트레이에 놓고 이전에 삶은, 여전히 뜨거운 (~ 40-45 °C), 전체 확장을위한 토탄 펠릿 위에 물을 부어. 펠릿이 완전히 확장된 후 핀셋을 사용하여 각 토탄 펠릿에 2-3 N. 벤타미안 씨앗을 놓습니다.
2. 트레이의 바닥을 덮기 위해 물 에서 약 0.5를 붓습니다. 트레이에 시드 날짜로 레이블을 지정합니다. 매일 모종에 적절한 양의 비료로 물을 계속 합니다. 비료(수용성 다목적 식물 식품) 농도는 일반적으로 2.5-2.8g/L이다.
3. 성장 챔버에 놓을 때 휴미돔 상의로 트레이를 덮습니다. 16h 포토기간과 60% 상대 습도를 가진 23-25°C의 성장 챔버에 시드 토탄 펠릿을 보관하십시오.
4. 1 주일 후, 한 모종으로 각 펠릿을 떠나 여분의 식물을 제거합니다.
5. 식물이 2-3 주 오래되면 각 토탄 펠릿을 수분 제어 토양을 포함하는 개별 냄비로 옮기십시오. 이 데모는 기적-그로 수분 제어 포팅 토양을 사용했습니다.
6. 매일 1 g/L 비료로 물을 섭취하십시오. 토양을 완전히 건조하게 두지 마십시오. 식물은 5-6 주 된 때 침투 할 준비가되어 있습니다....

결과

이 연구는 재조합 단백질을 생성하고 다운스트림 프로세스 전반에 걸쳐 시각화하는 쉽고 빠른 방법을 보여줍니다. N. 벤타미안을 사용하고 제공된 프로토콜을 따르고, 여기에 설명된 재조합 단백질 생산은 1주일 이내에 달성될 수 있다. 식물 발현, 추출 및 정제의 전체 워크플로우가 도 1에표시됩니다. 2주 된 묘목, 4주 된 식물, 6주 된 식물의 식물 성장 단계는 각각 도 1A(1-3)에 표시되며, 도 1B는 괴사(그림 1B-1)또는 클로로시스(그림 1B-2)로인한 잎 형태학적 변화를 묘사한다. 괴사는 침윤 후 3-5 일 사이에 주사 부위에서 발생할 수 있습니다. .......

토론

이러한 프로토콜은 N. 벤타미안 식물에서 생산되는 임의의 재조합 Ab 또는 재조합 단백질의 시각적 검증을 위해 활용될 수 있으며, 여기에는 열 정화^{목적42,43,44에}대한 산성 환경에 일시적으로 노출이 필요한 단백질이 포함된다. 더욱이, 다른 발현 시스템에서 다른 단백질에 asGFP의 융합은 실험적인 시각화 및 교육을 위한 유용한 도구가 될 수 있다. 본 원에서 프로토콜은 재조합 단백질의 원하는 양을 생성하기 위해 더 크고 적은 양의 잎 물질로 확장될 수 있다. 설명된 방법은 산성 조건 하에서 안정적으로 유지되는 GFP의 버전을 확인하고 만든 이전 연구를^활용(46). 포괄적인 사전 연구는 관심있는 단백질에 융합된 면역글로불린 도메인을 만들었습니다, 수시로 이 프로토콜은^{또한 .......}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5mL 주사기		N/A
50mL 주사기	N	/A
Agar	SIGMA-ALDRICH	A5306
블렌더(컵 포함		N/A
브로모페놀 블루	Bio-Rad	1610404
DTT(DL-Dithiothreitol)	MP BIOMEDICALS	219482101
EDTA( 에틸렌 디니트릴로) 테트라 아세트산	SIGMA-ALDRICH	E-6760
에탄올	N	/ A
글리세롤	G-Biosciences	BTNM-0037
글리신	SIGMA-ALDRICH	G7126-500G
HCl (염산)	EMD MILLIPORE CORPORATION	HX0603-4
가열 블록 평판이	좋은 공급 업체	N/A
Jiffy-7 727 w/hole 이탄 펠릿	Hummert International	14237000
Kanamycin	Gold Biotechnology Inc	K-120-100
KCl (염화칼륨)	SIGMA-ALDRICH	P9541-500G
KH2PO4 (인산칼륨)	J.t.baker	3248-05
KOH (수산화칼륨)	VWR	BDH0262
황산 마그네슘 헵타 하이드레이트	SIGMA-ALDRICH	M2773
MES (2- (N- 모르 폴리노) 에탄 술폰산)	SIGMA-ALDRICH	M8250
Miracloth	Millipore	4 75855-1R
수분 조절 포팅 믹스	Miracle-Gro	755783
Na2HPO4 (인산 나트륨)	J.t.baker	3827-01
NaCl (염화나트륨	) Santa Cruz Biotechnology	sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds	평판이 좋은 공급	업체 N / A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)	G-Biosciences	786-787
폴리 프로필렌 컬럼	: 모든	N / A
정밀 플러스 단백질 이중 색상 표준	Bio-Rad	1610394
단백질 G 수지	Thermo Fisher Scientific	20399
Rifampicin	Gold Biotechnology Inc	R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	G-Biosciences	DG093
Sodium Ascorbate	SIGMA-ALDRICH	A7631-500G
분광 광도계	평판이 좋은 공급 업체	없음
Titan3 0.75 &마이크로; m 유리 섬유 필터	ThermoScientific	40725-GM
트레이 돔이있는 이탄 펠릿	모든	N / A
TRIS 베이스	J.t.baker	4109-02
Tris-HCl	Amresco	M108-1KG
트립톤	SIGMA-ALDRICH	17221
UV 램프	모든	N / A
수용성 다목적 식물성 식품	Miracle-Gro	2000992
효모 추출물	SIGMA-ALDRICH	9182

)