방법 논문

조직 샘플의 질량 분광계 기반 산탄총 프로테오믹스의 포괄적인 워크플로우

DOI:

10.3791/61786

⸱

2021년 11월 13일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Bombay

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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설명된 프로토콜은 라벨 기반 및 라벨 자유 양수의 두 가지 접근법을 사용하여 조직 샘플의 최적화된 정량 적 프로테오믹스 분석을 제공합니다. 라벨 기반 접근법은 단백질의 보다 정확한 양을 얻을 수 있는 장점이 있으며, 라벨없는 접근법은 비용 효율적이며 코호트의 수백 가지 샘플을 분석하는 데 사용됩니다.

초록

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질량 분석의 최근 발전은 강력하고 재현 가능한 데이터 세트의 생성과 함께 깊은 프로테오믹 분석을 초래했습니다. 그러나 상당한 기술적 진보에도 불구하고 환자 혈액, CSF 및 조직과 같은 생체 표본의 샘플 준비는 여전히 상당한 어려움을 겪고 있습니다. 바이오마커를 식별하기 위해 조직 프로테오믹스는 종종 벤치에서 클리닉으로 연구 결과를 번역하는 매력적인 샘플 소스를 제공합니다. 알츠하이머병, 파킨슨병 등과 같은 암 및 신경퇴행성 질환의 조기 진단을 위한 잠재적인 후보바이오마커를 공개할 수 있다. 조직 proteomics는 또한 단백질의 풍부에 근거를 둔 전신 정보의 부를 산출하고 흥미로운 생물학 질문을 해결하는 것을 돕습니다.

정량적 프로테오믹스 분석은 라벨 기반 및 라벨 이없는 접근 방식의 두 가지 광범위한 범주로 그룹화될 수 있습니다. 라벨 기반 접근법에서 단백질 또는 펩타이드는 SILAC(세포 배양에서 아미노산을 가진 안정적인 동위원소 라벨) 또는 ICAT(동위원소 코딩 친화성 태그), TMT(동위원소 코딩 친화성 태그), TMT(동위원소 대칭 대칭 태그) 또는 iTRAQ(상대및 절대수량에 대한 isobaric tag)와 같은 화학 적 태그로 분류됩니다. 라벨 기반 접근법은 단백질의 보다 정확한 양과 동소바릭 라벨을 사용하는 장점이 있으며, 여러 샘플을 단일 실험에서 분석할 수 있다. 라벨없는 접근 방식은 라벨 기반 접근 방식에 대한 비용 효율적인 대안을 제공합니다. 특정 코호트에 속하는 수백 개의 환자 샘플을 분석하고 임상 적 특징에 따라 다른 코호트와 비교할 수 있습니다. 여기서는 생명 과학, 특히 바이오마커 발견 기반 프로젝트에서 중요한 라벨 프리 및 라벨 기반 프로테오메 프로파일링 방법을 사용하여 조직 샘플에 최적화된 정량적 프로테오믹스 워크플로우를 설명했습니다.

서론

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프로테오믹스 기술은 질병1의검출 및 예후에 도움을 줄 수 있는 잠재적 후보 마커의 식별 및 정량화를 가능하게 할 가능성이 있다. 질량 분석 분야의 최근 발전은 단백질 수준에서 임상 연구를 가속화했습니다. 연구원은 지금 단백질 식별 및 정량화2를위한 증가한 감도를 제공하는 질량 분광법 기지를 둔 proteomics를 사용하여 몇몇 질병의 복잡한 병리학의 도전을 해결하기 위하여 노력하고 있습니다. 단백질의 정확한 정량적 측정은 건강하고 병들인 개별에 있는 단백질 중 동적 및 공간 협력을 이해하기 위하여 중요합니다3; 그러나, 프로테오메 전체 규모에 대한 이러한 분석은 쉽지 않다.

임상 표본의 프로테오믹 프로파일링의 한 가지 주요 제한사항은 생물학적 샘플의 복잡성입니다. 많은 상이한 유형의 샘플은 세포주, 혈장 및 조직4,5와같은 질병 프로테아움을 연구하기 위해 조사되었다. 세포주 널리 질병 진행의 다른 단계를 모방 하는 체 외 실험에서 모델로 사용 됩니다. 그러나, 세포주를 가진 한 가지 주요 제한은....

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프로토콜

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이 연구는 기관 검토 위원회와 인도 기술 봄베이 연구소의 윤리위원회 (IITB-IEC/2016/026)에 의해 검토및 승인되었습니다. 환자/참가자는 이 연구에 참여하기 위해 서면 동의를 제공했습니다.

1. 조직 리자테 준비

참고: 얼음에서 다음 단계를 모두 수행하여 프로테아제의 비활성 상태를 유지합니다. 메스와 사용된 모든 튜브가 오염을 피하기 위해 멸균되었는지 확인하십시오.

  1. 구슬 박동 튜브에 조직의 ~ 30 mg을 가지고, 1 x 인산염 완충식 염수 (PBS)의 200 μL을 추가하고 소용돌이.
    참고 : 이 연구에서, 신선한 냉동 인간의 뇌 종양 조직은 lysate 준비를 위해 촬영되었다. 프로토콜은 조직의 모형 (연약한 또는 단단한 조직) 및 조직의 세포 복잡성에 따라서 어떤 변경든지 신선한 동결된 조직에 이용될 수 있습니다.
  2. 그 후, 조직을 정착하고 조심스럽게 파이펫을 사용하여 PBS를 제거하기 위해 튜브를 회전. 조직에 남아있는 혈액의 흔적이 여전히있는 경우 다른 PBS 세척을 수행.
  3. 제조 업체의 프로토콜에 따라 300 μL 의 요소 용해 버퍼 (8 M urea, 50 mTris pH 8.0, 75....

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결과

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우리는 발견 프로테오믹스에 대한 두 가지 접근 방식을 사용했습니다: 라벨이 없는 및 라벨 기반 프로테오믹스 접근법. SDS-PAGE에서 조직 샘플의 단백질 프로파일은 그대로 단백질을 나타내고 프로테오믹분석(도 2A)을고려할 수 있었다. 계측기의 품질 관리 검사는 시스템 적합성 소프트웨어를 통해 모니터링되었으며 계측기 성능(도2B)의일별 변화를 보여 주었다. LC 그라데이션(도2C)의30분에서 BSA 샘플의 91% 시퀀스 커버리지를 관찰했습니다. LC 그라데이션은 상업용 HeLa 세포 다이제스트의 500 ng를 사용하여 최적화되었으며, 1h 그라데이션(도2D)에서1488단백질과 비교하여 2시간 그라데이션에서 2425개의 단백질을 관찰하였다. 우리는 풀 조직 샘플(그림.......

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토론

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생물학적 샘플의 조직 프로테오믹스는 질병 진행의 다른 단계와 관련된 새로운 잠재적인 바이오마커를 탐구할 수 있게 해줍니다. 그것은 또한 질병 진행과 관련 되 었던 신호 및 통로의 메커니즘을 설명합니다. 조직 정량 적 프로테오믹스 분석을 위한 기술된 프로토콜은 재현 가능한 양호한 커버리지 데이터를 제공한다. 대부분의 단계는 제조업체의 지침에서 적용되었습니다. 고품질 데이터를 얻기 위해 다음 단계가 가장 중요합니다. 따라서 이러한 단계를 수행하는 동안 추가주의를 기울여야합니다.

단백질의 불완전한 소화 및 각질의 오염은 단백질의 더 적은 엄호를 제공할 수 있습니다 (n < 1000), 따라서 전반적인 실험에 영향을 미치는. 샘플(pH 8)과 샘플(1M 미만)의 요소 농도의 pH는 단백질의 효율적인 소화를 보장합니다. 신선한 버퍼를 사용하고 주의를 기울여 시료를 취급하면 케라틴 오염의 가능성이 줄어듭니다. iTRAQ 시약은 매우 비용이 많이 들며 데이터를 분석하기 위해 MS/MS 및 소.......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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우리는 MHRD-UAY 프로젝트 (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), 생명 공학부 (BT / PR13114 / INF / 22/206/2015)가 지원하는 IIT 봄베이의 SS 및 MASSFIITB 시설에 대한 프로젝트 #34_IITB 모든 MS 관련 실험을 수행하도록 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Reagents
Acetonitrile (MS grade)Fisher ScientificA/0620/21
Bovine Serum AlbuminHiMediaTC194-25G
염화칼슘Fischer ScienificBP510-500
Formic acid (MS grade)Fisher Scientific147930250
요오드 아세트아미드시그마1149-25G
이소프로판올(MS 등급)Fisher ScientificQ13827
염화마그네슘피셔 ScienificBP214-500
메탄올(MS 등급)Fisher ScientificA456-4
MS 등급 물피어스51140
인산염 버퍼 식염수HiMediaTL1006-500ML
프로테아제 억제제 칵테일Roche Diagnostics11873580001
염화나트륨MerckDF6D661300
TCEPSigma646547
Tris BaseMerck648310
Trypsin (MS grade)Pierce90058
Bradford 시약Bio-Rad
UreaMerckMB1D691237
Supplies
Hypersil Gold C18 columnThermo25002-102130
마이크로피펫GilsonF167380
스테이지 팁MilliPoreZTC18M008
지르코니아/실리카 비드BioSpec 제품11079110z
Equipment
Bead beater (Homogeniser)Bertin MinilysP000673-MLYS0-A
Microplate reader (spectrophotometer)ThermoMultiSkan Go
pH meterEutechCyberScan pH 510
Probe SonicatorSonics Materials, IncVCX 130
쉐이킹 드라이배써모88880028
Orbitrap Fusion 질량 분석기ThermoFSN 10452
Nano LCThermoEASY-nLC1200
진공 농축기ThermoSavant ISS 110
Software
Proteome DiscovererThrermo프로테옴 디스커버러 2.2.0.388
5000205스

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy. Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).
  2. Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A.

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재인쇄 및 허가

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