우리는 질량 광합성(MP)을 사용하여 항원-항체 친화성 측정에 대한 단일 분자 접근법을 기술합니다. MP 기반 프로토콜은 빠르고 정확하며 매우 적은 양의 재료를 사용하며 단백질 변형이 필요하지 않습니다.
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이 논문에서
요약
초록
항원-항체 상호 작용의 특이성 및 친화성의 측정은 의학 및 연구 응용 분야에서 매우 중요합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 이 목적을 위해 새로운 단 하나 분자 기술, 질량 광측정법 (MP)의 구현을 설명합니다. MP는 단일 분자 수준에서 항체 및 항원 항체 복합체의 분자 질량 및 인구를 감지하고 정량화하는 라벨 및 고정되지 않은 기술입니다. MP는 몇 분 안에 항원 항체 샘플을 분석하여 결합 친화성의 정확한 측정을 허용하고 동시에 단백질의 스토이치오메트리 및 올리고메릭 상태에 대한 정보를 제공한다. 이것은 단백질의 피코몰 양과 고가의 소모품만을 필요로 하는 간단하고 간단한 기술입니다. 동일한 절차는 50 kDa보다 큰 분자 질량을 가진 단백질을 위한 단백질 단백질 결합을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 다발성 단백질 상호 작용을 위해, 다중 결합 부위의 친화력은 단일 측정에서 얻을 수 있다. 그러나 단일 분자 측정 모드와 라벨링부족은 몇 가지 실험적 한계를 가중시합니다. 이 방법은 서브 마이크로몰라 상호 작용 친화성, 20 kDa 이상의 분자 질량을 가진 항원 및 상대적으로 순수한 단백질 샘플의 측정에 적용될 때 최상의 결과를 제공합니다. 또한 기본 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 필요한 피팅 및 계산 단계를 수행하는 절차에 대해서도 설명합니다.
서론
항체는 분자 생물학의 유비쿼터스 공구가 되고 의학 및 연구 응용 둘 다에서 광범위하게 이용됩니다. 의학에서는 진단에서 매우 중요하지만 치료 응용 분야도 확장되고 있으며 새로운 항체 기반 치료법은지속적으로 1,2,3,4로개발되고 있습니다. 항체의 과학적 적용은 면역형성5,면역 절전6, 유동 세포측정법7,ELISA 및 서부 블로팅과 같은 많은 필수 불가결한 실험실 기술을 포함한다. 이러한 각 응용 분야에 대해 결합 친화성 및 특이성을 포함한 항체의 결합 특성의 정확한 측정을 얻는 것이 매우 중요합니다.
1990년 최초의 상업용 표면 플라스몬 공명(SPR) 기기가 도입된 이래, 광학 바이오센서는 항체 특성화의 "금본위제"가 되었지만, ELISA를 포함한 다른 기술도 항체 친화성8,9를측정하는....
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프로토콜
1. 유동 챔버 준비
- 유리 커버립 청소
- 증류수, 에탄올, 이소프로판올이 있는 워시 병을 사용하여 물, 에탄올, 물, 이소프로판올, 물 등 24mm x 50mm 커버립을 다음 순서로 헹구세요. 깨끗한 질소의 스트림으로 커버립을 건조. 커버스립을 위에서 아래로 헹구고 하단 모서리를 부드러운 팁으로 잡고 헹구는 것이 중요합니다. 집게(도2A)로부터오염을 이송하지 않도록 커버슬립을 같은 방향으로 건조시다.
- 마찬가지로 증류수, 에탄올 및 증류수로 24mm x 24mm 커버립을 헹구는 것과 유사하게 헹구습니다. 깨끗한 질소의 스트림으로 커버립을 건조.
- 커버슬립의 작동 면을 식별하고, 깨끗한 커버슬립 표면에 증류수 한 방울을 놓고 프로토콜의 3.1-3.2 단계를 따릅니다. 일반적으로 24mm x 50mm 커버슬립의 한쪽면만이 MP 측정에 적합한 광학 품질을 가지고 있습니다.
참고: 집중 후, 중요한 표면 결함을 감지할 수 없으며 데이터 수집 소프트웨어에 표시된 "신호" 값은 0.05% 미만이어야합니다(그림 1A-C). 상자의 모든 커버립의 작동 면은 동일한 방향으로 지향됩니다. 동일한 절차를 ....
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결과
우리는 이전에 MP 기반분석(11)을사용하여 인간 α-혈전(HT) 및 마우스 단일클론 항인간 혈전 항체(AHT)의 상호작용을 조사하였다. HT(37 kDa)의 분자 질량은 40kDa 검출 한계 이하이기 때문에, 질량 분포의 분해능에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 최대 시료 농도가 50nM MP 농도 제한을 초과할 수 있다. 이 실험은 고정된 25nM 농도에서 AHT 항체를 장착한 적정계로 계획되었으며, HT는 7.5nM, 15nM, 30nM, 60nM 및 120nM의 농도로 계획되었다. 도 3은 항원-항체 혼합물 및 항체 전용 샘플의 분자 질량 분포를 나타낸다. 여기서 는 프로토콜에 기재된 방법을 사용하여 데이터를 분석합니다. 과학 적인 그래프 소프트웨어는 무료 AHT를 나타내는 세 가지 가우시안 구성 요소와 대량 분포를 맞게 사용 되었다, AHT· HT 및 AHT: HT2. 3개의 성분의 공지된 분자 질량 값이.......
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토론
여기에 설명된 질량 광측정 기반 프로토콜은 항원-항체 결합 친화성을 측정하는 빠르고 정확한 방법을 제공한다. MP 분석은 매우 적은 양의 물질을 사용하며, 스토이치오메트리, 올리고머화 및 순도를 포함한 추가 정보는 동일한데이터(그림 5)로부터평가될 수 있다. 수정없이, 이 방법은 약 5 nM에서 500 nM 범위의 해리 상수의 측정에 적용되며, 약 20 kDa 이상의 분자 질량을 가진 리간드 분자의 경우. 동일한 프로토콜은 항원-항체 결합을 분석할 뿐만 아니라, 적어도 하나의 결합 파트너의 분자 질량이 50kDa보다 클 때 단백질-단백질 상호 작용 친화성을 측정하는 데 사용될 수 있다. MP 검출은 비특이적이기 때문에, MP 측정은 고농도의 담체 단백질 또는 큰 분자 질량 불순물을 포함하는 견본에서 수행될 수 없습니다.
SPR은 일반적으로 항원-항체 결합의 특성화에 사용되며, 두 방법의 직접 비교는 분석 선택에 도움이 될 수 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 원고의 그의 비판적 독서에 대한 키어 노이만 감사합니다. 이 작품은 NHLBI, NIH의 교내 프로그램에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| AcquireMP | Refeyn | MP 데이터 수집 소프트웨어 | |
| 안티 휴먼 트롬빈 | 혈액 기술 | AHT-5020 | RRID: AB_2864302 |
| 면 팁 애플리케이터 | Thorlabs | CTA10 | 면 광학 면봉 |
| 슬립 24x24mm | Globe Scientific | 1405-10 | |
| 커버슬립 24x50mm | 피셔 Scientific | 12-544-EP | |
| DiscoverMP | Refeyn | MP 데이터 처리 소프트웨어 | |
| 겸자 | 전자 현미경 과학 | 78080-CF | 커버슬립 처리용 소프트 팁 겸자 |
| 인간 &알파;-트롬빈 | 혈액학 기술 | HCT-0020 | |
| 침수 오일 | Thorlabs | MOIL-30 | |
| 이소프로판올 | Alfa Aesar | 36644 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | 스프레드시트 | |
| OneMP | Refeyn | 질량 측광 기기 | |
| Origin | OriginLab | 과학 그래프 소프트웨어 | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | 10x |
| 재고 주사기 필터 | Millipore | SLGSR33SS | 버퍼 및 샘플 필터링 |
참고문헌
- Francis, R. J., et al. A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours. British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).
- van Dyck, C. H.
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재인쇄 및 허가
