이 실험 프로토콜은 BCSC 표현형 및 기능을 평가하는 데 사용할 수 있는 시험 관 내 및 생체 내 분석뿐만 아니라 유방암 세포 및 조직 샘플에서 BCSC의 분리를 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
유방암 줄기 세포 (BCSC)는 유전 또는 후천성 줄기 세포와 유사한 특성을 가진 암세포입니다. 낮은 빈도에도 불구하고 유방암 시작, 재발, 전이 및 치료 저항의 주요 원인입니다. 유방암 치료를위한 새로운 치료 표적을 식별하기 위해서는 유방암 줄기 세포의 생물학을 이해하는 것이 필수적입니다. 유방암 줄기 세포는 CD44, CD24와 같은 독특한 세포 표면 마커의 발현 및 알데히드 탈수소 효소 (ALDH)의 효소 활성을 기반으로 분리 및 특성화됩니다. 이러한 ALDH높은CD44+CD24- 세포는 BCSC 집단을 구성하며 다운스트림 기능 연구를 위한 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 분리될 수 있습니다. 과학적 질문에 따라 BCSC의 기능적 특성을 평가하기 위해 다양한 시험관 내 및 생체 내 방법을 사용할 수 있습니다. 여기에서는 유방암 환자의 이질적인 유방암 집단과 원발성 종양 조직 모두에서 인간 BCSC를 분리하기 위한 상세한 실험 프로토콜을 제공합니다. 또한 BCSC 기능을 평가하는 데 사용할 수 있는 콜로니 형성 분석, 유방권 분석, 3D 배양 모델 및 종양 이종이식 분석을 포함한 다운스트림 시험관 내 및 생체 내 기능 분석을 강조합니다.
서론
인간 유방암 줄기 세포 (BCSC)의 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 것은 유방암 치료에서 직면하는 문제를 해결하는 데 중요합니다. BCSC 개념의 출현은 21세기 초로 거슬러 올라가며, CD44+CD24-/저유방암 세포의 작은 집단이 마우스 1,2에서 이질적인 종양을 생성할 수 있는 것으로 밝혀졌습니다. 그 후, 알데히드 탈수소 효소 (ALDHhigh)의 높은 효소 활성을 갖는 인간 유방암 세포도 유사한 줄기 세포 유사 특성을 나타내는 것으로 관찰되었다3. 이러한 BCSC는자가 재생 및 분화가 가능한 작은 세포 집단을 나타내며 벌크 종양 1,2,3의 이질성에 기여합니다. 축적 된 증거는 진화 적으로 보존 된 신호 전달 경로의 변화가 BCSC 생존 및 유지를 유도한다는 것을 시사합니다 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14
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프로토콜
동의한 유방암 환자로부터 직접 환자 유래 수술 또는 생검 샘플의 수집은 기관 윤리 위원회가 승인한 승인된 인간 윤리 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 환자 유래 이종이식 모델을 생성하는데 사용된 모든 마우스는 유지되고 기관 승인 동물 시설에 수용되었다. 마우스를 사용한 환자 유래 이종이식 모델로부터의 종양 조직은 기관 동물 관리 위원회에 의해 승인된 승인된 윤리 프로토콜에 따라 생성되었다.
1. 세포주의 제조
- 생물안전 캐비닛의 멸균 조건에서 모든 세포 배양 및 염색 절차를 수행합니다. 멸균 세포 배양 접시/플라스크 및 시약을 사용하십시오.
- 인간 유방암 세포를 태아 소 혈청(FBS) 및 각 세포주에 특이적인 필요한 성장 인자로 보충된 정의된 배지에서 5%CO2 로 37°C에서 유지합니다.
- 마우스 NIH3T3 섬유아세포 배양물(콜로니 형성 분석에 사용)을 10% FBS가 보충된 둘베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)에서 5%CO2 로 37°C에서 유지합니다.
- 모든 문화권에서 2-3 일마다 오래된 미디어를 신선한 미디어로 보충하십시오. 배양이 75-80% 컨플루언스에 도달하면 여러 멸균 세포 배양 플라스크로 계대 배양합니다.
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결과
설명 된 프로토콜은 세포주 또는 해리 된 종양 조직으로부터 유방암 세포의 이질적인 집단으로부터 인간 BCSC의 분리를 허용한다. 주어진 세포주 또는 조직 샘플에 대해, 특히 연구 목적이 BCSC를 표적으로 하는 치료제의 효능을 평가하는 것이라면 오염된 비 BCSC 집단이 다양한 세포 반응을 유발할 수 있으므로 BCSC를 최대 순도로 분리하기 위해 균일한 단일 세포 현탁액을 생성하는 것이 중요합니다. 엄격한 분류 전략을 적용하면 오염된 비 BCSC의 존재를 최소화하고 유방암 세포의 비율을 수집할 수 있습니다. 암세포의 대량 집단과 구별되는 세포 표현형을 나타내는 줄기 세포와 같은 특성을 가지고 있습니다. 향상된 ALDH 효소 활성을 나타내고, 높은 수준의 세포 표면 마커 CD44를 발현하고, CD24의 낮은/음성 발현을 나타내는 인간 유방암 세포는 ALDH높은CD44+CD24-표현형을 가지며 BCSC로 분류될 수 있습니다. 벌크 집단 내에서 BCSC의 비율은 세포주 또는 .......
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토론
유방암 전이와 치료에 대한 내성은 전 세계 여성의 주요 사망 원인이되었습니다. 유방암 줄기 세포 (BCSC)의 하위 집단의 존재는 전이 26,43,44,45,46 및 치료 내성 21,47,48의 향상에 기여합니다. 따라서 향후 치료의 초점은 더 나은 치료 결과를 달성하기 위해 BCSC를 근절하는 것을 목표로 해야 하며, 이를 위해서는 시험관 내 및 생체 내 방법을 모두 사용하여 BCSC의 기능적 특성을 분리하고 특성화하는 정확한 방법이 필요합니.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
유용한 토론과 지원에 대해 실험실 구성원들에게 감사드립니다. 유방암 줄기 세포와 종양 미세 환경에 대한 우리의 연구는 캐나다 암 연구 학회 연구소와 미 육군 국방부 유방암 프로그램 (보조금 # BC160912)의 보조금으로 지원됩니다. VB는 Western Postdoctoral Fellowship (Western University)의 지원을 받고 있으며 ALA와 VB는 모두 캐나다 유방암 학회의 지원을 받고 있습니다. CL은 캐나다 정부의 Vanier Canada 대학원 장학금으로 지원됩니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 7-Aminoactinomycin D (7AAD) | BD | 51-68981E | 제안: 0.25 &마이크로; g/1x106 세포 |
| Acetone | Fisher | A18-1 | |
| 알데히드 탈수소효소(ALDH) 기질 | Stemcell Technologies | 1700 | ALDEFLOUR 분석 키트의 일부로 상업적으로 판매; ALDH 기질 준비에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오 |
| 기저막 추출물(BME) | Corning | 354234 | Matrigel |
| 이라는 상품명으로 판매됩니다.세포 배양 플레이트: 6웰 | Corning | 877218 | |
| 세포 배양 플레이트: 60mm | Corning | 353002 | |
| 세포 배양 플레이트: 96웰 초저 부착 | Corning | 3474 | |
| 세포 여과기: 40 미크론 | BD | 352340 | |
| Collagen | Stemcell Technologies | 7001 | PBS에서 3 mg/mL 콜라겐의 1:30 희석 준비 |
| 콜라겐 분해 효소 | 시그마 | 11088807001 | 1x |
| 원뿔형 튜브 : 50 mL | Fisher scientific | 05-539-7 | |
| 크리스탈 바이올렛 | 시그마 | C6158 | 염색을 위해 물에 0.05 % 크리스탈 바이올렛 용액 사용 |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7913 | 5U/mL |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | 1x, L-글루타민 및 15 mM HEPES 포함 |
| DNAse | Sigma | D5052 | 0.1 mg/mL 최종 농도 |
| FBS | Avantor Seradigm Lifescience | 97068-085 | |
| Flow 튜브: 5ml | BD | 352063 | 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브 |
| 메탄올 | Fisher | 84124 | |
| 마우스 anti-Human CD24 항체 | BD | 561646 | R-phycoerythrin 및 Cyanine 염료 접합 클론: ML5 |
| 마우스 anti-Human CD44 항체 | BD | 555479 | R-phycoerythrin conjugated, 클론: G44-26 |
| N, N-디에틸아미노벤즈알데히드 (DEAB) | Stemcell Technologies | 1700 | ALDEFLOUR 분석 키트의 일부로 상업적으로 판매; 제조사의 지시를 따르십시오. DEAB 준비 |
| PBS | Wisent Inc | 311-425-CL | 1x, 칼슘 및 마그네슘 없음 |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Mammosphere Media 구성 | |||
| B27 | Gibco | 17504-44 | 1x |
| bFGF | Sigma | F2006 | 10 ng/mL |
| BSA | Bioshop | ALB003 | 04% |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | 1x, L-글루타민 및 15 mM HEPES |
| EGF | SIGMA | E9644 | 20 ng/mL |
| 인슐린 | 시그마 | 16634 | 5 &마이크로; g/mL |
| 3D 오가노이드 배지 조성 | |||
| A8301 | Tocris | 2939 | 500 nM |
| B27 | Gibco | 17504-44 | 1x |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | 1x, L-글루타민 및 15mM HEPES |
| EGF | 시그마 | E9644 | 5ng/mL |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | 1x |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 10 mM |
| N-acetylcysteine | Sigma | A9165 | 1.25 mM |
| Neuregulin β 1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| 니코틴아미드 | 시그마 | N0636 | 5 mM |
| Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
| R-spondin3 | R& D | 3500 | 250ng/mL |
| SB202190 | Sigma | S7067 | 500nM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 &마이크로; 미디엄 |
참고문헌
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Shipitsin, M., et al.
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